Síntese de nanopartículas de SPIO e as aplicações subsequentes na marcação de células-tronco para a doença de Parkinson

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, e o método de transplante de células-tronco fornece uma estratégia promissora para o tratamento. Nestes estudos, o rastreamento do comportamento biológico das células transplantadas in vivo é essencial para um entendimento básico da função das células-tronco e avaliação da eficácia clínica. No presente estudo, desenvolvemos um novo revestimento de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético ultrapequeno com ácido poliacrílico (PAA) e metoxipolietilenoglicol amina (PEG) pelo método de decomposição térmica e uma modificação em duas etapas. Os NPs USPIO-PAA / PEG têm um diâmetro uniforme de 10,07 ± 0,55 nm e pico de absorção adequado dos ligantes correspondentes, conforme mostrado por TEM e FTIR. O MTT mostrou que a sobrevivência das células incubadas com USPIO-PAA / PEG NPs permaneceu acima de 96%. O USPIO-PAA / PEG sintetizado teve uma boa taxa de relaxamento de 84,65 s ⁻¹ Mm ⁻¹ , indicando que eles podem ser eficientemente captados e rastreados por ressonância magnética. Além disso, as células-tronco humanas primárias derivadas de adiposo (HADSCs) foram caracterizadas, marcadas com USPIO-PAA / PEG e transplantadas no corpo estriado de modelos de ratos PD induzidos por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). As células marcadas podem ser rastreadas por ressonância magnética por até 3 semanas após a cirurgia de transplante; além disso, o transplante com os HADSCs marcados atenuou significativamente as rotações induzidas por apomorfina em modelos de DP e aumentou o número de neurônios dopaminérgicos na substania nigra . No geral, o desenvolvimento de NPs USPIO-PAA / PEG fornece uma ferramenta promissora para a técnica de rastreamento in vivo de terapia celular e identifica uma nova estratégia para rastrear células-tronco com potencial terapêutico em DP.

Introdução

A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo. O comprometimento relativamente focal o torna um bom candidato para terapias baseadas em células. Vários tipos de células, variando de tecido mesencéfalo fetal [1] a neurônios induzidos derivados de células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) [2], foram implicados no tratamento de DP; no entanto, preocupações éticas e o risco potencial de tumorigenicidade não puderam ser evitados durante a aplicação [3]. As células-tronco mesenquimais (MSC) são populações de células-tronco multipotentes que foram relatadas na última década como uma ferramenta terapêutica promissora para doenças neurodegenerativas, incluindo DP [4, 5]. Em comparação com outros tipos de células, as MSC apresentam boa proliferação, ampla disponibilidade por todo o corpo humano e capacidade imunorepressora. Alguns estudos têm demonstrado que o transplante intracraniano de CTMs promove neuroproteção, diferenciação neuronal e imunomodulação [6,7,8]. Nestes estudos, o rastreamento da viabilidade, migração e integração das células transplantadas in vivo é essencial para uma compreensão básica da função das células-tronco e avaliação da eficácia clínica.

Para analisar melhor os efeitos terapêuticos das células transplantadas, vários marcadores foram desenvolvidos. A segurança e eficácia dos traçadores são os fatores mais críticos que influenciam a aplicação. Comparado com a marcação com proteínas fluorescentes [9], o rastreamento usando partículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) não traria nenhuma modificação genética às células transplantadas [10,11,12]. Vários estudos usaram SPIO como um agente de contraste eficaz para visualizar e rastrear as células transplantadas [6, 13, 14]. No entanto, foi relatado que alguns dos SPIO disponíveis no mercado afetam as funções normais do MSC [15,16,17]; portanto, grandes esforços têm sido dedicados ao desenvolvimento de novas SPIOs. No presente estudo, sintetizamos um revestimento de nanopartículas de SPIO ultra-pequenas (USPIO) com ácido poliacrílico (PAA) e uma camada subsequente de metoxipolietilenoglicol amina (PEG). O romance USPIO-PAA / PEG mostra uma boa internalização celular e capacidade de rastreamento por ressonância magnética de longo prazo in vitro e in vivo. Além disso, as MSCs marcadas com USPIO-PAA / PEG derivadas de tecido adiposo humano (HADSCs) mantiveram as características biológicas, melhorando as deficiências comportamentais e aumentando a imunorreatividade dos TH na substância negra de modelos animais com DP.

