Nanopartículas Superparamagnéticas de Óxido de Ferro Ultraspequenas para Rastreamento de Células-Tronco na Terapia de Parkinson

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, e o método de transplante de células-tronco fornece uma estratégia promissora para o tratamento. Nestes estudos, rastrear os comportamentos biológicos das células transplantadas in vivo é essencial para uma compreensão básica da função das células-tronco e avaliação da eficácia clínica. No presente estudo, desenvolvemos novas nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro ultraspequenas (USPIO) revestidas com ácido poliacrílico (PAA) e amina metoxipolietilenoglicol (PEG) por método de decomposição térmica e modificação em duas etapas. As NPs USPIO-PAA/PEG têm diâmetro uniforme de 10,07 ± 0,55 nm e pico de absorção adequado dos ligantes correspondentes, como mostrado por TEM e FTIR. MTT mostrou que a sobrevivência de células incubadas com NPs USPIO-PAA/PEG permaneceu acima de 96%. As USPIO-PAA/PEG sintetizadas tiveram uma boa taxa de relaxamento de 84,65 s⁻¹ Mm⁻¹, indicando que poderiam ser eficientemente captadas e rastreadas por MRI. Além disso, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (HADSCs) primárias foram caracterizadas, marcadas com USPIO-PAA/PEG e transplantadas no estriado de modelos de ratos com DP induzida por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). As células marcadas puderam ser rastreadas por MRI por até 3 semanas após a cirurgia de transplante; além disso, o transplante com HADSCs marcadas atenuou significativamente rotações induzidas por apomorfina em modelos de DP e aumentou o número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra. Em geral, o desenvolvimento de NPs USPIO-PAA/PEG fornece uma ferramenta promissora para técnica de rastreamento in vivo de terapia celular e identifica uma nova estratégia para rastrear células-tronco com potencial terapêutico na DP.

Introdução

A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo. A deficiência relativamente focal a torna uma boa candidata para terapias baseadas em células. Vários tipos de células, variando de tecido mesencefálico fetal [1] a neurônios induzidos derivados de células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) [2], têm sido implicados no tratamento de DP; no entanto, preocupações éticas e o risco potencial de tumorigenicidade não puderam ser evitados durante a aplicação [3]. Células-tronco mesenquimais (MSC) são população de células-tronco multipotentes que tem sido relatada na última década como uma ferramenta terapêutica promissora para doenças neurodegenerativas, incluindo DP [4, 5]. Comparadas a outros tipos de células, MSCs mostram boa proliferação, ampla disponibilidade por todo o corpo humano e capacidade imunossupressora. Alguns estudos mostraram que o transplante intracraniano de MSCs promove neuroproteção, diferenciação neuronal e imunomodulação [6,7,8]. Nestes estudos, rastrear a viabilidade, migração e integração de células transplantadas in vivo é essencial para uma compreensão básica da função das células-tronco e avaliação da eficácia clínica.

Para melhor analisar os efeitos terapêuticos das células transplantadas, vários traçadores foram desenvolvidos. A segurança e eficácia dos traçadores são os fatores mais críticos que influenciam a aplicação. Comparado à marcação com proteínas fluorescentes [9], o rastreamento usando partículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) não traria nenhuma modificação genética às células transplantadas [10,11,12]. Vários estudos usaram SPIO como agente de contraste eficaz para visualizar e rastrear células transplantadas [6, 13, 14]. No entanto, alguns dos SPIO comercialmente disponíveis foram relatados por afetar as funções normais de MSC [15,16,17]; portanto, esforços extensivos têm sido dedicados ao desenvolvimento de novos SPIOs. No presente estudo, sintetizamos nanopartículas ultraspequenas de SPIO (USPIO) revestidas com ácido poliacrílico (PAA) e uma subsequente camada de amina metoxipolietilenoglicol (PEG). As novas USPIO-PAA/PEG mostram boa internalização celular e capacidade de rastreamento MRI de longo prazo in vitro e in vivo. Além disso, MSCs derivadas de tecido adiposo humano (HADSCs) marcadas com USPIO-PAA/PEG mantiveram as características biológicas, melhorando os prejuízos comportamentais e aumentando a imunorreatividade TH na substantia nigra de modelos animais de DP.

