Síntese de nanopontos de carbono fluorescentes amarelos por Microplasma para imagiologia e inativação fotocatalítica de células cancerosas

Resumo

Nos últimos anos, nanopartículas multifuncionais com funções diagnósticas e terapêuticas combinadas mostram uma grande promessa na nanomedicina. Neste estudo, relatamos a síntese ambientalmente correta de nanopontos de carbono fluorescentes, como pontos quânticos de carbono (CQDs) por microplasma usando o -fenilenodiamina. Os CQDs produzidos exibiram amplos picos de absorção em 380-500 nm e emitiram fluorescência amarela brilhante com pico em 550 nm. Os CQDs foram rapidamente absorvidos pelas células cancerosas HeLa. Quando excitado sob luz azul, um sinal de fluorescência amarelo brilhante e espécies reativas de oxigênio (ROS) intensas foram produzidas de forma eficiente, permitindo imagens de células cancerosas fluorescentes simultâneas e inativação fotodinâmica, com uma redução de 40% na viabilidade celular relativa. Além disso, cerca de 98% das células estavam ativas após a incubação com 400 μg mL ⁻¹ CQDs no escuro, que revelou a excelente biocompatibilidade dos CQDs. Portanto, os CQDs recém-preparados são, portanto, demonstrados como materiais que podem ser eficazes e seguros para uso em bioimagem in vivo e terapia de câncer guiada por imagem.

Introdução

O câncer continua sendo uma das principais causas de morte em todo o mundo [1]. Nanopartículas multifuncionais com funções diagnósticas e terapêuticas têm aplicações promissoras na nanomedicina. A terapia simultânea guiada por imagem é um novo conceito no tratamento do câncer e mostra uma grande promessa no que diz respeito à otimização da eficácia terapêutica. Pode fornecer informações úteis sobre o tamanho e localização dos tumores, a janela de tempo ideal para fototerapia e eficácia terapêutica [2,3,4]. A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido usada para tratar muitos tipos de câncer e outras doenças devido à sua seletividade espaço-temporal e natureza não invasiva [5, 6]. Os fotossensibilizadores ideais geralmente possuem as seguintes características:(1) geração altamente eficiente de espécies reativas de oxigênio (ROS), (2) boa biocompatibilidade e (3) solubilidade em água [7]. No entanto, as aplicações atuais de PDT são limitadas pela baixa solubilidade em água, instabilidade e comprimentos de onda de excitação subótimos de fotossensibilizadores. Portanto, é necessária a geração de substitutos do fotossensibilizador com boa solubilidade em água e biocompatibilidade por métodos ambientalmente corretos e de baixo custo.

Os pontos quânticos de carbono (CQDs) têm recebido grande atenção devido às suas propriedades benéficas únicas, como síntese simples e ambientalmente correta, baixa toxicidade, biocompatibilidade notável, excelente solubilidade em água e estabilidade de luz [8]. CQDs têm usos potenciais em imagem celular, biossensor, distribuição de drogas direcionadas e outras aplicações biomédicas [9,10,11,12,13]. Existem duas abordagens principais para a síntese de pontos de carbono:abordagens ascendentes e descendentes. Os métodos top-down incluem oxidação eletroquímica, ablação a laser, oxidação química e métodos de síntese ultrassônica. Os métodos bottom-up consistem em tratamento hidrotérmico, síntese de microondas e decomposição térmica [14,15,16,17]. No entanto, a alta temperatura, alta pressão e ácidos fortes necessários sempre levam a um consumo substancial de energia, processos complicados e danos inevitáveis ao meio ambiente. Portanto, novos métodos sintéticos amigáveis ao meio ambiente surgem conforme os tempos exigem. Como foi relatado, os CQDs podem ser produzidos em apenas alguns minutos usando um método de microplasma líquido sem condições de alta temperatura, grande entrada de energia e procedimentos laboriosos [18,19,20]. Microplasmas fornecem um ambiente físico-químico único para estudos fundamentais e aplicações envolvendo materiais avançados. Os ambientes químicos e eletrônicos fornecidos pelos microplasmas são altamente desequilibrados e podem armazenar energia. Nesse ambiente, um grande número de elétrons, íons, radicais livres e outras substâncias ativas ionizadas com excitação podem ser produzidos [21, 22]. Embora o -fenilenodiamina é uma matéria-prima para a síntese de nanopontos de carbono, não tem sido usada na síntese de microplasma [23,24,25].