Materiais e Método

Materiais

Acetilacetonato de ferro, TREG (trietilenoglicol), dietilenoglicol e PEG foram adquiridos na Aladdin Industrial Corporation (Xangai, China). O brometo de metiltiazolildifenil-tetrazólio (MTT) foi adquirido a Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). O meio de águia modificado da Dulbecco (DMEM), tripsina-EDTA (0,25%) e soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific. O cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida e a N-hidroxissuccinimida foram adquiridos a Sigma-Aldrich (China). N, N-Dimetilformamida, álcool etílico absoluto e acetato de etilo foram adquiridos a Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Água ultrapura foi produzida por sistemas de purificação de água Millipore pura e ultrapura. CD90-FITC anti-humano, CD45-PE anti-humano, CD34-FITC anti-humano e CD105-PE anti-humano foram adquiridos à Biolegend.

Síntese de USPIO

O USPIO foi sintetizado pelo método do poliol conforme pesquisa anterior [18,19,20,21]. As etapas do experimento são as seguintes:acetilacetonato de ferro 1 mmol e TREG 25 mL foram misturados em um frasco de três gargalos conectado a argônio, tubo de condensação esférico e termômetro. Depois de incubada com fluxo de argônio por 15 min, a mistura foi aquecida a 120 ℃ (taxa de aquecimento é 3 ° C / min) e mantida por 1 h, e então a mistura foi aquecida a 250 ° C na mesma taxa de aquecimento e mantida por 30 min. A mistura de reação foi naturalmente resfriada à temperatura ambiente, diluída com 2 mL de álcool etílico absoluto, seguido por precipitação com acetato de etila. O sedimento foi coletado por centrifugação a 8.000 rpm por 20 min e então ressuspenso em álcool etílico absoluto. O USPIO foi armazenado em álcool etílico absoluto a 4 ° C para uso posterior.

Preparação de PAA / PEG Coated USPIO

O USPIO-PAA foi adquirido conforme relatório anterior [22]. Em detalhe, ácido poliacrílico (PAA) 1,5 g foi dissolvido em 24 mL de dietilenoglicol. Após um fluxo de argônio de 5 min, a mistura foi aquecida a 110 ° C e mantida até a solução ficar pelúcida. A solução de dispersão de etanol contendo 28 mg de USPIO preparada na etapa anterior foi adicionada à solução clarificada acima após dispersão ultrassônica. A solução foi finalmente aquecida a 210 ° C a uma taxa de 3 ° C / min. A reação foi interrompida após 2 h de refluxo e naturalmente resfriada à temperatura ambiente. Após arrefecimento, foi adicionado acetato de etilo à solução reaccional para precipitar os USPIO NPs e depois centrifugados a 8000 rpm durante 20 min para remover o sobrenadante. O precipitado foi então disperso em etanol, seguido por precipitação com acetato de etilo. Após os procedimentos de lavagem por três vezes, o USPIO-PAA foi disperso em água ultrapura para posterior utilização. A fim de melhorar a biocompatibilidade, nós ainda ligamos o PEG à superfície das nanopartículas por EDC e amidação mediada por NHS [23]. 0,45 g de PEG foi dissolvido em 5 ml de água ultrapura e adicionado à dispersão de USPIO-PAA de 15 ml (contém 35 mg de Fe) suplementado com 20 mg de EDC e 12 mg de NHS. A mistura foi agitada mecanicamente à temperatura ambiente por 2 h e, em seguida, 10 ml de solvente DMF foram adicionados, removendo a água a 40 ℃ no aparelho de evaporação rotativo. Finalmente, 40 mg de DEC e 24 mg de NHS foram adicionados à mistura, misturando à temperatura ambiente por 48 h. A solução reacional foi transferida para um saco de diálise em água ultrapura por 72 horas, durante as quais a água ultrapura foi trocada a cada 12 horas. A mistura foi posteriormente transferida para um tubo de ultrafiltração para coletar moléculas com Mr> 30 kD por centrifugação a 4000 rpm por 10 min. O produto final foi dissolvido em água ultrapura e armazenado a 4 ° C. Em alguns casos, a dissolução de SPIO-PAA / PEG em água foi coletada por centrifugação com um tubo de centrifugação de ultrafiltração (tamanho de poro> 30 KD, Millipore) e os peletes foram secos em um forno a vácuo para experimentos adicionais.