Materiais e Método

Materiais

Acetilacetonato de ferro, TREG (trietilenoglicol), dietilenoglicol e PEG foram comprados da Aladdin Industrial Corporation (Xangai, China). Brometo de metiltiazolildifenil-tetrazólio (MTT) foi comprado da Sigma-Aldrich Corporation (Xangai, China). Meio modificado de Dulbecco's eagle (DMEM), tripsina-EDTA (0,25%) e soro fetal bovino (FBS) foram comprados da Thermo Fisher Scientific. Cloridrato de 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida e N-Hidroxi succinimida foram comprados da Sigma-Aldrich (China). N, N-Dimetilformamida, álcool etílico absoluto e acetato de etila foram comprados da Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Água ultrapura foi produzida por sistemas de purificação de água pura e ultrapura Millipore. Antihuman CD90-FITC, antihuman CD45-PE, antihuman CD34-FITC e antihuman CD105-PE foram comprados da Biolegend.

Síntese de USPIO

O USPIO foi sintetizado pelo método poliol como pesquisa prévia [18,19,20,21]. Passos do experimento são os seguintes: acetilacetonato de ferro 1 mmol e TREG 25 mL foram misturados em um balão de três bocas, conectado a argônio, tubo de condensação esférico e termômetro. Após incubação com fluxo de argônio por 15 min, a mistura foi aquecida a 120℃ (taxa de aquecimento 3 °C/min) e mantida por 1 h, e então a mistura foi aquecida adicionalmente a 250 °C na mesma taxa de aquecimento e mantida por 30 min. A mistura de reação foi resfriada naturalmente à temperatura ambiente, diluída com 2 mL de álcool etílico absoluto, seguida de precipitação com acetato de etila. O sedimento foi coletado por centrifugação a 8000 rpm por 20 min e então ressuspenso em álcool etílico absoluto. O USPIO foi armazenado em álcool etílico absoluto a 4 °C para uso posterior.

Preparação de USPIO Revestido com PAA/PEG

O USPIO-PAA foi adquirido de acordo com relatório prévio [22]. Em detalhe, ácido poliacrílico (PAA) 1,5 g foi dissolvido em 24 mL de dietilenoglicol. Após fluxo de argônio por 5 min, a mistura foi aquecida a 110 °C e mantida até a solução ficar límpida. A solução dispersante em etanol contendo 28 mg de USPIO preparada no passo anterior foi adicionada à solução clarificada acima após dispersão ultrassônica. A solução foi finalmente aquecida a 210 °C a uma taxa de 3 °C/min. A reação foi interrompida após 2 h de refluxo e resfriada naturalmente à temperatura ambiente. Após resfriamento, acetato de etila foi adicionado à solução de reação para precipitar as NPs USPIO e então centrifugado a 8000 rpm por 20 min para remover o sobrenadante. O precipitado foi então disperso em etanol, seguido de precipitação com acetato de etila. Após os procedimentos de lavagem por três vezes, o USPIO-PAA foi disperso em água ultrapura para uso posterior. Para melhorar a biocompatibilidade, ligamos ainda PEG à superfície das nanopartículas por amidização mediada por EDC e NHS [23]. 0,45 g de PEG foi dissolvido em 5 ml de água ultrapura e adicionado à dispersão de 15 ml USPIO-PAA (contém 35 mg Fe) suplementada com 20 mg EDC e 12 mg NHS. A mistura foi agitada mecanicamente à temperatura ambiente por 2 h, e então 10 ml de solvente DMF foi adicionado, removendo água a 40℃ em aparelho de evaporação rotativa. Finalmente, 40 mg DEC e 24 mg NHS foram adicionados à mistura, misturando à temperatura ambiente por 48 h. A solução de reação foi transferida para uma bolsa de diálise em água ultrapura por 72 h, durante a qual a água ultrapura foi substituída a cada 12 h. A mistura foi transferida ainda para um tubo de ultrafiltração para coletar moléculas com Mr > 30 kD por centrifugação a 4000 rpm por 10 min. O produto final foi dissolvido em água ultrapura e armazenado a 4 °C. Em alguns casos, SPIO-PAA/PEG dissolvido em água foi coletado por centrifugação com tubo de centrífuga de ultrafiltração (> 30 KD tamanho de poro, Millipore), e os pellets foram secos em forno a vácuo para experimento posterior.