Neste estudo, o -fenilenodiamina foi usada como matéria-prima para sintetizar CQDs por tratamento de microplasma. Os CQDs gerados por este método eram uniformes em tamanho (cerca de 3,2 nm de diâmetro) e exibiam um pico de emissão em cerca de 550 nm. Demonstramos que os CQDs recentemente sintetizados podem produzir uma grande quantidade de ROS sob condições de luz. In vitro, os CQDs podem ser absorvidos por células tumorais HeLa e emitidos luz amarela sob excitação de comprimento de onda azul em 420–500 nm com baixa toxicidade. Observamos também a inativação de células tumorais HeLa sob irradiação a 460 nm. Estes resultados sugerem que os CQDs recém-preparados podem ser materiais promissores para bioimagem in vivo, terapia de câncer guiada por imagem ou direcionada.

Resultados e discussão

Caracterização de CQDs

Os CQDs emissivos de amarelo neste estudo são preparados de uma maneira fácil e ecologicamente correta por um método de microplasma usando o -fenilenodiamina como precursor de carbono. Embora o método de processamento de microplasma tenha sido relatado como sendo usado para a síntese de nanopontos de carbono, existem raras pesquisas relativas. A Figura 1A mostra imagens de microscópio eletrônico de transmissão (TEM) das partículas CQD. As partículas produzidas pelo microplasma eram ciclo-agudas ou de formato oval com diâmetro médio de 3,2 nm. Conforme mostrado na imagem de alta resolução Fig. 1A (detalhe), a distância da rede nos CQDs é de 0,21 nm, pertencente ao plano (1,1,0) do grafite. O espectro Raman mostra que o modo D, denominado modo induzido por desordem, localizado em torno de 1342 cm ⁻¹ e o modo G gira em torno de 1507 cm ⁻¹ , respectivamente, devido ao resultado de sp ³ e sp ² -hibridização de carbono (Fig. 1E). Sabe-se que a intensidade do modo D em comparação com o modo G depende do tamanho dos microcristais de grafite na amostra. A maior desordem da amostra leva a uma razão de intensidade mais alta de ID / IG e ao microcristal de grafite menor. Além disso, os modos D e G dos pós CQD também podem ser vistos como pequenos flocos de grafite com uma relação de intensidade relativamente alta de ID / IG (0,77).

Caracterizações de CQDs. A Imagens TEM de CQDs (inserção, imagens TEM de alta resolução); B Distribuições de tamanho de CQDs; C Espectros de absorção de UV-vis dos CQDs; D O espectro FL dos CQDs com comprimentos de onda de excitação de 400 a 500 nm em incrementos de 20 nm; E , F Espectro Raman de CQDs e espectro FTIR de CQDs

FTIR e XPS são ferramentas poderosas para caracterizar a composição química e a estrutura de materiais à base de carbono. Os dados FTIR para CQDs foram registrados na faixa de 400–4000 cm ⁻¹ , conforme mostrado na Fig. 1F. O espectro de FTIR revelou que os CQDs contêm principalmente amina (3052 e 3324 cm ^-1 ), OH (3200 cm ⁻¹ ), C =O (1595 cm ⁻¹ ), C – N / C – O (1200 cm ⁻¹ ), C =C (1500 cm ⁻¹ ) e CH (748 cm ⁻¹ ) grupos funcionais ou ligações químicas [26, 27]. Os componentes de superfície dos CQDs, conforme determinado por XPS, foram consistentes com os resultados de FTIR. O espectro completo apresentado na Fig. 2A mostrou três picos típicos:C 1 s (285 eV), N 1 s (400 eV), e O 1 s (531 eV).

