Estudo experimental de etossomos encapsulados com 5-fluorouracil combinados com laser fracionado de CO2 para tratar cicatriz hipertrófica

Resumo

Objetivo

Este estudo foi desenvolvido para explorar a permeabilidade de etossomos encapsulados com 5-florouracil (5-FU) mediado por CO ₂ laser fracionado em tecidos de cicatriz hipertrófica. Além disso, efeito terapêutico e de duração do CO ₂ laser fracionado combinado com etossomos encapsulados com 5-FU em modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho será avaliado.

Métodos

A quantidade permeada de 5-FU e o conteúdo de retenção de 5-FU foram ambos determinados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As intensidades de fluorescência de etossomos encapsulados com 5-FU (5E) marcados com Rodanmin 6GO (Rho) foram medidas por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A promoção da permeabilidade de 5E marcado com Rho em cicatriz hipertrófica de orelha de coelho mediada por CO ₂ O laser fracionado foi avaliado 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 dias e 7 dias após a irradiação. As taxas de abertura dos microcanais foram calculadas de acordo com CLSM. O efeito terapêutico do 5EL foi avaliado na cicatriz hipertrófica da orelha de coelho in vivo. A espessura relativa da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho antes e depois do tratamento foi medida pelo método do paquímetro. O índice de elevação da cicatriz (SEI) da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho foi medido usando coloração H&E.

Resultados

Os dados mostraram que a quantidade de penetração do grupo 5EL foi maior do que o grupo 5E (4,15 ± 2,22 vs. 0,73 ± 0,33; p <0,05) após tratamento de 1 hora. Além disso, a quantidade de penetração de 5EL foi maior do que a do grupo 5E (107,61 ± 13,27 vs. 20,73 ± 3,77; p <0,05) após tratamento de 24 horas. O conteúdo de retenção do grupo 5EL também mostrou nível mais alto do que o grupo 5E (24,42 ± 4,37 vs. 12,25 ± 1,64; p <0,05). A intensidade de fluorescência de Rho em tecidos de cicatriz hipertrófica do grupo 5EL foi maior do que a do grupo 5E em diferentes momentos (1, 6 e 24 h). As taxas de abertura dos microcanais diminuíram gradualmente em 24 h, e os microcanais foram fechados completamente 3 dias após a irradiação por CO ₂ laser fracionário. A espessura relativa e SEI da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho após 7 dias de tratamento no grupo 5EL foram significativamente menores do que no grupo 5E.

Conclusão

CO ₂ O laser fracionado combinado com 5E tópico pode ser eficaz no tratamento de cicatriz hipertrófica in vivo e fornecer um novo método de terapia para cicatriz hipertrófica humana.

Histórico

A cicatriz hipertrófica é uma condição cutânea caracterizada por depósitos de quantidades excessivas de colágeno que dá origem a uma cicatriz elevada, mas que não atinge o grau de queloide observado [1]. Um total de 100 milhões de pacientes desenvolveram cicatrizes em países desenvolvidos a cada ano, como resultado de 55 milhões de operações eletivas e 25 milhões de operações após traumas [2]. Após a operação cirúrgica, cerca de 60% dos pacientes desenvolveram cicatrizes hipertróficas no pós-operatório, geralmente durante os primeiros 3 meses. A maioria das cicatrizes hipertróficas ainda são hipertróficas 12 meses após as operações cirúrgicas [3]. Atualmente, os métodos de tratamento comuns incluem tratamentos cirúrgicos e não cirúrgicos. Pressão, radioterapia, quimioterapia e outros tratamentos cirúrgicos medicamentosos são os principais tratamentos terapêuticos. Até o momento, essas terapias não conseguiram atingir o efeito terapêutico desejado devido aos seus defeitos [4, 5]. A terapia medicamentosa é um dos tratamentos não cirúrgicos mais comuns da cicatriz patológica à pintura externa com base em injeções locais. Devido aos efeitos colaterais dos medicamentos, as injeções locais costumam ser limitadas ao tratamento em pequena escala e em baixas doses. Além disso, por causa da meia-vida curta do medicamento, as injeções locais do medicamento sempre falharam em manter altas concentrações duradouras na cicatriz; portanto, muitas vezes são necessárias injeções repetidas [6]. Considerando a densidade do tecido cicatricial e a dor intensa, a injeção geralmente não é aceitável para os pacientes. Apesar das vantagens, incluindo indolor, nenhum efeito colateral para o fígado e conveniente para uso externo de longo prazo [7, 8], os medicamentos não podiam entrar na cicatriz devido à estrutura organizacional especial das cicatrizes patológicas. Relatórios recentes também indicaram que a medicação tópica é difícil de penetrar no tecido cicatricial [9]. Portanto, o uso externo de drogas é limitado atualmente.