Caracterização das NPs

O tamanho de partícula, distribuição de tamanho e morfologia das amostras foram analisados por TEM. A camada de revestimento foi medida por coloração negativa. Após dispersão ultrassônica, o USPIO-PAA e USPIO-PAA/PEG em solução aquosa foram adicionados à rede de cobre de malha 300 com membrana de suporte de carbono, secos naturalmente e então colocados em um microscópio eletrônico de projeção (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) para observação.

A análise de espectroscopia infravermelha é realizada no Espectrômetro FTIR Série Cary 600 da Agilent Technologies, onde o pó de amostra seco é adicionado diretamente ao tanque de amostra para detecção.

O teor de Fe na dispersão USPIO-PAA/PEG foi determinado por espectrometria de absorção atômica de chama (FAAS), cujo modelo é PerkinElmer Analyst 700. Primeiro, soluções padrão de ferro de 1, 2, 3, 4 e 5 μg/mL foram configuradas para desenhar a curva padrão, e então 100 μL de dispersão USPIO-PAA ou USPIO-PAA/PEG foi dissolvido com ácido nítrico, e o teor de ferro foi determinado em um balão volumétrico de 50 mL.

Imagem de ressonância magnética das nanopartículas foi conduzida em scanners clínicos com campo magnético de 3 T no departamento de imagem do primeiro hospital afiliado da Universidade de Soochow. As nanopartículas foram dispersas em solução de gel de agarose 1% de acordo com a concentração correspondente. Após a solução solidificar, o tempo de relaxamento transversal das amostras foi medido por sequência de multi-eco. Exportando a aquisição de MRI em formato DICOM e então usando o Visualizador DICOM RadiAnt para abrir, ler o valor de cinza, importando os valores de cinza de diferentes tempos de eco no origin para ajuste, os valores de tempo de relaxamento transversal de dispersões USPIO com diferentes concentrações foram obtidos; finalmente, a taxa de relaxamento transversal r2 de amostras USPIO-PAA e USPIO-PAA/PEG foi obtida por ajuste linear com a taxa de relaxamento transversal de 1/T2 e a concentração de Fe das amostras. Os loops de histerese magnética de USPIO-PAA e USPIO-PAA/PEG foram adquiridos usando dispositivo Quantum Design DynaCool-9 na Universidade de Ciência e Tecnologia de Suzhou de acordo com métodos descritos anteriormente [24].

Isolamento e Identificação de HADSCs

Todos os estudos foram feitos de acordo com os 'Princípios Orientadores Éticos sobre Pesquisa de Células-Tronco Embrionárias Humanas' (do Ministério da Ciência e Tecnologia e Ministério da Saúde, República Popular da China, 2003) e Declaração de Helsinki. Amostras de tecido adiposo foram obtidas com consentimento informado e aprovação ética do primeiro hospital afiliado da Universidade de Soochow. O tecido adiposo foi lavado e cortado em pequenos pedaços após remover vasos sanguíneos e tecido conjuntivo sob microscópio anatômico. Os blocos foram digeridos com colagenase tipo I (0,3 pzu/mL) a 37 °C por 30 min, seguido de centrifugação a 500g por 10 min. O pellet celular foi suspenso em DMEM + 10% FBS e semeado na densidade de 8 × 10⁴/cm². Após 48 h, o meio antigo contendo células flutuantes foi descartado e substituído por meio novo.