Caracterização de NPs

O tamanho de partícula, distribuição de tamanho e morfologia das amostras foram analisados ​​por TEM. A camada de revestimento foi medida por coloração negativa. Após a dispersão ultrassônica, o USPIO-PAA e o USPIO-PAA / PEG em solução aquosa foram adicionados à rede de cobre da membrana de suporte de carbono de 300 mesh, secos naturalmente e colocados em um microscópio eletrônico de projeção (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) para observação.

A análise da espectroscopia de infravermelho é realizada no espectrômetro FTIR da série Cary 600 da Agilent Technologies, onde o pó seco da amostra é adicionado diretamente ao tanque de amostra para detecção.

O teor de Fe na dispersão USPIO-PAA / PEG foi determinado por espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS), cujo modelo é PerkinElmer Analyst 700. Primeiro, 1, 2, 3, 4 e 5 μg / mL de solução padrão de ferro foi configurada para extrair o curva padrão e, em seguida, 100 μL de solução de dispersão USPIO-PAA ou USPIO-PAA / PEG foram dissolvidos com ácido nítrico e o teor de ferro foi determinado em um frasco volumétrico de 50 mL.

A ressonância magnética das nanopartículas foi realizada em scanners clínicos com campo magnético de 3 T no departamento de imagem do primeiro hospital afiliado da Universidade de Soochow. As nanopartículas foram dispersas em solução de gel de agarose a 1% de acordo com a concentração correspondente. Após a solidificação da solução, o tempo de relaxação transversal das amostras foi medido por sequência multi-eco. Exportando a aquisição de MRI no formato DICOM e usando o RadiAnt DICOM Viewer para abrir, ler o valor de cinza, importando os valores de cinza de diferentes tempos de eco na origem para ajuste, os valores de tempo de relaxamento transversal de dispersões USPIO com diferentes concentrações foram obtidos; finalmente, a taxa de relaxação transversal r2 das amostras USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG foi obtida por ajuste linear com a taxa de relaxação transversal de 1 / T2 e a concentração de Fe das amostras. Os loops de histerese magnética do USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG foram adquiridos usando o dispositivo Quantum Design DynaCool-9 na Universidade de ciência e tecnologia de Suzhou de acordo com os métodos descritos anteriormente [24].

Isolamento e identificação de HADSCs

Todos os estudos foram realizados de acordo com os ‘Princípios de orientação ética sobre pesquisa com células-tronco embrionárias humanas’ (do Ministério da Ciência e Tecnologia e do Ministério da Saúde, República Popular da China, 2003) e a Declaração de Helsinque. Amostras de tecido adiposo foram obtidas com consentimento informado e aprovação ética do primeiro hospital afiliado da Soochow University. O tecido adiposo foi lavado e cortado em pequenos pedaços após a remoção dos vasos sanguíneos e do tecido conjuntivo ao microscópio anatômico. Os blocos foram digeridos com colagenase tipo I (0,3 pzu / mL) a 37 ° C por 30 min, seguido por centrifugação a 500 g por 10 min. O pellet celular foi suspenso em DMEM + 10% FBS e semeado na densidade de 8 × 10 ⁴ / cm ² . Após 48 h, o meio antigo contendo células flutuantes foi descartado e substituído por meio fresco.

HADSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para marcadores de superfície marcando especificamente células-tronco mesenquimais (CD90 e CD105) e hematopoiéticas (CD34 e CD45). Um total de 1 × 105 células foi colhido e incubado com PE, FITC, APC / cy7 ou anticorpos conjugados com PerCP contra anticorpos monoclonais anti-humanos de camundongo CD34, CD45, CD90 e CD105 e controles de isotipo apropriados. As células coradas foram analisadas por meio de um citômetro de fluxo (LSRFortessa, BD, EUA) e os dados foram analisados ​​por meio do software FlowJo. Quatro fenótipos de CD90 +, CD105 +, CD34− e CD45− foram selecionados para os marcadores de superfície de HADSCs. Os níveis de expressão dos marcadores de superfície celular foram identificados por citometria de fluxo (BD LSRFortessa).

A diferenciação adipogênica e osteogênica de HADSCs foi avaliada por Oil Red O e Alizarin Red Staining, respectivamente. HADSCs foram cultivados com meio de diferenciação adipogênica MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) ou Kit de diferenciação Osteogênica OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Para a diferenciação adipogênica de HADSCs, as células foram avaliadas no dia 14 por coloração qualitativa com óleo vermelho O para adipócitos maduros cheios de lipídios (VivaCell Biosciences, C37A00150). Para a diferenciação osteogênica de HADSCs, as células foram avaliadas no dia 21 por coloração com vermelho de alizarina para nódulo de cálcio em osteócitos maduros (VivaCell Biosciences, C37C00150). As imagens foram adquiridas usando um microscópio invertido Nexcope.

Captação celular in vitro de USPIO-PAA / PEG e avaliação de biocompatibilidade

HADSCs foram plaqueados em uma placa de 6 poços com uma densidade de 1 × 10 ⁶ por bem. As células foram incubadas com o meio contendo USPIO-PAA / PEG (Fe 10 μg / mL e 0,1 μg / mL) por 2 hs e coradas com azul da Prússia (PB) para identificação de Fe intracelular.

A biocompatibilidade de USPIO-PAA / PEG foi determinada por colorimetria MTT e ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) (kit de proliferação EdU, Thermo). Para MTT, os HADSCs foram semeados em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ por poço e incubado com diferentes concentrações (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg / mL) de USPIO-PAA / PEG 24 h, 48 h ou 72 h. 20 μl de solução de MTT (5 mg / mL) foram adicionados a cada poço por 4 h, seguido por 150 μL de sulfóxido de dimetil para dissolver os cristais. O valor de absorvância de cada orifício foi medido a DO 570 nm usando um instrumento marcado com enzima (BioTek Synergy HT). Para o ensaio EdU, HADSCs foram incubados com o SPIO-PAA / PEG a 160 Fe μg / mL por 72 h, seguido pela incubação com 10 μM EdU por 24 h. As células foram coletadas, fixadas com paraformaldeído 4% e neutralizadas com 2 mg / mL de glicina. Após a permealização, as células foram incubadas com a solução corante (complexo Azide 647), as taxas de incorporação de EdU foram avaliadas por citometria de fluxo.