Os etossomos são um novo carreador lipídico utilizado por Touitou em 2000 [10], efetivo na liberação de medicamentos através da pele. O principal componente dos etossomos é o etanol, que pode alterar o arranjo firme das moléculas lipídicas da cutícula, aumentar a fluidez lipídica e promover a flexibilidade e mobilidade da membrana do lipossoma de etanol. O etanol dos etossomos também pode acelerar a deformação do estrato córneo e aumentar sua capacidade de transporte e penetração da droga através do estrato córneo desordenado na pele [11,12,13]. No entanto, sendo diferente do tecido cutâneo normal, o tecido cicatricial tem uma estrutura especial. Em nosso estudo anterior, demonstramos que os etossomos são um carreador altamente eficiente de fármacos em cicatrizes humanas [14]. É indispensável que o medicamento no tecido cicatricial não seja bem distribuído, mas diminuído significativamente de fora para dentro da pele. O fármaco se acumula principalmente na epiderme e na camada superficial da derme, mas não em todas as camadas da derme, o que diminui o efeito anti-cicatrizante.

A terapia a laser fracionada ablativa, uma tecnologia cosmética, é uma modalidade muito popular e amplamente aceita atualmente e usada principalmente para o tratamento clínico de rugas faciais, cicatrizes superficiais, distúrbios de pigmentação e melhoria da textura da pele [15,16,17]. Com base na teoria da fototermólise de matriz de pontos [18], o laser ablativo fracionado produz um arranjo semelhante a um feixe de laser minúsculo e rompe a barreira da pele criando canais microscópicos verticais ablativos cercados por uma zona de dano térmico, induzindo uma resposta de cicatrização de feridas à pele moderada aparência [19,20,21,22]. Foi relatado que a principal barreira da absorção percutânea do fármaco é o estrato córneo [23, 24]. Estudos recentes têm mostrado que, um dos laser fracionários ablativos clínicos mais comumente usados, CO ₂ o laser fracionado pode quebrar o estrato córneo e formar canais microporosos densos, minando assim a principal barreira de impedir a absorção percutânea do fármaco e dando boas perspectivas de promoção da penetração transdérmica do fármaco [25,26,27,28].

Neste estudo, exploramos CO ₂ Gel etossômico mediado por laser fracionário contendo o fármaco anti-cicatriz 5-florouracil (5-FU) em amostras de cicatrizes humanas e modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho. Usando essa nova abordagem, nos concentramos em melhorar a eficiência da administração de medicamentos anti-cicatrizes, a fim de encurtar o processo de tratamento de cicatrizes longas. Pela primeira vez, o modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho foi aplicado para determinar CO ₂ etossomos em nanoescala mediados por laser fracionário carregando 5-FU em cicatrizes hipertróficas e efeito de penetração de drogas. Juntos, foi sugerido que CO ₂ laser fracionado combinado com medicamento tópico fornece um novo método de terapia para cicatriz hipertrófica humana.