HADSCs foram caracterizadas por citometria de fluxo para marcadores de superfície especificamente marcando mesenquimais (CD90 e CD105) e hematopoiéticas (CD34 e CD45) células-tronco. Um total de 1 × 10⁵ células foram colhidas e incubadas com anticorpos conjugados com PE, FITC, APC/cy7 ou PerCP contra CD34, CD45, CD90 e CD105 anticorpos monoclonais antihumanos de camundongo e controles isotípicos apropriados. Células coradas foram analisadas usando citômetro de fluxo (LSRFortessa, BD, EUA), e dados foram analisados usando software FlowJo. Quatro fenótipos de CD90+, CD105+, CD34− e CD45− foram selecionados para os marcadores de superfície de HADSCs. Níveis de expressão de marcadores de superfície celular foram identificados por citometria de fluxo (BD LSRFortessa).

A diferenciação adipogênica e osteogênica de HADSCs foram avaliadas por coloração Oil Red O e Alizarin Red, respectivamente. HADSCs foram cultivadas com meio de diferenciação adipogênica MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) ou Kit de Diferenciação Osteogênica OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Para diferenciação adipogênica de HADSCs, as células foram avaliadas no dia 14 por coloração qualitativa Oil Red O para adipócitos maduros cheios de lipídios (VivaCell Biosciences, C37A00150). Para diferenciação osteogênica de HADSCs, as células foram avaliadas no dia 21 por coloração Alizarin Red para nódulo de cálcio em osteócitos maduros (VivaCell Biosciences, C37C00150). Imagens foram adquiridas usando microscópio invertido Nexcope.

Captação Celular In Vitro de USPIO-PAA/PEG e Avaliação de Biocompatibilidade

HADSCs foram semeadas em placa de 6 poços com densidade de 1 × 10⁶ por poço. Células foram incubadas com meio contendo USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL e 0,1 μg/mL) por 2 h, e coradas com coloração azul da Prússia (PB) para identificação de Fe intracelular.

A biocompatibilidade de USPIO-PAA/PEG foi determinada por colorimetria MTT e ensaio de incorporação de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) (kit de proliferação EdU, Thermo). Para MTT, HADSCs foram semeadas em placa de 96 poços a densidade de 5 × 10³ por poço e incubadas com diferentes concentrações (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) de USPIO-PAA/PEG por 24 h, 48 h ou 72 h. 20 μl de solução MTT (5 mg/mL) foi adicionado a cada poço por 4 h, seguido por 150 μL de dimetil sulfóxido para dissolver os cristais. Valor de absorbância de cada poço foi medido a OD 570 nm usando instrumento marcado por enzima (BioTek Synergy HT). Para ensaio EdU, HADSCs foram incubadas com SPIO-PAA/PEG a 160 Fe μg/mL por 72 h, seguido de incubação com 10 μM EdU por 24 h. Células foram coletadas, fixadas com 4% paraformaldeído e neutralizadas com 2 mg/mL glicina. Após permeabilização, células foram incubadas com solução de corante (complexo Azida 647), as taxas de incorporação EdU foram avaliadas por citometria de fluxo.