Modelo de DP induzida por 6-OHDA

Quinze a vinte ratos Wistar machos (grau SPF, pesando 220 ± 20 g) foram usados ​​para rastreamento in vivo de HADSCs marcados com USPIO-PAA / PEG em animais com DP. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os Regulamentos na China (Regulamentos para a administração de assuntos relativos a animais experimentais, 2017) e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Academia Chinesa de Ciências. Durante todo o tempo, os animais foram alojados sob iluminação controlada (ciclo claro / escuro de 12/12 horas, “ligado” às 7 horas) com acesso ad libitum a comida e água. O modelo de DP foi preparado por injeção de 2 pontos de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, EUA) no corpo estriado unilateral de ratos. Conforme descrito anteriormente [25, 26], os ratos foram injetados estereotaxicamente com 3 μL de solução 6-OHDA (5 μg / μL) em 2 coordenadas (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:- 4,0 a 6,0 mm; e AP:- 1,0 mm, ML:4,4 mm, DV:- 4,5 a 6,5 ​​mm), respectivamente. Os testes de rotação induzida por apomorfina (0,5 mg / kg, por via subcutânea) foram usados ​​para testar a validade dos modelos de DP. Os ratos foram injetados com apomorfina (0,5 mg / kg) por via subcutânea em 1, 2 e 3 semanas após o tratamento com 6-OHDA, e os escores de rotação foram avaliados por 30 min em campo aberto. O modelo PD tem mais de 7 rotações por minuto induzidas pela apomorfina e foi considerado bem-sucedido.

Transplante de células e imagens de ressonância magnética in vivo

HADCs foram incubados com USPIO-PAA / PEG (concentração de ferro foi de 10 μg / mL) por 2 h, quando atingiram 80% de confluência. 3 semanas após a preparação do modelo PD, 3 × 10 ⁶ de HADCs marcados com USPIO-PAA / PEG ou solução salina foram injetados no estriado esquerdo de modelos de ratos PD na seguinte coordenada (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:- 4,0 a 6,0 mm). Os animais transplantados foram administrados com buprenorfina (0,5 mg / kg) imediatamente após a cirurgia e por 2 dias depois. Esses animais foram submetidos aos testes de rotação induzida por apomorfina em 1, 2 ou 3 semanas após a cirurgia de transplante.

Para ressonância magnética in vivo, os animais foram fotografados usando um sistema de imagem in vivo (IVIS) sistema de imagem de pequenos animais (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) no 3º, 9º, 15º e 21º dias após a injeção de solução salina ou HADSCs.

Análise histológica

Os cérebros dos modelos de ratos restantes foram colhidos e seccionados com uma espessura de 30 mm para análise 3 semanas após o transplante de células-tronco ( n =5 por grupo). As secções foram incubadas com anti-tirosina hidroxilase (TH, abcam, Inglaterra) e visualizadas com anticorpo anti-coelho de burro conjugado com Alexa-594 (Abcam). DAPI foi usado para contracoloração com núcleos. As imagens foram capturadas usando microscópio confocal Leica TCS SP5.

Análise estatística

Os dados numéricos foram expressos como média ± DP. Os dados foram submetidos a testes t de Student bicaudal ou ANOVA unilateral usando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) para avaliar a diferença. * indica p <0,05 e NS indica nenhuma diferença significativa.

Resultados

A Síntese e Caracterização de Nanopartículas

O projeto experimental é mostrado na Fig. 1. As NPs USPIO hidrofóbicas foram preparadas usando o método de decomposição térmica. Conforme mostrado na Fig. 2a-c, o diâmetro dos NPs USPIO originais era 4,07 ± 0,57 nm; pelo revestimento com PAA, o diâmetro dos NPs USPIO-PAA aumentou para 6,34 ± 0,54 nm; uma modificação adicional dos NPs com PEG faz com que o diâmetro dos NPs USPIO-PAA / PEG atinja 10,07 ± 0,55 nm. Todas as três nanopartículas eram de forma esférica e uniformemente dispersas. A análise estatística mostrou que houve diferença significativa ( F =10, ** p <0,01, ## p <0,01) entre os diâmetros dos NPs USPIO, USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG, indicando uma modificação bem-sucedida com PAA e PEG (Fig. 2d).