Métodos

Etossomos encapsulados 5-FU

O método de Touitou [10] foi usado como preparação para etossomos encapsulados em 5-FU. A distribuição do tamanho de partícula de 25 ° C e o índice de polidispersidade (PDI) foram determinados usando um analisador de tamanho de partícula a laser ( λ =632,8 nm). PDI <0,1 indica a distribuição uniforme de tamanho de partícula, e PDI> 0,3 sugere distribuição de tamanho de partícula não homogênea. A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi utilizada para a observação da morfologia dos etossomos. O método de ultracentrifugação [29] foi usado para medir a eficiência de encapsulação (EE) de etossomos neste estudo.

Cromatografia líquida de alto desempenho

A concentração de 5-FU no compartimento receptor das células de Franz foi determinada por um sistema de HPLC Waters 2695 (Meadows Instrumentation, Illinois) e detector ultravioleta 2487 com uma coluna Diamonsil TM C18 de fase reversa (250 mm × 4,6 mm, 5 μm ) 5-FU foi detectado em 265 nm com uma fase móvel de metanol – H ₂ O (5:95 v / v ) a uma taxa de fluxo de 1 ml / min. Os dados foram analisados ​​pela área do pico e pelo método padrão externo, usando um Waters Empower System.

Microscopia de varredura a laser confocal

O tecido da cicatriz hipertrófica humana foi analisado por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) em incrementos de 10 μm. A intensidade da fluorescência foi analisada usando um Microscópio de Varredura a Laser LSM 510 (Zeiss, Jena, Alemanha) com uma lente objetiva Fluar 10 ×, 0,5 abertura numérica. A excitação óptica foi realizada com um laser HeNe de 543 nm e a emissão de fluorescência foi detectada acima de 560 nm para a rodamina 6GO (Rho). As imagens foram analisadas por software de análise de imagem Release Version 4.0 SP2 para calcular a distribuição de fluorescência e a intensidade de fluorescência dos tecidos da cicatriz. Em 10 × 10 vezes o campo de visão, o tamanho e a distribuição dos valores dos pixels foram para determinar a faixa de penetração do 5-FU EG (marcado com Rho) e pelo método semiquantitativo.

Ensaio de permeabilidade de etossomos 5-FU em tecido cicatricial humano

As amostras de cicatriz hipertrófica humana do Hospital de Cirurgia Plástica Afiliado à Nona Pessoas da Universidade de Xangai Jiaotong são provenientes de excisão de cicatriz em pacientes com três casos, todas mulheres, com idades entre 21 e 35 anos; a cicatriz está localizada no ombro e nas costas; curso da cicatriz hipertrófica de 6 meses a 1 ano; integridade do tecido cicatricial; sem ulceração; sem lesões de infecção; e a cicatriz mais baixa também deve ser mais alta que a pele, e o paciente não recebeu nenhum tratamento desde a doença. A anestesia geral foi usada para eliminar o efeito dos anestésicos locais no tecido cicatricial. Os espécimes obtidos foram retirados imediatamente do tecido subcutâneo, protegidos da epiderme, confeccionados em uma espessura de 4,0 mm, em uma área de 3 cm × 3 cm amostras de tecido cicatricial, lavados com soro fisiológico em temperatura ambiente, secos com gaze seca úmida superficial, envoltos com folha de alumínio e conservado no frigorífico a - 20 ° C. O tecido cicatricial hipertrófico humano foi removido e armazenado em um freezer - 20 ° C antes do uso. Tecido cicatricial hipertrófico humano foi imerso em PBS pH 7,4 a 25 ° C por 2 h, e a água na superfície do tecido foi removida suavemente com gaze seca. Todas as regiões de tecido epidérmico de tecido cicatricial hipertrófico eram CO ₂ laser fracionado irradiado. Os parâmetros do laser são seguidos imediatamente pelo modo DeepFX, densidade de energia de 25 mj, cobertura de 20%, frequência de emissão de 300 Hz, no 10º tamanho de ponto e sem sobreposição. Todas as amostras irradiadas foram coletadas usando detecção por HPLC, para determinar o conteúdo de tecido cicatricial de 5-FU. As seções histopatológicas são imediatamente utilizadas para o ensaio CLSM.

Modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho

O método do modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho foi descrito resumidamente abaixo:12 coelhos brancos da Nova Zelândia, machos, e pesando 2 kg (SLAC, Shanghai) foram alojados separadamente por 2 semanas. Para a anestesia em coelhos, o lumianning foi misturado com 1,5 mg de cetamina por 100 g de peso por meio de injeção intramuscular. Todas as feridas foram circundadas pelo ponto central das orelhas de coelho. Cada ferimento redondo com diâmetro de 1 cm apresentava defeito e, em seguida, o pericôndrio foi removido. Vinte e oito dias após a cirurgia, a crosta da orelha de coelho saiu da ferida e cicatrizou completamente, com um diâmetro visível de cerca de 0,9 cm de cicatrizes hipertróficas. A cicatriz era de um vermelho brilhante, havia inchaços na pele ao redor da hiperplasia óbvia e a cicatriz era espessa e dura.

Determinação das taxas de abertura de microcanal

Diferentes pontos de tempo após CO ₂ tratamento com laser fracionado em modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho, fluorescência vermelha Rodanmin 6GO com etossomos foi aplicado aos tecidos da cicatriz. Três horas depois, CLSM foi usado para determinação da taxa de abertura do canal. Taxa de abertura do canal =número do canal aberto / (número do canal aberto + número do canal fechado) × 100%. A porcentagem da taxa de abertura do canal reflete o efeito do CO ₂ eficácia de penetração fracionada do laser.

Coloração H&E

Geralmente, os coelhos são sacrificados usando pentobarbital a 10% i.v. injeção (dose de 5 vezes a dose normal para anestesia, 35 mg / kg). Remova imediatamente as amostras e prossiga para a etapa de coloração H&E. O método de coloração com hematoxilina e eosina está de acordo com o protocolo de coloração H&E padrão.

Índice de elevação da cicatriz e determinação da espessura relativa

Vinte e oito dias após a indução de cicatrizes hipertróficas de orelha de coelho, quatro grupos de intervenção são realizados:grupo 5EL:géis entossômicos encapsulados com 5-FU combinado com CO ₂ laser fracionário; Grupo 5E:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU; CO ₂ grupo:CO ₂ tratamento a laser fracionado; e grupo controle. Definimos A como a espessura da parte mais espessa do tecido cicatricial hipertrófico da orelha de coelho e B como espessura de 1,0 cm da parte mais espessa do tecido cicatricial hipertrófico da orelha de coelho (próximo ao ponto central). A espessura relativa é calculada por A / B. A hipertrofia da cicatriz dérmica foi ilustrada pelo SEI. SEI =área da derme neoformada / área da derme não ferida. SEI> 1,5 representa uma cicatriz hipertrófica.

Estática

Todos os experimentos foram repetidos três vezes. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada no SPSS versão 19.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA). t do aluno teste foi usado para calcular a significância. * p valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo; ** p valor <0,01 foi considerado estatisticamente muito significativo; *** p valor <0,001 foi considerado estatisticamente extremamente significativo, e **** p valor <0,0001 foi considerado estatisticamente altamente extremamente significativo.

Resultados

Avaliação da qualidade de etossomos encapsulados com 5-florouracil (5E)

Em primeiro lugar, para validar a qualidade do gel etossômico encapsulado com 5-florouracil (5E), a morfologia e os diâmetros foram detectados por observação em microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Os etossomos no estado de suspensão formaram um círculo completo de tamanho universal ou vesícula oval-esférica, que é inferior a 100 nm ao microscópio (Fig. 1a-b). Após a formulação do gel, os etossomos permaneceram intactos (Fig. 1c-d). Usando o analisador de tamanho de partícula a laser, os etossomos em estado de suspensão parecem ter um diâmetro de 87,72 ± 9,27 nm, e o PDI foi de 0,10 ± 0,01. Nesse ínterim, o tamanho de partícula dos etossomos foi 98,78 ± 10,88 nm, e PDI foi 0,11 ± 0,02. Uma comparação estática mostra que o tamanho da partícula não tem diferença significativa ( p > 0,05). Além disso, ambos os PDIs não tiveram diferença significativa ( p > 0,05). Além disso, os dados obtidos do analisador de tamanho de partícula a laser e TEM mostraram resultados comparáveis. Além disso, a eficácia de aprisionamento (EE) também foi determinada pelo método de ultracentrifugação (Tabela 1). Os resultados mostraram que o EE da suspensão etossômica foi de 10,47 ± 1,47%, e o EE do gel etossômico foi 11,56 ± 1,12% ( n =6), sem significância ( p > 0,05). Em conclusão, não foram encontradas alterações na morfologia e no tamanho das partículas no estado de suspensão e no estado de gel dos etossomos.