Modelo de PD Induzido por 6-OHDA

Quinze a vinte ratos Wistar machos (grau SPF, pesando 220 ± 20 g) foram usados para rastreamento in vivo de HADSCs marcadas com USPIO-PAA/PEG em animais com DP. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com Regulamentos na China (Regulamentos para administração de assuntos concernentes a animais experimentais, 2017) e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais na Academia Chinesa de Ciências. Ao longo do tempo, animais foram alojados sob iluminação controlada (ciclo 12/12-h luz/escuro, "ligado" às 7 h) com acesso ad libitum a comida e água. Modelo de DP foi preparado por injeção de 2 pontos de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, EUA) no estriado unilateral de ratos. Como descrito anteriormente [25, 26], ratos foram injetados estereotaxicamente com 3 μL de solução de 6-OHDA (5 μg/μL) em 2 coordenadas (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: −4,0 a 6,0 mm; e AP: −1,0 mm, ML: 4,4 mm, DV: −4,5 a 6,5 mm), respectivamente. Testes de rotação induzida por apomorfina (0,5 mg/kg, subcutaneamente) foram usados para testar a validade dos modelos de DP. Os ratos foram injetados com apomorfina (0,5 mg/kg) subcutaneamente nas semanas 1, 2 e 3 após tratamento com 6-OHDA, e os escores de rotação foram avaliados por 30 min em campo aberto. O modelo de DP tem mais de 7 rotações por min induzidas por apomorfina e foi considerado bem-sucedido.

Transplante Celular e Imageamento MRI In Vivo

HADCs foram incubadas com USPIO-PAA/PEG (concentração de ferro 10 μg/mL) por 2 h quando atingiram 80% de confluência. 3 semanas após preparação do modelo de DP, 3 × 10⁶ de HADCs marcadas com USPIO-PAA/PEG ou salina foram injetadas no estriado esquerdo de modelos de ratos DP na seguinte coordenada (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: −4,0 a 6,0 mm). Animais que receberam transplante foram administrados com buprenorfina (0,5 mg/kg) imediatamente após cirurgia e por 2 dias depois. Estes animais foram submetidos a testes de rotação induzida por apomorfina nas semanas 1, 2 ou 3 após a cirurgia de transplante.

Para MRI in vivo, animais foram imageados usando sistema de imageamento de pequenos animais (IVIS) (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) nos dias 3, 9, 15 e 21 após injeção de salina ou HADSCs.

Análise Histológica

Os cérebros dos modelos de ratos restantes foram colhidos e seccionados com espessura de 30 mm para análise 3 semanas pós-transplante de células-tronco (n = 5 por grupo). Secções foram incubadas com anti-tirosina hidroxilase (TH, abcam, Inglaterra) e visualizadas com anticorpo anti-coelho donkey Alexa-594 conjugado (Abcam). DAPI foi usado para contra-coloração com núcleos. Imagens foram capturadas usando microscópio confocal Leica TCS SP5.

Análise Estatística

Dados numéricos foram expressos como média ± DP. Dados foram submetidos a testes t de Student de 2 caudas ou ANOVA one-way usando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) para avaliar a diferença. * indica p < 0,05 e NS indica diferença não significativa.

Resultados

Síntese e Caracterização das Nanopartículas

O design experimental é mostrado na Fig. 1. NPs USPIO hidrofóbicas foram preparadas usando método de decomposição térmica. Como mostrado na Fig. 2a-c, o diâmetro das NPs USPIO originais era 4,07 ± 0,57 nm; ao revestir com PAA, o diâmetro das NPs USPIO-PAA aumentou para 6,34 ± 0,54 nm; uma modificação adicional das NPs com PEG faz o diâmetro das NPs USPIO-PAA/PEG atingir 10,07 ± 0,55 nm. Todas as três nanopartículas eram esféricas em forma e uniformemente dispersas. Análise estatística mostrou que houve diferença significativa (F = 10, **p < 0,01, ##p < 0,01) entre os diâmetros de USPIO, USPIO-PAA e USPIO-PAA/PEG NPs, indicando uma modificação bem-sucedida com PAA e PEG (Fig. 2d).

Usando o método de absorção infravermelha, encontramos que USPIO-PAA tem um pico de absorção de carbonila óbvio a 1728 cm⁻¹ devido ao pico de vibração de alongamento de carbonila na molécula de PAA; USPIO-PAA/PEG tem um pico de vibração de flexão no plano de ligação carbono-nitrogênio a 1595 cm⁻¹ e um pico de vibração de alongamento de grupo hidroxila a 3440 cm⁻¹ (Fig. 2e). Todos estes dados confirmaram ainda que moléculas de PAA ou PEG foram modificadas com sucesso na superfície das NPs.