Ilustração esquemática do projeto experimental

Caracterização de nanopartículas. a – c Imagens representativas de TEM de NPs USPIO ( a ), NPs USPIO-PAA ( b ) e NPs USPIO-PAA / PEG ( c ) d A análise estatística indicou uma diferença significativa entre o tamanho das partículas de USPIO, USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG ( n =20 por grupo). e Infravermelho com transformada de Fourier de nanopartículas de USPIO, USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG NPs. As setas indicam o pico de absorção específico em 1728 cm ⁻¹ devido à modificação do PAA, 1595 cm ⁻¹ e 3440 cm ⁻¹ devido à modificação do PEG. Os dados numéricos são apresentados como média ± DP, ** p <0,01 contra os NPs do USPIO, ## p <0,01 versus os NPs USPIO-PAA / PEG. A barra representa 20 nm

Usando o método de absorção infravermelho, descobrimos que USPIO-PAA tem um pico de absorção de carbonila óbvio em 1728 cm ⁻¹ devido ao pico de vibração do alongamento da carbonila na molécula de PAA; USPIO-PAA / PEG tem um pico de vibração de curvatura de ligação carbono-nitrogênio em 1595 cm ⁻¹ e um pico de vibração de alongamento do grupo hidroxila em 3440 cm ⁻¹ (Fig. 2e). Todos esses dados confirmaram ainda que as moléculas de PAA ou PEG foram modificadas com sucesso para a superfície de NPs.

USPIO-PAA / PEG apresentou boa resposta magnética in vitro e biocompatibilidade com HADSC

A capacidade de imagem in vitro do USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG foi avaliada pelos valores da escala de cinza das imagens de ressonância magnética em diferentes concentrações (equivalentes às concentrações de Fe). Após o ajuste, foram obtidos os valores do tempo de relaxação transversal das dispersões em diferentes concentrações. Ao definir a taxa de relaxamento transversal de 1 / T2 como a coordenada vertical e a concentração de Fe como a coordenada horizontal, a taxa de relaxamento transversal de USPIO-PAA foi calculada como 107,94 s ⁻¹ mm ⁻¹ (Fig. 3a), e 84.65 s ⁻¹ mm ⁻¹ para USPIO-PAA / PEG (Fig. 3b). Ambas as partículas mostraram boas propriedades de imagem de ressonância magnética. Os loops de histerese magnética do SPIO-PAA e do SPIO-PAA / PEG mostraram que o valor de magnetização de saturação do SPIO-PAA é 57 emu / g acima de 10.000 Oe (Fig. 3c), e o do SPIO-PAA / PEG é 40 emu / g acima de 10.000 Oe (Fig. 3d). A força coercitiva e a remanência foram próximas de zero (Fig. 3c, d), indicando ainda que SPIO-PAA e SPIO-PAA / PEG eram superparamagnetismo.

Resposta magnética in vitro dos NPs USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG sintetizados. a , b Ressonância magnética e taxa de relaxamento transversal de NPs USPIO-PAA ( a ) e NPs USPIO-PAA / PEG ( b ) r ₂ representa a taxa de relaxamento. As taxas de relaxamento dos NPs USPIO-PAA e USPIO-PAA / PEG foram 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ e 84,65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d loops de histerese magnética de NPs USPIO-PAA ( c ) e NPs USPIO-PAA / PEG ( d ) A histerese magnética foi medida a 295 k (21,85 ° C) com a intensidade máxima do campo magnético de 50.000 Oe (5 Telsa). Os valores de magnetização de saturação foram próximos a 57 emu / g para SPIO-PAA e 40 emu / g para SPIO-PAA / PEG. A histerese de magnetização em ambas as curvas foi próxima de zero

Ao incubar os NPs USPIO-PAA / PEG com HADSCs por diferentes tempos, descobrimos que os NPs USPIO-PAA / PEG não têm efeitos significativos para a sobrevivência das células ( p > 0,05). A viabilidade celular de HADSCs permanece acima de 96% quando a concentração de Fe equivalente variou de 0 a 160 μg / mL. Além disso, o aumento do tempo de incubação (de 24 para 72 h) não induz perda significativa de células a cada concentração de Fe (Fig. 4a). Uma observação semelhante foi obtida quando USPIO-PAA / PEG NPs foram incubados com iPSCs em diferentes concentrações (Fig. 4b). Embora HADSCs tenham sido tratados com 160 μg Fe / mL USPIO-PAA / PEG por 72 h, a capacidade de proliferação, conforme indicado pelas taxas de incorporação de EdU, não foi prejudicada pela presença de USPIO-PAA / PEG (Fig. 4c). Todos esses dados indicaram a biossegurança dos NPs USPIO-PAA / PEG sintetizados.