Imagens do microscópio eletrônico de transmissão de etossomos 5-FU. Etossomos de soluções ( a e b ) e etossomos de gel ( c e d )

CO ₂ O laser fracionado promove a permeabilidade 5E por meio de cicatrizes hipertróficas in vitro

Após avaliação da qualidade dos etossomos encapsulados com 5-florouracil (5-FU), exploramos sua permeabilidade em cicatrizes hipertróficas humanas com ou sem CO ₂ laser fracionado in vitro . Tecido de cicatriz hipertrófica humana foi irradiado por CO ₂ laser fracionário e, em seguida, 5E foi aplicado uniformemente. As concentrações cumulativas de 5-FU foram determinadas em 1, 3, 6, 10, 16 e 24 h por HPLC (2). Comparamos as concentrações cumulativas de 5-FU de CO ₂ laser fracionado combinado com etossomos encapsulados com o grupo 5-florouracil (5EL) e o grupo 5E em diferentes momentos. Em 1 h, a concentração cumulativa de 5-FU do grupo 5EL foi de 4,15 ± 2,22 μg / ml / cm ² , que foi maior do que a concentração do grupo 5E (0,73 ± 0,33 μg / ml / cm ² , p <0,001). No tratamento de longo prazo (24 h), concentração de permeação cumulativa de 5-FU do grupo 5EL (107,61 ± 13,27 μg / ml / cm ² ) também foi superior ao do grupo 5E (20,73 ± 3,77 μg / ml / cm ² , p <0,0001). Nos pontos de tempo anteriores, 3, 6, 10 e 16 h, os grupos 5EL sempre mostraram maior concentração de permeação cumulativa de 5-FU do que os grupos 5E (Fig. 2a). Além disso, a quantidade de retenção de 5-FU no grupo 5EL foi de 24,42 ± 4,37 μg / cm ² , que é maior do que o grupo 5E (12,45 ± 1,64 μg / cm ² , p <0,01, n =6) (Fig. 2b). Este resultado sugeriu que CO ₂ a irradiação a laser fracionada pode promover significativamente o lipossoma contido em 5-FU através do tecido cicatricial hipertrófico humano e ajudar na retenção de 5-FU no tecido cicatricial hipertrófico in vitro.

CO ₂ o laser fracionado promove a permeabilidade 5E através de cicatrizes hipertróficas in vitro . a Comparação da permeação do grupo 5E e 5EL em um estudo de 24 horas de cicatriz hipertrófica humana in vitro. Os valores foram expressos como média ± DP. n =6. b Retenção acumulativa de 5-FU em cicatriz hipertrófica in vitro após aplicação por 24 h. n =6. *** p valor <0,001 foi considerado estatisticamente extremamente significativo, **** p valor <0,0001 foi considerado estatisticamente altamente extremamente significativo