Espectros XPS de CQDs. A Espectros XPS em escala real dos CQDs; B Alta resolução de C 1 s espectro; C alta resolução de N 1 s espectro; D Alta resolução de O 1 s espectro

Conforme mostrado na Fig. 2B-D, a C 1 s a análise revelou a presença de sp ² / sp ³ carbonos (C – C / C =C, 284,8 eV), carbonos nitrosos (C – O / C – N, 285,9 eV) e carbonos carbonil (C =O, 287,7 eV). O N 1 s banda foi deconvoluída em três picos em 399,3, 400,3 e 401,7 eV, que correspondem a N pirrólico, N grafítico e amino N, respectivamente. O 1 s banda continha picos em 531,6 e 533,1 eV para C – O e C =O, respectivamente [28, 29]. É importante ressaltar que a existência desses grupos funcionais acima dotados CQDs com solubilidade favorável. Além disso, as propriedades ópticas dos CQDs foram investigadas usando espectroscopia de fluorescência e absorção de UV-Vis. Os espectros de emissão de fluorescência de CQDs são mostrados na Fig. 1C. Os CQDs preparados exibem um comportamento de emissão de fluorescência dependente de excitação. Quando excitado em comprimentos de onda de 400 a 500 nm, o pico máximo de emissão de fluorescência mudou para o vermelho de 473 para 519 nm e a intensidade de fluorescência diminuiu drasticamente [30]. Conforme mostrado na Fig. 1D, o espectro de UV-vis do CQD apresentou um forte pico de absorção na faixa de comprimento de onda de 400-490 nm. Os CQDs exibiram dois picos de absorção característicos em 280 e 420 nm, que se referiam às transições π – π * (C =C aromático) e n – π * (carboxila e / ou C – N), respectivamente [31, 32]. Portanto, essas propriedades ópticas de CQDs forneceram viabilidade para imagens biológicas simultâneas e inativação fotodinâmica.

Bioimagem e citotoxicidade de CQDs

Para avaliar a capacidade dos CQDs para bioimagem e marcação de células, a imagem celular in vitro usando CQDs foi investigada em células HeLa por um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). As células Hela foram incubadas com 200 μg mL ⁻¹ CQDs por 6 he então preparados para detecção CLSM. Como resultado, as células HeLa mostraram fluorescência amarela brilhante distribuída uniformemente por toda a célula (Fig. 3A). Mais importante, deve-se notar que a baixa concentração de CQDs de 200 μg mL ⁻¹ foi o suficiente para marcar células Hela com fluorescência amarela, o que especificou ainda mais a possibilidade de CQDs em imagens de células. Como foi relatado, as nanopartículas de carbono sempre exibiram forte emissão apenas na região de luz azul, enquanto as emissões de comprimento de onda longo eram geralmente fracas. Sob excitação UV, os tecidos biológicos freqüentemente mostravam autofluorescência azul e eram vulneráveis a receber fotodano, o que dificulta seriamente as aplicações de análise de imagem biológica de nanopartículas de carbono com emissões de comprimento de onda curto [33]. Portanto, o desenvolvimento de nanopartículas de carbono com emissões de longo comprimento de onda foi amplamente preocupado. No presente estudo, os CQDs preparados mostraram fluorescência amarelo brilhante sob a excitação de uma luz de 400–450 nm. A fluorescência amarela excitada, portanto, pode permitir que os CQDs sejam usados para a detecção de tumores profundos. No entanto, ainda há um longo caminho a percorrer antes de aplicações práticas em imagens de câncer em humanos.