USPIO-PAA/PEG Mostrou Boa Resposta Magnética In Vitro e Biocompatibilidade com HADSC

A capacidade de imageamento in vitro de USPIO-PAA e USPIO-PAA/PEG foi avaliada pelos valores de escala de cinza de imagens MRI em diferentes concentrações (equivalentes a concentrações de Fe). Após ajuste, os valores de tempo de relaxamento transversal das dispersões em diferentes concentrações foram obtidos. Definindo a taxa de relaxamento transversal de 1/T2 como coordenada vertical e a concentração de Fe como coordenada horizontal, a taxa de relaxamento transversal de USPIO-PAA foi calculada como 107,94 s⁻¹ mm⁻¹ (Fig. 3a), e 84,65 s⁻¹ mm⁻¹ para USPIO-PAA/PEG (Fig. 3b). Ambas as partículas mostraram boas propriedades de imageamento MRI. Os loops de histerese magnética de SPIO-PAA e SPIO-PAA/PEG mostraram que o valor de magnetização de saturação de SPIO-PAA é 57 emu/g acima de 10.000 Oe (Fig. 3c), e o de SPIO-PAA/PEG é 40 emu/g acima de 10.000 Oe (Fig. 3d). A força coercitiva e remanência estavam próximas de zero (Fig. 3c, d), indicando ainda que tanto SPIO-PAA quanto SPIO-PAA/PEG eram superparamagnéticos.

Ao incubar NPs USPIO-PAA/PEG com HADSCs por diferentes tempos, encontramos que NPs USPIO-PAA/PEG não têm efeitos significativos na sobrevivência das células (p > 0,05). A viabilidade celular de HADSCs permanece acima de 96% quando a concentração equivalente de Fe variou de 0 a 160 μg/mL. Além disso, o aumento do tempo de incubação (de 24 a 72 h) não induz perda celular significativa em cada concentração de Fe (Fig. 4a). Observação semelhante foi obtida quando NPs USPIO-PAA/PEG foram incubadas com iPSCs em diferentes concentrações (Fig. 4b). Mesmo que HADSCs fossem tratadas com USPIO-PAA/PEG 160 μg Fe/mL por 72 h, a capacidade de proliferação, como indicado pelas taxas de incorporação EdU, não foi prejudicada pela presença de USPIO-PAA/PEG (Fig. 4c). Todos estes dados indicaram a biossegurança das NPs USPIO-PAA/PEG sintetizadas.

Para identificar se as células podiam ser efetivamente marcadas por NPs USPIO-PAA/PEG, incubamos HADSCs com NPs USPIO-PAA/PEG a Fe equivalente 10 μg/mL ou 0,1 μg/mL por 2 h. Como mostrado na Fig. 4d, um grande número de NPs coradas em azul foi observado em quase 100% de HADSCs na presença de USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Mesmo que a dose de USPIO-PAA/PEG reduzisse para 0,1 μg Fe/ml, ainda observamos coloração PB bastante uniforme e dispersa em quase todos os HADSC. Comparado a alguns dos outros SPIOs relatados [14, 27, 28], USPIO-PAA/PEG exibiu alta eficiência de captação celular.

Rastreamento de Longo Prazo de HADSCs Marcadas com NPs USPIO-PAA/PEG em Modelos de Rato com DP

HADSCs marcadas com NPs USPIO-PAA/PEG foram transplantadas no estriado esquerdo de modelo de rato DP por injeção estereotaxica. Como mostrado na Fig. 5, observamos um sinal MRI claro no estriado esquerdo 3 dias após o transplante de HADSC, indicando um rastreamento in vivo adequado das células transplantadas. Uma observação dinâmica nos dias D3, D9, D15 e D21 após transplante mostrou que as células transplantadas com marcação de NPs puderam ser claramente rastreadas por até 3 semanas, e os sinais MRI não mostraram redução óbvia durante o processo. Estes resultados indicam que as nanopartículas sintetizadas têm bom potencial para rastreamento in vivo de células transplantadas.

