Método de marcação de células da microscopia adaptado para uso em imagens de corpo inteiro

Processos e estruturas dentro do corpo que normalmente estão escondidos do olho podem ser visíveis através de imagens médicas. Os cientistas usam imagens para investigar as funções complexas de células e órgãos e buscar maneiras de detectar e tratar melhor as doenças. Na prática médica cotidiana, imagens do corpo ajudam os médicos a diagnosticar doenças e monitorar se as terapias estão funcionando. Para poder descrever processos específicos no corpo, os pesquisadores estão desenvolvendo novas técnicas para rotular células ou moléculas para que elas emitam sinais que possam ser detectados fora do corpo e convertidos em imagens significativas. Uma equipe de pesquisa da Universidade de Münster já adaptou uma estratégia de marcação de células atualmente usada em microscopia – a chamada tecnologia SNAP-tag – para uso em imagens de corpo inteiro com tomografia por emissão de pósitrons (PET).

Este método rotula as células em duas etapas que funcionam para tipos de células completamente diferentes, como tumores e células inflamatórias. Primeiro, as células são geneticamente modificadas para produzir em sua superfície, a chamada enzima SNAP-tag, exclusiva das células-alvo. A enzima é então colocada em contato com um substrato de etiqueta SNAP adequado. O substrato é marcado com um emissor de sinal e estruturado quimicamente para que seja reconhecido e dividido pela enzima permitindo que o emissor de sinal seja transferido para a enzima. No processo, a enzima é modificada para que não esteja mais ativa e, como resultado, o emissor de sinal permanece firmemente acoplado a ela. Segundo os pesquisadores, a enzima SNAP-tag se automarca por meio de sua atividade biológica – isso acontece muito rapidamente e sem perturbar os processos naturais do organismo.

Na microscopia, os corantes fluorescentes são usados ​​para rotular as células, mas na maioria das vezes não são adequados para imagens de corpo inteiro porque seus sinais são espalhados por camadas de tecido mais espessas, resultando em que não podem mais ser medidos. Para resolver este problema, os cientistas sintetizaram um novo substrato SNAP-tag usando o emissor de sinal radioativo flúor-18. A equipe marcou com sucesso células tumorais em camundongos, injetando esse substrato no organismo através da corrente sanguínea. Eles foram então capazes de visualizar os tumores usando imagens PET.

Essa tecnologia abre a perspectiva de visualizar células geneticamente codificadas no corpo com diferentes modalidades de imagem e em diferentes estágios temporais – os pesquisadores chamam de imagem multiescala. Embora os sinais radioativos do flúor-18 permaneçam estáveis ​​por apenas um curto período de tempo, a segunda etapa de marcação pode ser repetida, para que as mesmas células possam ser visualizadas repetidamente ao longo de dias e semanas.

O alto nível de detalhe fornecido pela microscopia torna possível estudar como as células individuais se comunicam umas com as outras. A visão geral fornecida pela imagem de corpo inteiro permite que os cientistas avaliem como essas células funcionam como parte de sistemas de órgãos inteiros. O tempo pode revelar qual o papel que os tipos de células individuais desempenham na inflamação, por exemplo, quando ela começa, continua e se resolve. Os pesquisadores dizem que, combinando todas essas informações, é possível entender como tudo está conectado no corpo.

Os próximos passos cruciais serão testar quantas células são necessárias para obter um sinal suficientemente forte e se o método também pode ser usado para visualizar células que se movem dentro do organismo – em particular, células do sistema imunológico. Se a abordagem continuar sendo bem-sucedida, a técnica pode se tornar importante para futuras pesquisas em imunoterapias nas quais as próprias células imunes do corpo são geneticamente modificadas em laboratório para que possam combater uma doença específica. Essas terapias já estão sendo usadas para o tratamento do câncer e têm potencial para ajudar no tratamento de doenças inflamatórias também. A imagem pode ajudar a desenvolver e melhorar esses tratamentos.

Quando os cientistas apresentaram seus resultados pela primeira vez em um simpósio científico, eles tiveram uma surpresa – colegas de Tübingen apresentaram um estudo semelhante ao mesmo tempo. Independentemente uma da outra, ambas as equipes de pesquisa tiveram a mesma ideia fundamental, um substrato SNAP-tag marcado com flúor-18. Quimicamente falando, eles implementaram a ideia de forma diferente, mas testaram os substratos resultantes usando o mesmo sistema de modelo biológico e chegaram a resultados semelhantes. A equipe de Tübingen está desenvolvendo novos métodos de rotulagem para estudar células imunes em câncer, enquanto a equipe de Münster está se concentrando em doenças inflamatórias, de modo que as pesquisas se complementam muito bem.

Como todos os substratos SNAP-tag, a molécula recém-desenvolvida é baseada em benzilguanina, à qual os cientistas anexaram o isótopo radioativo flúor-18, que por sua vez é ideal para imagens PET. O objetivo era projetar a síntese em alguns passos rápidos para obter um sinal o mais forte possível. Como o flúor-18 tem uma meia-vida curta, sua radioatividade é reduzida pela metade a cada 110 minutos. Inicialmente, os cientistas descobriram que o flúor-18 não se ligava à posição desejada na molécula. A benzilguanina era aparentemente muito sensível para ser marcada diretamente com flúor-18. Assim, os pesquisadores primeiro rotularam uma pequena molécula que é insensível às reações químicas necessárias – fluoroetilazida – e depois a ligaram à benzilguanina usando uma reação de clique, que é muito rápida e seletiva.

Os cientistas primeiro verificaram se o substrato sintetizado permanecia estável quando em contato com o sangue no tubo de ensaio e depois examinaram como as células interagiam com o substrato nos primeiros testes práticos em culturas de células. Ao fazer isso, eles compararam células tumorais humanas nas quais incorporaram geneticamente a enzima SNAP-tag com aquelas que não produziram a enzima. Eles podiam ver muito claramente que a radioatividade só era absorvida pelas células que produziam a enzima SNAP-tag. Finalmente, a equipe realizou estudos direcionados em camundongos individuais porque como uma molécula se comporta no ambiente biológico complexo em um organismo vivo não pode ser totalmente simulada em cultura de células ou com órgãos produzidos artificialmente. Os cientistas conseguiram mostrar que, uma vez que o substrato é injetado na corrente sanguínea, ele é distribuído pelo corpo muito rapidamente. Além disso, eles identificaram os caminhos através dos quais é excretado. Eles então compararam como as células tumorais com e sem a enzima SNAP-tag reagiram ao substrato em organismos vivos. Para tanto, as células tumorais foram injetadas sob a pele dos camundongos e removidas novamente após o exame para confirmação dos resultados com autorradiografia.