Aplicação de CQDs. A Imagem CLSM de células HeLa marcadas com CQDs; B Teste de citotoxicidade in vitro de CQDs; C Viabilidade relativa de células HeLa incubadas com solução de controle ou CQDs (200 μg mL ⁻¹ ) e exposto à luz azul (460 nm, 30 mW cm ⁻² ) por 5 min, 10 min e 15 min; D O IC50 de CQDs excitados em células Hela após exposição à luz azul por 10 e 15 min (* P <0,05)

Além da característica de luminescência, alta biocompatibilidade e baixa toxicidade são sempre necessárias se os CQDs forem desenvolvidos como um potencial reagente de biomarcação. Para aplicações biomédicas, os materiais devem ser altamente biocompatíveis nas dosagens recomendadas. Para examinar a citotoxicidade, as células HeLa foram tratadas com CQDs em concentrações finais variando de 0 a 400 μg mL ⁻¹ por 24 h. Como mostrado na Fig. 3B, mais de 95% das células sobreviveram conforme determinado por ensaios de MTT (3- (4,5-dimetiltiazolil-2-il) -2,5-difeniltetrazólio), que revelaram que os CQDs eram praticamente não tóxico.

Esses dados sugerem que os CQDs recém-gerados com fluorescência amarela excitada têm baixa citotoxicidade e alta biocompatibilidade, o que facilita sua perspectiva promissora de imagens biológicas.

Eficácia da terapia fotodinâmica

Inativação de células cancerosas

Como mostrado na Fig. 3C, a viabilidade não diferiu entre as células HeLa tratadas com CQDs ou luz azul sozinha. O tratamento simultâneo com CQDs e luz azul reduziu significativamente a viabilidade celular das células Hela, dependendo da duração da fotoexposição. Após irradiação a 460 nm por 15 min, os CQDs exibiram atividade antitumoral notável; a viabilidade das células HeLa diminuiu cerca de 40% a uma concentração de 200 μg mL ⁻¹ . Para detectar ainda mais os efeitos dos CQDs excitados, os ensaios de MTT foram implementados para avaliar a metade da concentração inibitória máxima (IC50) de CQDs excitados para células Hela. Como resultado, o IC50 de CQDs após ser excitado em células Hela foi de cerca de 427,5 μg mL ⁻¹ (95% CI 366,7–498,7 μg mL ⁻¹ ) após uma irradiação de 10 min e era de aproximadamente 255,1 μg mL ⁻¹ (IC 95% 220,9–249,8 μg mL ⁻¹ ) após exposição à luz azul por 15 min.

Esses resultados indicaram que os CQDs excitados poderiam efetivamente matar as células tumorais como alguns medicamentos anticâncer clínicos, como o Photofrin [34], o que gerou o valor promissor dos CQDs na terapia antitumoral guiada por imagem.