HADSCs Marcadas com NPs USPIO-PAA/PEG Exibiram Efeitos Terapêuticos em Modelo de DP

Para avaliar se HADSCs marcadas com NPs exibiram efeitos terapêuticos, primeiro realizamos caracterização fenotípica das HADSCs isoladas. Como mostrado na Fig. 6a, as HADSCs cultivadas eram células em forma de fuso. A análise de citometria de fluxo mostrou que as HADSCs expressavam altamente marcadores para células mesenquimais, como CD90 (> 99%) e CD105 (> 99%), enquanto poucas expressavam marcadores hematopoiéticos como CD34 e CD45 (Fig. 6b-g). As HADSCs poderiam diferenciar em direção a linhagens adipogênicas ou osteogênicas sob certas condições, e a capacidade de diferenciação foi mostrada por coloração Oil Red O ou Alizarin Red, respectivamente (Fig. 6h). Note as gotículas lipídicas ou nódulos calcificados nas HADSCs diferenciadas, enquanto nenhuma tal estrutura nas células controle HEK293 (Fig. 6h). Tudo isso indica que HADSCs cumprem os critérios de células mesenquimais.

As rotações induzidas por apomorfina foram 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 e 31,86 ± 1,72 por min na 1ª, 2ª e 3ª semanas após injeção de 6-OHDA, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo de rato DP. Como mostrado na Fig. 7, os números de rotação de modelos de rato DP reduziram para 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 e 31,54 ± 1,73 na 1ª, 2ª e 3ª semanas seguidas por transplante de HADSCs marcadas com NPs no estriado do lado da lesão. Análise estatística revelou diferença significativa entre os grupos administrados com salina e HADSC a partir da 2ª semana após cirurgia de transplante (p < 0,01 na 2ª semana, p < 0,01 na 3ª semana; n = 5 em cada grupo), indicando que HADSCs marcadas com NPs melhoram os prejuízos comportamentais nos modelos de DP.

DP é caracterizada pela perda de neurônios expressando tirosina hidroxilase (TH) na substantia nigra. Usando imuno-histoquímica contra TH, encontramos que 6-OHDA reduz neurônios expressando TH na substantia nigra, e o transplante com HADSCs no estriado de modelos de rato DP poderia aliviar tal redução (Fig. 8). Combinado com a observação de que o transplante celular alivia os prejuízos comportamentais de ratos DP, concluímos que HADSCs marcadas com NPs USPIO-PAA/PEG exercem efeitos terapêuticos em modelos de rato DP.

Discussão

Terapia celular é uma estratégia promissora para tratamento de doenças neurodegenerativas e tem estado na vanguarda da pesquisa pré-clínica nos últimos 20 anos [29, 30]. Rastrear células transplantadas é parte indispensável para esclarecimento de mecanismos subjacentes bem como avaliação de efeitos clínicos; no entanto, é desafiador e até certo ponto, dificultou a aplicação de terapia celular [31, 32]. Tomografia computadorizada (TC), imageamento de fluorescência no infravermelho próximo (NIFI) e MRI são os métodos mais comumente usados para rastreamento in vivo de células transplantadas [31, 32]. Comparado à radiação relativamente alta de TC e baixa sensibilidade de NIFI, MRI mostra boa imageamento de tecido profundo, alto contraste e baixa radiação ionizante, tornando-se uma boa candidata para rastreamento in vivo [33,34,35,36]. O desenvolvimento de traçadores adequados para MRI torna-se portanto parte indispensável para promover a aplicação de terapia celular.