Os NPs USPIO-PAA / PEG sintetizados mostram boa biocompatibilidade e capacidade de rotulagem. a , b HADSCs ou iPSCs foram incubados com USPIO-PAA / PEG NPs em concentrações variáveis ​​(equivalente a concentrações de Fe a 0, 10, 20, 40, 80 e 160 μg Fe / mL) por 24, 48 e 72 h, e a viabilidade celular foi determinado pelo método MTT e mostrado em a , b , respectivamente. Não há diferença significativa entre as viabilidades em diferentes concentrações de NPs ( n =5) ou tempo de incubação ( n =5). c A análise de citometria de fluxo mostrou que as taxas de incorporação de EdU foram semelhantes nos HADSCs incubados na presença ou ausência de USPIO-PAA / PEG (160 μg Fe / mL por 72 h). HADSCs não tratados com EdU foram servidos como controle negativo. d USPIO-PAA / PEG a 10 μg Fe / mL e tempo de incubação por 2 h resultou em quase 100% de eficiência de marcação de HADSCs, conforme avaliado por coloração com azul da Prússia. Observe que USPIO-PAA / PEG a 0,1 μg Fe / mL (2 h de incubação) produziu coloração de PB leve, mas uniforme nos HADSCs. Os dados numéricos são apresentados como média ± DP. A barra representa 20 μm

Para identificar se as células poderiam ser efetivamente marcadas por USPIO-PAA / PEG NPs, incubamos os HADSCs com USPIO-PAA / PEG NPs em Fe equivalente 10 μg / mL ou 0,1 μg / mL por 2 h. Conforme mostrado na Fig. 4d, um grande número de NPs corados em azul foi observado em quase 100% dos HADSCs na presença de USPIO-PAA / PEG (Fe 10 μg / mL). Embora a dose de USPIO-PAA / PEG tenha reduzido para 0,1 μg Fe / ml, ainda observamos coloração de PB bastante uniforme e dispersa em quase todos os HADSC. Em comparação com alguns dos outros SPIOs relatados [14, 27, 28], USPIO-PAA / PEG exibiu alta eficiência de absorção celular.

Rastreamento de longo prazo de HADSCs rotulados com USPIO-PAA / PEG NPs em modelos de ratos PD

HADSCs marcados com USPIO-PAA / PEG NPs foram transplantados no estriado esquerdo do modelo de rato PD por injeção estereotáxica. Conforme mostrado na Fig. 5, observamos um sinal claro de ressonância magnética no estriado esquerdo 3 dias após o transplante HADSC, indicando um rastreamento in vivo adequado das células transplantadas. Uma observação dinâmica em D3, D9, D15 e D21 após o transplante mostrou que as células transplantadas com marcação NP puderam ser claramente rastreadas até 3 semanas, e os sinais de ressonância magnética não mostraram redução óbvia durante o processo. Esses resultados indicam que as nanopartículas sintetizadas apresentam bom potencial para o rastreamento in vivo das células transplantadas.

Imagens representativas de ressonância magnética dos cérebros em 3 dias, 9 dias, 15 dias e 21 dias seguidos de transplante com HADSCs de marcação USPIO-PAA / PEG ou solução salina. As imagens de MRI dos controles correspondentes, ou seja, ratos normais ou modelo de rato PD injetado com solução salina, foram mostradas na 1ª e 2ª linhas, respectivamente. Observe que, em comparação com os sinais negativos no controle, os cérebros de ratos transplantados com HADSCs marcados com USPIO-PAA / PEG mostraram sinais de ressonância magnética constantes e claros por até 21 dias. A barra representa 5 mm

HADSCs marcados com NPs USPIO-PAA / PEG exibiram efeitos terapêuticos no modelo de DP