Geração ROS de CQDs

Durante a PDT, as células cancerosas podem ser mortas por ROS citotóxicas geradas pelo fotossensibilizador endocitado sob condições de irradiação apropriadas [35, 36]. ROS pode inativar células-alvo por apoptose ou necrose com poucos efeitos colaterais via PDT em várias doenças [37,38,39,40]. A inspeção da Fig. 4A mostrou que o reagente ROS emite fluorescência vermelha, indicando a geração de ROS. Além disso, o sinal vermelho de ROS estava bem sobreposto à fluorescência de CQDs, o que significa que a geração de ROS estava intimamente associada à captação de CQDs pelas células tumorais. Como mostrado na Fig. 4B, em comparação com os grupos de controle e sem irradiação de laser, os grupos experimentais sob irradiação de laser de 460 nm por 15 min mostraram geração de ROS óbvia. Nossos resultados indicaram que os CQDs podem promover significativamente a produção de ROS intracelulares sob a irradiação de laser 460 nm e apresentam grande potencial para aplicação em PDT. Em princípio, os CQDs podem ser excitados do estado fundamental (S0 na Fig. 4C) para um estado excitado (Sn na Fig. 4C), e a eficiência desse processo é determinada pela intensidade da fonte de luz e o coeficiente de extinção . Após o relaxamento mediado por solvente, os CQDs permanecem no nível de vibração mais baixo do primeiro estado excitado do singlete. Devido ao rápido relaxamento vibracional após a excitação, a energia do fóton emitido a partir do primeiro estado excitado singlete (S1 na Fig. 4C) é menor do que a energia do fóton de excitação, resultando em um aumento do comprimento de onda. A imagem de fluorescência utiliza a transição CQDs de S0 para Sn para S1 [41]. Os CQDs foram ingeridos por células tumorais HeLa e emitiram fluorescência quando iluminados por uma fonte de comprimento de onda adequada, permitindo assim que as células fossem marcadas. S1 pode retornar ao estado S0 por fluorescência ou por cruzamento intersistema para um estado excitado tripleto não fluorescente (T1 na Fig. 4C) [7, 42]. O grupo fluorescente de T1 é especialmente ativo em reações de transferência de elétrons, gerando radicais livres superóxidos e, subsequentemente, resultando na degradação do grupo fluorescente. A energia de T1 transferida para o oxigênio molecular produziria um agente oxidante de oxigênio singlete excitado que é mais forte do que o oxigênio molecular do estado fundamental. Os radicais superóxido e oxigênio singlete, bem como outros ROS, incluindo OH e H ₂ O ₂ , reagem com moléculas biológicas próximas para exercer fototoxicidade, levando à morte celular. Depois que os CQDs foram absorvidos pelas células HeLa, a iluminação resultou na transferência do estado singlete para o estado tripleto através do intersistema, e o processo de transferência de energia produziu ROS e, por fim, levou à morte celular. Sob a fonte de comprimento de onda apropriada, os CQDs sofrem dois tipos de transferência de energia. A fluorescência foi emitida para marcar as células tumorais HeLa, e as células HeLa foram mortas por ROS. Nossos dados experimentais revelaram a boa biocompatibilidade dos CQDs recém-produzidos no escuro e a eficiência de eliminação do tumor sob condições de luz. Portanto, os CQDs podem ser usados como fotossensibilizador para células e tecidos tumorais.

Geração de ROS intracelular. A Imagens de fluorescência de HeLa, (a) imagem de transmissão de campo claro, (b) imagem de fluorescência CQDs coletada na faixa de 400–450 nm, (c) imagem de fluorescência do reagente de detecção de ROS capturada na faixa de 510–530 nm, e (d ) a imagem mesclada; B A produção de ROS intracelular para várias concentrações de CQDs com ou sem irradiação por 15 min; C um diagrama de nível de energia simplificado mostra as vias de transferência de energia de fluorescência potencial e morte celular. (S0, estado fundamental da molécula de fluoróforo; S1, primeiro estado excitado do singuleto; Sn ( n > 1); T1, primeiro estado excitado do trio; Ex, excitação por absorção de fótons; FL, fluorescência)

Além disso, ainda é um problema não resolvido como os CQDs podem ter como alvo o tumor com precisão e matar as células tumorais de forma mais eficaz. A abundância existente de grupos hidrofílicos funcionais de superfície (carboxila, carbonila, epóxi, hidroxila, hidroxila, etc.) permite que os pontos de carbono se conjugem com o anticorpo específico que pode atingir precisamente os tumores, e isso requer que o tumor tenha biomarcadores específicos. Simultaneamente, os pontos de carbono também podem servir como uma ferramenta para a entrega de drogas e genes, devido à sua alta proporção entre área de superfície e volume [43]. Considerando a excelente biocompatibilidade, tamanho pequeno para internalização por células tumorais, sendo rico em porções funcionais de superfície e os potenciais de bioimagem, pontos de carbono (incluindo CQDs) são considerados candidatos teranósticos promissores para terapia tumoral. No entanto, ainda existem desafios e muitos problemas não resolvidos para as aplicações de pontos de carbono em nanomedicina e bioimagem. Mais esforços devem ser feitos para promover a tradução da nanomedicina relacionada a pontos de carbono da bancada para a cabeceira do leito no futuro.