SPIO é uma estratégia de marcação simples e confiável para visualização MRI. Para alcançar rastreamento in vivo de longo prazo de células transplantadas, as partículas SPIO precisam ter tamanho ultraspequeno e uniforme, já que partículas grandes podem levar a distribuição desigual dos traçadores e interferir com a circulação sanguínea normal [33]. Além disso, a eficiência de internalização e biocompatibilidade de nanopartículas são outro índice importante para avaliar os traçadores. Nanopartículas geralmente entram nas células através de endocitose de fase líquida [37], endocitose mediada por receptor [38] e fagocitose [39]. Para alcançar melhor captação celular, as partículas SPIO são geralmente modificadas com ligantes intermediários [18, 40, 41].

Além de rastreamento celular, SPIO também tem sido aplicado para entrega de drogas [42]. A distribuição tecidual e depuração farmacocinética são índices importantes para ambas aplicações. Comparado a NPs-PAA, NPs-PAA/PEG mostraram tempo de retenção mais longo no sangue e depuração urinária mais lenta [43]. NPs densamente revestidas com PEG fornecem distribuição muito mais uniforme sobre superfícies epiteliais mucosas, incluindo trato gastrointestinal [44], sistema respiratório [45, 46] e tumor cerebral [42], etc. Além disso, revestimento PEG reduz a adesão de proteínas e formação de coroa, que por sua vez pode promover distribuição uniforme das NPs ao custo de captação reduzida [47]. Como potencial boa ferramenta diagnóstica e terapêutica, a capacidade de marcação de SPIO-PAA/PEG a MSCs e sua aplicação adicional em distúrbios cerebrais como DP não foram bem estudados, e o presente estudo foi projetado para responder a esta questão. No presente estudo, sintetizamos novas nanopartículas ultraspequenas USPIO-PAA/PEG, modificando os núcleos SPIO com ligantes PAA e PEG, respectivamente. As NPs USPIO-PAA/PEG têm diâmetro ultraspequeno uniforme (10,07 ± 0,55 nm), boa dispersão em solução aquosa, biocompatibilidade com vários tipos de células bem como bom efeito de resposta magnética in vitro e in vivo. Importante, os sinais de HADSCs marcadas puderam ser claramente detectados sob MRI após transplante cerebral por até três semanas, indicando bom potencial para aplicação clínica.

DP é caracterizada por perda progressiva de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra, e pela deficiência de níveis dopaminérgicos nas redes dopaminérgicas [1]; a mais afetada é a via nigroestriatal incluindo o estriado. No presente estudo, transplantamos HADSCs marcadas com USPIO-PAA/PEG no estriado de modelos de rato DP, e encontramos que tal transplante melhorou os prejuízos comportamentais; além disso, atenuou a perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra até certo ponto. Similarmente, Ardeshir et al. relataram que transplantar MSCs derivadas de tecido adiposo de ratos atenuou rotações induzidas por apomorfina em modelos de DP [48]. Diferente de transplantar tecidos mesencefálicos fetais [49] ou progenitores neurais dopaminérgicos [50], HADSCs exercem seus efeitos terapêuticos principalmente através de efeitos parácrinos [51, 52], em vez de substituir tecidos prejudicados. Estudos mostraram que MSCs atuam como promotores de imunomodulação, neuroproteção e diferenciação neuronal, e estes efeitos são essencialmente mediados pelo secretoma liberado por MSCs [6, 7, 51]. Nosso resultado é consistente com estas observações; além disso, indica que os novos traçadores USPIO-PAA/PEG não interferiram com os efeitos de neuroproteção de HADSCs.

Conclusões

Desenvolvemos novos traçadores USPIO-PAA/PEG mostrando alta eficiência de captação celular, excelente biocompatibilidade e capacidades de rastreamento MRI de longo prazo. HADSCs marcadas com USPIO-PAA/PEG puderam ser rastreadas com MRI por 3 semanas após transplante celular. Além disso, as HADSCs marcadas atenuaram significativamente os prejuízos comportamentais de modelos de DP, e aumentaram o número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra. O desenvolvimento de traçador USPIO-PAA/PEG pode fornecer uma ferramenta promissora em pesquisa e aplicação de células-tronco.