Para avaliar se os HADSCs marcados com NPs exibiram efeitos terapêuticos, primeiro realizamos uma caracterização fenotípica dos HADSCs isolados. Conforme mostrado na Fig. 6a, os HADSCs cultivados eram células fusiformes. A análise de citometria de fluxo mostrou que os HADSCs foram marcadores altamente expressos para células mesenquimais, como CD90 (> 99%) e CD105 (> 99%), enquanto poucos deles expressaram marcadores hematopoiéticos como CD34 e CD45 (Fig. 6b-g ) Os HADSCs podem se diferenciar em linhagens adipogênicas ou osteogênicas sob certas condições, e a capacidade de diferenciação foi demonstrada por Oil Red O ou Alizarin Red Staining, respectivamente (Fig. 5h). Observe as gotículas de lipídios ou nódulos calcificados nas HADSCs diferenciadas, enquanto nenhuma estrutura nas células HEK293 de controle (Fig. 6h). Todos estes indicam que os HADSCs cumprem os critérios de células mesenquimais.

Caracterização de HADSCs. a Uma imagem representativa sob a frase microscópio de contraste mostrando que HADSCs tem um fenótipo típico de fuso. b – g HADSCs foram incubados com anticorpos conjugados com diferentes corantes contra marcadores CD45, CD105, CD34 e CD90 e submetidos à análise de citometria de fluxo. Os diagramas de dispersão são mostrados em b, c , e os histogramas são mostrados em d – g . Observe que a maioria das células foram expressas em CD90 e CD105, mas não em CD34 e CD45. h A diferenciação adipogênica e a diferenciação osteogênica de HADSCs versus células HEK293 são avaliadas por Oil Red O ou Alizarin Red Staining, respectivamente. A barra representa 20 μm

As rotações induzidas por apomorfina foram 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 e 31,86 ± 1,72 por min na 1ª, 2ª e 3ª semanas após a injeção de 6-OHDA, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo de DP de rato. Como mostrado na Fig. 7, os números de rotação de modelos de ratos PD foram reduzidos para 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 e 31,54 ± 1,73 na 1ª, 2ª e 3ª semanas seguidos por transplante de HADSCs marcados com NPs no estriado do lado da lesão. A análise estatística revelou uma diferença significativa entre os grupos administrados com solução salina e HADSC a partir da 2ª semana após a cirurgia de transplante ( p <0,01 na 2ª semana, p <0,01 na 3ª semana; n =5 em cada grupo), indicando que os HADSCs marcados com NPs melhoram as deficiências comportamentais nos modelos de DP.

Modelos de ratos PD foram administrados com solução salina ou HADSCs marcados com USPIO-PAA / PEG no estriado ipsilateral prejudicado com 6-OHDA, e os números de rotação por minuto foram pontuados e comparados. Há uma redução significativa dos números de rotação na 2ª, 3ª semanas após os ratos PD receberem HADSCs, em comparação com os ratos PD correspondentes que receberam solução salina. ns indica mudança insignificante e ** indica p <0,01. n =5 para cada grupo

A DP é caracterizada pela perda de neurônios que expressam tirosina hidroxilase (TH) na substância negra. Ao usar imunocoloração contra TH, descobrimos que 6-OHDA reduz os neurônios que expressam TH na substância negra, e o transplante com HADSCs no corpo estriado de modelos de ratos com DP poderia aliviar essa redução (Fig. 8). Combinado com a observação de que o transplante de células alivia as deficiências comportamentais de ratos com DP, concluímos que os HADSCs marcados com NPs USPIO-PAA / PEG exercem efeitos terapêuticos em modelos de ratos com DP.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , g ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , i ) The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , i , respectivamente. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Discussão

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

Conclusões

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

Disponibilidade de dados e materiais

All data supporting the conclusions of this article are included within the article.

Abreviações

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA:

Polyacrylic acid

PEG:

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Tomografia computadorizada

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

MRI:

Imagem de ressonância magnética

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

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