Conclusões

Em resumo, sintetizamos CQDs fotoluminescentes usando o -fenilenodiamina pelo método do plasma. Excitados por um laser azul, os CQDs com um diâmetro de cerca de 3,2 nm emitiram fluorescência amarela. Os resultados de Raman, UV-vis, FTIR e XPS mostraram que mais átomos de carbono estavam envolvidos em sp ² hibridização, formando um novo grupo orgânico. Os CQDs sintetizados pelo método do plasma provaram ser uma sonda eficaz em experimentos de imagem celular, e a fluorescência amarela emitida pelos CQDs pode marcar claramente as células HeLa. Além disso, os CQDs sintetizados apresentaram solubilidade favorável, atóxica e alta biocompatibilidade, o que poderia acelerar sua capacidade de bioimagem. Além disso, os CQDs excitados poderiam matar efetivamente as células Hela por geração de ROS, que exibiam claramente citotoxicidade fotodinâmica satisfatória de CQDs in vitro e apoiavam suas aplicações em PDT.

Métodos Experimentais

Síntese de pontos quânticos de carbono

O sistema de processamento de microplasma está resumido no Arquivo Adicional 1:Figura S1. Um tubo de aço inoxidável oco com um diâmetro interno de 180 μm foi conectado a uma fonte de alimentação de corrente contínua de alta tensão (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) e foi mantido a 2 mm acima da superfície do solução. Um eletrodo Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) foi conectado ao cátodo da fonte de alimentação e imerso na solução. Em seguida, 400 mg de o -fenilenodiamina (Xangai, China) foi dissolvida em 40 mL de água desionizada e 20 mL do o A solução de -fenilenodiamina foi adicionada a uma placa de Petri e agitada usando um agitador magnético. Durante o tratamento com microplasma, o gás argônio (Ar) fluiu através do tubo a uma taxa de fluxo de 60 sccm, e a corrente DC foi mantida em 17 mA. Após 10 min de tratamento com plasma, o produto preto acastanhado foi dialisado usando uma membrana de diálise (peso molecular de corte, 500 Da) contra 2 L de água desionizada por 12 he subsequentemente filtrado através de uma membrana de ultrafiltração de 0,22 μm. Finalmente, CQDs puros foram obtidos por liofilização.

Caracterização da estrutura, composição e propriedades ópticas de CQDs

O tamanho e a morfologia dos CQDs foram caracterizados por TEM usando um sistema JEM-2100F (JEOL, Tóquio, Japão). A espectroscopia de fluorescência foi realizada usando um espectrômetro de luminescência Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, EUA). Os espectros de absorção de UV / Vis foram medidos usando o espectrofotômetro Varian Cary 50 UV-VIS (Palo Alto, CA, EUA). Os espectros de FTIR foram obtidos usando um espectroscópio Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), e a espectroscopia Raman foi realizada usando o espectrômetro micro-Raman 800 UV (Invia-reflex, Reino Unido). Os experimentos XPS foram realizados usando um sistema Axis Ultra DLD (Shimadzu / Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japão).

Cultura de células e ensaio de citotoxicidade

Células HeLa (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em um umidificado 5% CO ₂ atmosfera. Para estudos de citotoxicidade de CQDs, as células foram contadas e semeadas em placas de 96 poços contendo 200 μL de meio completo a uma densidade de 6.000 células por poço. Após 24 h de cultura, as células foram incubadas com CQDs nas concentrações de 0, 25, 50, 100, 200 e 400 μg mL ⁻¹ por mais 24 h, e então, as viabilidades celulares foram detectadas usando ensaios de MTT para avaliar a citotoxicidade de CQDs. Resumidamente, essas soluções foram substituídas por 100 μL de solução de teste de MTT (0,5 mg mL ⁻¹ ) e incubado por 4 h em uma incubadora no escuro. O sobrenadante foi removido e os cristais foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). Finalmente, a absorvância de cada poço foi medida a 490 nm. A densidade óptica foi relacionada à viabilidade celular, assumindo 100% de viabilidade para a amostra de controle sem CQDs.