A profundidade e a extensão da penetração de 5-FU foram determinadas usando 5E marcado com Rho para avaliar o efeito de aumento da penetração de CO ₂ laser fracionado in vitro. O ensaio de fluorescência foi usado para indicar a intensidade dos grupos 5E e 5EL em 1, 6 e 24 h após o tratamento com 5-FU (Fig. 3a). Os resultados mostraram que após 1 h 5EL de tratamento, a fluorescência Rho foi distribuída na epiderme e na camada superficial da derme, especialmente em torno de CO ₂ zona de gaseificação induzida por laser fracionário. Em contraste, sem CO ₂ irradiação laser fracionada, distribuição de fluorescência Rho foi limitada à área da epiderme no grupo 5E. Após 6 horas de tratamento no grupo 5EL, a fluorescência Rho se expandiu para a derme profunda e exibiu mais acúmulo. Embora a distribuição da fluorescência do grupo 5E tenha começado a aparecer na derme, a intensidade da fluorescência diminuiu gradativamente da derme para a epiderme. Após 24 h de tratamento, a fluorescência de dois grupos foi amplamente distribuída em todo o tecido da pele, mas a intensidade da fluorescência no grupo 5EL foi significativamente maior. Além disso, o software de análise de imagem Release Version 4.0 SP2 foi usado para análise quantitativa para calcular a intensidade de fluorescência para ambos os grupos. Os resultados da análise quantitativa mostraram aumento significativo da intensidade de fluorescência Rho no grupo 5EL do que no grupo 5E (1 h:59,61 ± 6,39 vs.6,39 ± 1,64, p <0,0001; 6 h:163,32 ± 13,23 vs. 49,89 ± 4,01, p <0,0001; 24 h:270,36 ± 8,73vs. 148,25 ± 16,89, p <0,0001) (Fig. 3b). Em resumo, CO ₂ a irradiação com laser fracionado promove significativamente a penetração do 5E no tecido cicatricial hipertrófico humano in vitro.

CO ₂ o laser fracionado promove a permeabilidade através de cicatrizes hipertróficas in vitro . a A fluorescência vermelha é marcada como etossomos permeados por tecidos hipertróficos de cicatrizes após 1, 6 e 24 h in vitro. b A intensidade de fluorescência de etossomos marcados com rodamina 6GO em tecido cicatricial hipertrófico in vitro após 1, 6 e 24 h. **** p valor <0,0001 foi considerado estatisticamente altamente extremamente significativo

Duração do CO ₂ O laser fracionário aumenta a penetração de 5-FU in vivo

Para obter evidências mais substanciais de CO ₂ No efeito do laser fracionário, realizamos a penetração do 5-FU in vivo usando o modelo de cicatriz hipertrófica de coelho. A configuração do modelo de cicatriz hipertrófica de coelho foi descrita como Método. Diferentes pontos de tempo (3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 dias e 7 dias) após a aplicação de CO ₂ laser fracionado, tratamento 5E ou 5EL foi realizado e distribuição de fluorescência foi determinada imediatamente por CLSM (Fig. 4). A fluorescência Rho foi amplamente visível e amplamente distribuída na camada derme das cicatrizes hipertróficas da orelha de coelho, que estavam mais próximas da zona ablativa (Fig. 4a). Estes resultados podem indicar que Rho misturado com 5E se infiltra principalmente através do canal poroso após CO ₂ irradiação laser fracionada. A fluorescência pode ser detectada na zona ablativa ao redor do tecido dérmico após 6 h 5EL, mesmo com uma pequena área de distribuição (Fig. 4b). A área de distribuição da fluorescência continua a diminuir 12 h após o tratamento com drogas, o que indica que os canais microporosos são gradualmente fechados quando a ferida cicatriza (Fig. 4c). Após 24 h, 3 dias e 7 dias de tratamento de CO ₂ irradiação a laser fracionada, a fluorescência só pode ser encontrada dentro do poro da crosta em torno das aberturas e nenhuma penetração na derme (Fig. 4d-f), o que sugere que CO ₂ o efeito de penetração fracionada do laser desapareceu com a reepitelização completa da epiderme. Nossos dados sugeriram que a abertura de microcanais desempenha um papel crítico na penetração de drogas com o tratamento 5EL. Posteriormente, calculamos as taxas de abertura de microcanais de 3 h, 6 h, 12 h, 24h, 3 dias e 7 dias após a irradiação do laser, respectivamente. Nos pontos de tempo de 3 e 6 h, os canais microporosos estavam todos abertos, o que indicava que as taxas de abertura de microcanais eram de 100%. As taxas de abertura de microcanais começaram a diminuir para 90,59% às 12 horas e 15,58% às 24 horas. Em particular, os canais microporosos foram todos fechados 3 e 7 dias após o tratamento com 5EL. Juntos, esses resultados sugerem que CO ₂ o laser fracionado controla a penetração da droga em tecido cicatricial hipertrófico de coelho in vivo.

CO ₂ o laser fracionado promove taxas de abertura de microcanais in vivo. A fluorescência vermelha é marcada como etossomos permear tecidos de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho 0 h ( a ), 6 h ( b ), 12 h ( c ), 24 h ( d ), 3 dias ( e ) e 7 dias ( f ) após CO ₂ tratamento a laser fracionado in vivo

O efeito terapêutico de 5EL na cicatriz hipertrófica in vivo

Para compreender profundamente o tratamento 5EL, realizamos a determinação da espessura relativa da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho. Após a configuração do modelo de cicatriz hipertrófica de orelha de coelho, foram calculados os valores de espessura relativa antes e depois do tratamento 5EL. Nenhuma diferença significativa foi encontrada antes dos grupos de tratamento. No entanto, a espessura relativa do grupo 5EL foi de 1,27 ± 0,15, o que foi significativamente menor do que o grupo 5E (1,52 ± 0,10, p <0,05) e não tratado (1,61 ± 0,15, p <0,0001) grupo (Fig. 5). Curiosamente, não houve mudança significativa entre o CO ₂ grupo tratamento com laser apenas e o grupo 5EL. Esses dados sugerem que CO ₂ o laser fracionado desempenha um papel dominante na cura da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho in vivo.

Comparação da espessura relativa de cicatrizes hipertróficas de coelhos antes e depois da aplicação de diferentes tratamentos. 5EL:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU combinado com CO ₂ laser fracionário, n =14; CO ₂ :CO ₂ laser fracionário apenas, n =12; Grupo 5E:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU, n =14; controle:em branco, n =16. * p valor <0,001 foi considerado significativo, **** p valor <0,0001 foi considerado estatisticamente altamente extremamente significativo

Também comparamos a morfologia da cicatriz hipertrófica da orelha de coelho para determinar a diferença do uso de CO ₂ laser fracionário. No grupo 5EL, as cicatrizes hipertróficas se achataram e a cor mudou significativamente para rosa claro (Fig. 6a-b). Em CO ₂ No grupo de tratamento apenas com laser fracionado, a espessura da cicatriz hipertrófica diminuiu até certo ponto e sua cor mudou para um vermelho pálido (Fig. 6c-d). No grupo 5E, a espessura da cicatriz hipertrófica diminuiu ligeiramente, mas a cor permaneceu vermelha brilhante (Fig. 6e-f). Finalmente, não houve mudança significativa no grupo não tratado em comparação com antes do tratamento (Fig. 6g-h). Em seguida, a coloração H&E foi usada para análise patológica em 7 dias após o tratamento para estes quatro grupos em tecido de cicatriz hipertrófica de orelhas de coelho (Fig. 7). O grupo 5EL e CO ₂ Os grupos de tratamento apenas com laser fracionado mostraram diminuição da espessura da camada dérmica de cicatrizes hipertróficas e crosta pontiaguda com raros arranjos nodulares ou espirais de fibras colágenas superficiais da derme (Fig. 7a-b). Um grande número de penetração de fibra de colágeno dérmico, arranjo desordenado de fibras de colágeno e arranjo em forma de espiral ou nodular da derme superficial foram encontrados no grupo 5E e no grupo não tratado (Fig. 7c-d). Outro método importante de avaliação da cicatriz hipertrófica é o índice de elevação da cicatriz (SEI). Semelhante ao padrão de espessura relativa, SEI do grupo 5EL (1,16 ± 0,08) e CO ₂ O grupo de tratamento apenas com laser fracionado (1,22 ± 0,10) diminuiu significativamente em comparação com o grupo 5E (1,32 ± 0,13) e o grupo não tratado (1,49 ± 0,08) (Fig. 8). Tomados em conjunto, a análise morfológica e os dados de cálculo SEI mostram CO ₂ Funções do laser fracionado na cicatrização de cicatriz hipertrófica em orelha de coelho in vivo.

Imagem fotográfica de cicatrizes hipertróficas de coelhos antes e depois da aplicação de diferentes tratamentos por 7 dias. O grupo 5EL:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU combinado com CO ₂ laser fracionário, antes ( a ) e depois ( b ) tratamento por 7 dias; CO ₂ grupo:CO ₂ laser fracionário, antes ( c ) e depois ( d ) tratamento por 7 dias; 5E grupo B:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU, antes de ( e ) e depois ( f ) tratamento por 7 dias; e grupo em branco:em branco, antes ( g ) e depois ( h ) tratamento por 7 dias

Análise histológica de H&E de cicatrizes hipertróficas de coelhos após aplicação de diferentes tratamentos por 7 dias. O grupo 5EL:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU combinado com CO ₂ laser fracionário ( a ); CO ₂ grupo:CO ₂ tratamento a laser fracionado ( b ); Grupo 5E:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU ( c ); e grupo em branco:em branco ( d ) Ampliações originais:× 40

Comparação do SEI de cicatrizes hipertróficas de coelhos após aplicação de diferentes tratamentos por 7 dias. 5EL:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU combinado com CO ₂ laser fracionário, n =14; CO ₂ :CO ₂ laser fracionário, n =12; 5E:os géis entossômicos encapsulados com 5-FU, n =14; controle:em branco, n =16. *** p valor <0,001 foi considerado estatisticamente extremamente significativo e **** p valor <0,0001 foi considerado estatisticamente altamente extremamente significativo

Discussão

O tratamento medicamentoso é a principal forma de tratamento, principalmente tópico ou por meio de injeções locais, para o tratamento não cirúrgico de cicatrizes hipertróficas. Por causa dos efeitos colaterais de vários medicamentos, a injeção local é frequentemente limitada a pequenas dosagens e, portanto, permite apenas uma pequena faixa de tratamento. Além disso, devido à meia-vida curta dos medicamentos, a alta concentração persistente na cicatriz requer injeções repetidas [6, 30, 31]. Além disso, como o tecido cicatricial é muito concentrado e muitas vezes ocorre dor intensa durante as injeções, os pacientes muitas vezes não aceitam o tratamento. Embora o uso de medicamentos externos tenha a vantagem de ser conveniente, indolor, com estabilidade em longo prazo, baixos efeitos colaterais, evitando o comprometimento do ambiente gastrointestinal [7, 8], existem várias limitações. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.

So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO ₂ fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO₂ fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].

In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm ² ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm ² ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO₂ laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO ₂ fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO₂ fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO₂ fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO₂ fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.

The duration of CO₂ fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO₂ fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO₂ laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.

In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO₂ fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO₂ fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.

It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO₂ fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO₂ fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO₂ fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO₂ fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15 2 fractional laser irradiation only):1.35 ± 0.09 2 fractional laser had a leading role in the intervention of hypertrophic scars. This finding was mainly manifested in three aspects. First of all, CO₂ fractional laser generated micro-channels for the promotion of scar drugs penetration. Secondly, CO₂ fractional laser itself could help in hypertrophic scar tissue’s collagen remodeling. Thirdly, 5E itself could directly influence hypertrophic scars. From H&E staining data, we found that processes of collagen fiber bundle remodeling, from disordered, different-direction collagen fibers into a consistent, paralleled direction collagen beam take place. In the experimental group of rabbit ear hypertrophic scar, there was a significant reduction in scar thickness, but also color change of hypertrophic scar, from bright red to light red, which may be induced by vascular proliferation of the scar tissue.

The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].

Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO₂ fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO₂ fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.

Conclusion

CO ₂ fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO ₂ fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO₂ fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO₂ fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO ₂ fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO₂ fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.

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