O ensaio de MTT também foi usado para avaliar o IC50 de CQDs animados em células Hela. Resumidamente, células Hela em placa de 96 poços foram incubadas com CQDs nas concentrações de 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 e 6400 μg mL ⁻¹ por 24 h na incubadora, tratada com luz a 460 nm por 10 min ou 15 min separadamente, e então cultivada por mais 24 h. A viabilidade celular de cada poço foi detectada usando o ensaio MTT e os dados foram usados para avaliação IC50.

Imagem celular

Células em uma concentração de 2 × 10 ⁴ mL ⁻¹ foram semeados em um prato confocal (diâmetro =15 mm), cultivados por 24 horas e lavados com PBS duas vezes para garantir que não houvesse células mortas. Uma solução CQD (200 μg mL ⁻¹ ; pH 7) foi adicionado e as células foram incubadas durante 6 h. As células foram subsequentemente lavadas com PBS três vezes para remover CQDs não ligados e fixadas com paraformaldeído a 4%. Em seguida, as amostras foram observadas usando um CLSM (LSM510, Zeiss, Alemanha) com excitação em comprimentos de onda variando de 400 a 450 nm.

Terapia fotodinâmica e medição de ROS

Para investigar os efeitos antitumorais, as células HeLa foram incubadas com 200 μg mL ⁻¹ CQDs por 24 h a 37 ° C no escuro e tratados com luz a 460 nm (30 mW cm ⁻² ) por 5, 10 e 15 min. Após 24 horas de incubação, um ensaio MTT padrão foi realizado para determinar a viabilidade celular relativa. A geração intracelular de ROS foi detectada quimicamente usando o método espectrofotométrico com o kit Fluorometric Intracellular Ros Assay (sigma, EUA). As células foram cultivadas em um prato confocal (diâmetro =15 mm) durante a noite para fixação das células. Em seguida, as células foram incubadas com 200 μg mL ⁻¹ CQDs por 4 h. Posteriormente, foram adicionados 100 μL / poço de Master Reaction Mix. Após incubação por 1 h, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 10 min, e as imagens de fluorescência das células foram observadas por CLSM. Quanto à detecção da produção de ROS, as células foram cultivadas em placas de 96 poços com 200 μL de meio de cultura. Após 24 h de incubação, o meio foi substituído por 100 μL de solução de CQDs nas concentrações de 0, 100, 200 μg mL ⁻¹ , e as células foram incubadas por mais 4 h. Posteriormente, as amostras foram lavadas três vezes com PBS, irradiadas por 15 min ou não e incubadas com 100 μL / poço da Master Reaction Mix por 1 h. Finalmente, a intensidade de fluorescência foi detectada usando um leitor de fluorescência (excitação de 520 nm, emissão de 605 nm).

Análises estatísticas

Os experimentos envolvidos neste estudo foram repetidos por três vezes e as análises estatísticas foram realizadas usando SPSS19.0. As diferenças entre os dois grupos foram comparadas usando Mann-Whitney U teste. O IC50 de CQDs excitados em células Hela foi avaliado usando regressão não linear. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados e materiais do estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

PDT:: Terapia fotodinâmica
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
CQDs:: Pontos quânticos de carbono
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
CLSM:: Microscópio de varredura a laser confocal
DMEM:: Meio de águia modificado de Dulbecco
MTT:: Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2-il) -2,5-difeniltetrazólio
DMSO:: Dimetilsulfóxido
IC50:: Metade da concentração inibitória máxima

Fabricação e Caracterização de Nanoarrays de Black GaAs via ICP Etching Propriedades fotoeletrônicas do detector de arranjo nanowire InAsSb ligado por extremidade sob luz fraca

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias