Síntese Eco-Amigável por Microplasma de Pontos Quânticos de Carbono Emissores Amarelos para Imagem de Células Cancerígenas e Inativação Fotocatalítica

Resumo

Nos últimos anos, nanopartículas multifuncionais com funções combinadas de diagnóstico e terapêuticas mostram grande promessa em nanomedicina. Neste estudo, relatamos a síntese ambientalmente amigável de nano-pontas fluorescentes de carbono como pontos quânticos de carbono (CQDs) por microplasma usando o-fenilenodiamina. Os CQDs produzidos exibiram picos de absorção amplos em 380-500 nm e emitiram fluorescência amarela brilhante com pico em 550 nm. Os CQDs foram rapidamente captados por células cancerígenas HeLa. Quando excitados sob luz azul, um sinal de fluorescência amarela brilhante e espécies reativas de oxigênio (ROS) intensas foram eficientemente produzidos, permitendo imagem fluorescente simultânea de células cancerígenas e inativação fotodinâmica, com diminuição de 40% na viabilidade celular relativa. Além disso, cerca de 98% das células estavam ativas após incubação com 400 μg mL⁻¹ CQDs no escuro, revelando excelente biocompatibilidade dos CQDs. Portanto, os CQDs recém-preparados são demonstrados como materiais que podem ser eficazes e seguros para uso em bioimagem in vivo e terapia de câncer guiada por imagem.

Introdução

Câncer permanece causa líder de morte mundial [1]. Nanopartículas multifuncionais com funções diagnósticas e terapêuticas têm aplicações promissoras em nanomedicina. Terapia guiada por imagem simultânea é novo conceito em tratamento de câncer e mostra grande promessa na otimização da eficiência terapêutica. Pode fornecer informação útil sobre tamanho e localização de tumores, janela de tempo ótima para fototerapia, e eficácia terapêutica [2-4]. Terapia fotodinâmica (TFD) tem sido usada para tratar muitos tipos de cânceres e outras doenças devido à sua seletividade espaço-temporal e natureza não invasiva [5, 6]. Fotosensibilizadores ideais geralmente possuem características: (1) geração altamente eficiente de espécies reativas de oxigênio (ROS), (2) boa biocompatibilidade, e (3) solubilidade em água [7]. No entanto, aplicações atuais de TFD são limitadas pela pobre solubilidade em água, instabilidade, e comprimentos de onda de excitação sub-ótimos de fotosensibilizadores. Portanto, geração de substitutos de fotosensibilizadores com boa solubilidade em água e biocompatibilidade por métodos ambientalmente amigáveis e baixo custo é necessária.

Pontos quânticos de carbono (CQDs) receberam tremenda atenção devido às suas propriedades benéficas únicas, como síntese simples e ambientalmente amigável, baixa toxicidade, biocompatibilidade notável, excelente solubilidade em água, e estabilidade à luz [8]. CQDs têm usos potenciais em imagem celular, biossensoriamento, liberação direcionada de fármacos, e outras aplicações biomédicas [9-13]. Existem duas abordagens principais para síntese de pontos de carbono, bottom-up e top-down. Métodos top-down incluem oxidação eletroquímica, ablação a laser, oxidação química, e métodos de síntese ultrassônica. Métodos bottom-up consistem de tratamento hidrotérmico, síntese por micro-ondas, e decomposição térmica [14-17]. No entanto, alta temperatura, alta pressão, e ácidos fortes requeridos sempre levam a consumo substancial de energia, processos complicados, e dano inevitável ao meio ambiente. Portanto, novos métodos sintéticos ambientalmente amigáveis emergem como os tempos requerem. Como relatado, CQDs podem ser produzidos dentro de apenas alguns minutos usando método microplasma-líquido sem condição de alta temperatura, grande entrada de energia, e procedimentos laboriosos [18-20]. Microplasmas fornecem ambiente físico-químico único para ambos estudos fundamentais e aplicações envolvendo materiais avançados. Os ambientes químicos e eletrônicos fornecidos pelos microplasmas são altamente não-equilíbrio e podem armazenar energia. Neste ambiente, grande número de elétrons, íons, radicais livres, e outras substâncias excitadas-ionizadas-ativas podem ser produzidas [21, 22]. Embora o-fenilenodiamina seja matéria-prima para síntese de nano-pontas de carbono, não foi usada em síntese por microplasma [23-25].

Neste estudo, o-fenilenodiamina foi usado como matéria-prima para sintetizar CQDs por tratamento de microplasma. Os CQDs gerados por este método foram uniformes em tamanho (cerca de 3,2 nm de diâmetro) e exibiram pico de emissão em torno de 550 nm. Demonstramos que os CQDs recém-sintetizados poderiam produzir grande quantidade de ROS sob condições de luz. In vitro, CQDs poderiam ser absorvidos por células tumorais HeLa e emitiram luz amarela sob excitação de comprimento de onda azul a 420-500 nm com baixa toxicidade. Também observamos inativação de células tumorais HeLa sob irradiação a 460 nm. Estes resultados sugerem que os CQDs recém-preparados podem ser materiais promissores para bioimagem in vivo, terapia de câncer guiada por imagem ou direcionada.

Resultados e Discussão

Caracterização dos CQDs

Os CQDs emissores amarelos neste estudo são preparados de maneira fácil e ambientalmente amigável por método de microplasma usando o-fenilenodiamina como precursor de carbono. Embora o método de processamento por microplasma tenha sido relatado para síntese de nano-pontas de carbono, existem pesquisas relativas raras. A Figura 1A mostra imagens de microscópio eletrônico de transmissão (MET) das partículas de CQD. As partículas produzidas por microplasma foram ciclo-agudas ou ovais com diâmetro médio de 3,2 nm. Como mostrado na imagem de alta resolução Fig. 1A (inset), a distância de rede nos CQDs é 0,21 nm, pertencente ao plano (1,1,0) de grafite. O espectro Raman mostra que modo D, chamado modo induzido por desordem, localizado em torno de 1342 cm⁻¹ e modo G centra-se em torno de 1507 cm⁻¹, respectivamente, devido ao resultado de hibridação sp³ e sp² de carbono (Fig. 1E). Sabe-se que a intensidade do modo D comparada com modo G depende do tamanho dos micro-cristais de grafite na amostra. A maior desordem da amostra leva a maior razão de intensidade ID/IG e menor micro-cristal de grafite. Além disso, os modos D e G de pós de CQD também podem ser vistos como pequenos flocos de grafite com razão de intensidade ID/IG relativamente alta (0,77).

Caracterizações dos CQDs. A Imagens de MET dos CQDs (inset, imagens MET de alta resolução); B Distribuições de tamanho dos CQDs; C Espectros de absorção UV-vis dos CQDs; D Espectro de FL dos CQDs com comprimentos de onda de excitação de 400 a 500 nm em incrementos de 20 nm; E, F Espectro Raman dos CQDs e espectro FTIR dos CQDs

FTIR e XPS são ferramentas poderosas para caracterizar composição química e estrutura de materiais baseados em carbono. Dados FTIR para CQDs foram registrados na faixa de 400-4000 cm⁻¹, como mostrado na Fig. 1F. O espectro FTIR revelou que os CQDs contêm principalmente amina (3052 e 3324 cm⁻¹), OH (3200 cm⁻¹), C=O (1595 cm⁻¹), C-N/C-O (1200 cm⁻¹), C=C (1500 cm⁻¹) e CH (748 cm⁻¹) grupos funcionais ou ligações químicas [26, 27]. Os componentes de superfície dos CQDs, determinados por XPS, foram consistentes com resultados FTIR. O espectro completo apresentado na Fig. 2A mostrou três picos típicos: C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), e O 1s (531 eV).

Espectros XPS dos CQDs. A Espectros XPS de escala completa dos CQDs; B Alta resolução de espectro C 1s; C alta resolução de espectro N 1s; D Alta resolução de espectro O 1s

Como mostrado na Fig. 2B-D, análise de C 1s revelou presença de carbonos sp²/sp³ (C-C/C=C, 284,8 eV), carbonos nitrosos (C-O/C-N, 285,9 eV), e carbonos carbonila (C=O, 287,7 eV). A banda N 1s foi desconstruída em três picos em 399,3, 400,3, e 401,7 eV, correspondendo a N pirrólico, N graítico, e N amino, respectivamente. A banda O 1s continha picos em 531,6 e 533,1 eV para C-O e C=O, respectivamente [28, 29]. Importante, a existência destes grupos funcionais dotou CQDs com solubilidade favorável. Além disso, as propriedades ópticas dos CQDs foram investigadas usando espectroscopia de fluorescência e UV-Vis. Os espectros de emissão de fluorescência dos CQDs são mostrados na Fig. 1C. Os CQDs preparados exibem comportamento de emissão de fluorescência dependente de excitação. Quando excitados em comprimentos de onda de 400 a 500 nm, o pico máximo de emissão de fluorescência deslocou-se para vermelho de 473 a 519 nm e a intensidade de fluorescência diminuiu acentuadamente [30]. Como mostrado na Fig. 1D, os espectros UV-vis dos CQD apresentaram pico de absorção forte na faixa de 400-490 nm. Os CQDs exibiram dois picos de absorção característicos em 280 e 420 nm, referentes a transições π-π* (C=C aromático) e n-π* (carboxila e/ou C-N), respectivamente [31, 32]. Portanto, estas propriedades ópticas dos CQDs forneceram viabilidade para imagem biológica simultânea e inativação fotodinâmica.

Bioimagem e Citotoxicidade dos CQDs

Para avaliar a capacidade dos CQDs para bioimagem e marcação celular, imagem celular in vitro usando CQDs foi investigada em células HeLa por microscópio confocal a laser (CLSM). Células HeLa foram incubadas com 200 μg mL⁻¹ CQDs por 6 h e então preparadas para detecção CLSM. Como resultado, células HeLa mostraram fluorescência amarela brilhante uniformemente distribuída por toda a célula (Fig. 3A). Mais importante, deve-se notar que baixa concentração de CQDs de 200 μg mL⁻¹ foi suficiente para marcar células HeLa com fluorescência amarela, o que especificou a possibilidade dos CQDs em imagem celular. Como relatado, nanopartículas de carbono sempre exibiram emissão forte apenas na região de luz azul, enquanto emissões de comprimento de onda longo eram geralmente fracas. Sob excitação UV, tecidos biológicos frequentemente mostravam autofluorescência azul e eram vulneráveis a receber fotodano, o que dificulta seriamente aplicações de análise de imagem biológica de nanopartículas de carbono com emissões de curto comprimento de onda [33]. Portanto, desenvolvimento de nanopartículas de carbono com emissões de longo comprimento de onda foi amplamente preocupante. No presente estudo, os CQDs preparados mostraram fluorescência amarela brilhante sob excitação de luz 400-450 nm. A fluorescência amarela excitada pode permitir CQDs serem usados para detecção de tumores profundos. No entanto, ainda há longo caminho antes de aplicações práticas em imagem de câncer humano.

Aplicação dos CQDs. A Imagem CLSM de células HeLa marcadas com CQDs; B Teste de citotoxicidade in vitro dos CQDs; C Viabilidade relativa de células HeLa incubadas com solução controle ou CQDs (200 μg mL⁻¹) e expostas a luz azul (460 nm, 30 mW cm⁻²) por 5 min, 10 min, e 15 min; D IC50 de CQDs excitados em células HeLa após exposição a luz azul por 10 e 15 min (*P < 0,05)

Além da característica de luminescência, alta biocompatibilidade e baixa toxicidade são sempre requeridas se CQDs pretendem ser desenvolvidos como reagente potencial de marcação biológica. Para aplicações biomédicas, materiais devem ser altamente biocompatíveis nas dosagens recomendadas. Para examinar citotoxicidade, células HeLa foram tratadas com CQDs em concentrações finais variando de 0 a 400 μg mL⁻¹ por 24 h. Como mostrado na Fig. 3B, mais de 95% das células sobreviveram conforme determinado por ensaios MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo), revelando que CQDs eram praticamente não-tóxicos.

Estes dados sugerem que os CQDs recém-gerados com fluorescência amarela excitada têm baixa citotoxicidade e alta biocompatibilidade, facilitando sua promissora perspectiva de imagem biológica.

Eficácia da Terapia Fotodinâmica

Inativação de Células Cancerígenas

Como mostrado na Fig. 3C, viabilidade não diferiu entre células HeLa tratadas com CQDs ou luz azul sozinha. Tratamento simultâneo com CQDs e luz azul reduziu marcadamente a viabilidade de células HeLa, dependendo da duração da foto-exposição. Após irradiação a 460 nm por 15 min, os CQDs exibiram atividade antitumoral notável; a viabilidade de células HeLa diminuiu cerca de 40% a concentração de 200 μg mL⁻¹. Para detectar mais os efeitos dos CQDs excitados, ensaios MTT foram implementados para avaliar concentração inibitória máxima (IC50) de CQDs excitados em células HeLa. Como resultado, IC50 de CQDs após excitação em células HeLa foi cerca de 427,5 μg mL⁻¹ (IC 95% 366,7-498,7 μg mL⁻¹) após irradiação de 10 min e aproximadamente 255,1 μg mL⁻¹ (IC 95% 220,9-249,8 μg mL⁻¹) após exposição a luz azul por 15 min.

Estes resultados indicaram que os CQDs excitados poderiam efetivamente matar células tumorais como alguns fármacos anticancerígenos clínicos, como Photofrin [34], o que motivou o valor promissor dos CQDs em terapia antitumoral guiada por imagem.

Geração de ROS dos CQDs

Durante TFD, células cancerígenas podem ser mortas por ROS citotóxicos gerados pelo fotosensibilizador endocitado sob condições de irradiação apropriadas [35, 36]. ROS podem inativar células alvo por apoptose ou necrose com poucos efeitos colaterais via TFD em várias doenças [37-40]. Inspeção da Fig. 4A mostrou que reagente ROS emite fluorescência vermelha, indicando geração de ROS. Além disso, o sinal vermelho de ROS sobrepôs-se bem com fluorescência dos CQDs, significando que a geração de ROS estava intimamente associada à captação de CQDs por células tumorais. Como mostrado na Fig. 4B, comparado com controle e grupos sem irradiação laser, grupos experimentais sob irradiação laser de 460 nm por 15 min mostraram geração óbvia de ROS. Nossos resultados indicaram que CQDs poderiam promover significativamente produção de ROS intracelular sob irradiação de laser 460 nm e tiveram grande potencial para aplicação em TFD. Em princípio, os CQDs podem ser excitados do estado fundamental (S0 na Fig. 4C) para estado excitado (Sn na Fig. 4C), e a eficiência deste processo é determinada pela intensidade da fonte de luz e coeficiente de extinção. Após relaxamento mediado por solvente, CQDs permanecem no nível vibracional mais baixo do primeiro estado singleto excitado. Devido ao relaxamento vibracional rápido após excitação, a energia do fóton emitido do primeiro estado singleto excitado (S1 na Fig. 4C) é menor que a energia do fóton de excitação, resultando em aumento de comprimento de onda. Imagem de fluorescência utiliza transição dos CQDs de S0 para Sn para S1 [41]. Os CQDs foram ingeridos por células tumorais HeLa e emitiram fluorescência quando iluminados por fonte de comprimento de onda adequado, permitindo assim as células serem marcadas. S1 pode retornar ao estado S0 por fluorescência ou por cruzamento intersistema para estado triplete excitado não fluorescente (T1 na Fig. 4C) [7, 42]. O grupo fluorescente de T1 é especialmente ativo em reações de transferência de elétrons, gerando radicais livres superóxido e subsequentemente resultando em degradação do grupo fluorescente. A energia de T1 transferida para oxigênio molecular produziria agente oxidante de oxigênio singleto excitado mais forte que oxigênio molecular estado fundamental. Radicais superóxido e oxigênio singleto, bem como outros ROS, incluindo OH e H₂O₂, reagem com moléculas biológicas próximas para exercer fototoxicidade, levando à morte celular. Após CQDs serem captados por células HeLa, iluminação resultou na transferência do estado singleto para triplete através do intersistema, e o processo de transferência de energia produziu ROS e finalmente levou à morte celular. Sob fonte de comprimento de onda apropriado, os CQDs sofrem dois tipos de transferência de energia. Fluorescência foi emitida para marcar células tumorais HeLa, e células HeLa foram mortas por ROS. Nossos dados experimentais revelaram boa biocompatibilidade dos CQDs recém-produzidos no escuro e eficiência de morte tumoral sob condições de luz. Portanto, os CQDs poderiam ser usados como fotosensibilizador para células e tecidos tumorais.

Geração intracelular de ROS. A Imagens de fluorescência de HeLa, (a) Imagem de transmissão de campo claro, (b) Imagem de fluorescência dos CQDs coletada na faixa 400-450 nm, (c) Imagem de fluorescência de reagente de detecção ROS capturada na faixa 510-530 nm, e (d) imagem mesclada; B Produção intracelular de ROS para várias concentrações de CQDs com ou sem irradiação por 15 min; C diagrama simplificado de níveis de energia mostra potenciais vias de transferência de energia de fluorescência e morte celular. (S0, estado fundamental da molécula fluoróforo; S1, primeiro estado singleto excitado; Sn (n > 1); T1, primeiro estado triplete excitado; Ex, excitação por absorção de fóton; FL, fluorescência)

Além disso, ainda é problema não resolvido como CQDs podem alvejar tumor precisamente e matar células tumorais mais efetivamente. A abundância existente de grupos funcionais hidrofílicos de superfície (carboxila, carbonila, epóxi, hidroxila, hidroxila, etc.) permite pontos de carbono conjugarem com anticorpo específico que poderia alvejar tumores precisamente, e isso requer tumores tenham biomarcadores específicos. Simultaneamente, pontos de carbono também poderiam servir como ferramenta para liberação de fármacos e genes devido à sua alta razão área de superfície/volume [43]. Considerando a excelente biocompatibilidade, tamanho pequeno para internalização por células tumorais, riqueza em grupos funcionais de superfície e potenciais de bioimagem, pontos de carbono (incluem CQDs) são acreditados tornar-se candidatos teranósticos promissores para terapia de tumor. No entanto, ainda existem desafios e muitos problemas não resolvidos para aplicações de pontos de carbono em nanomedicina e bioimagem. Mais esforços devem ser tomados para promover tradução de nanomedicina relacionada a pontos de carbono de bancada para leito no futuro.

Conclusões

Em resumo, sintetizamos CQDs fotoluminescentes usando o-fenilenodiamina pelo método de plasma. Excitados por laser azul, CQDs com diâmetro de cerca de 3,2 nm emitiram fluorescência amarela. Resultados de Raman, UV-vis, FTIR, e XPS mostraram que mais átomos de carbono estiveram envolvidos em hibridação sp², formando novo grupo orgânico. CQDs sintetizados pelo método de plasma provaram ser sonda eficaz em experimentos de imagem celular, e a fluorescência amarela emitida por CQDs pode marcar claramente células HeLa. Além disso, os CQDs sintetizados mostraram solubilidade favorável, não-tóxicos, e alta biocompatibilidade, que poderiam acelerar sua capacidade de bio-imagem. Adicionalmente, os CQDs excitados poderiam efetivamente matar células HeLa por geração de ROS, que exibiu claramente citotoxicidade fotodinâmica satisfatória dos CQDs in vitro e suportou suas aplicações em TFD.

Métodos Experimentais

Síntese de Pontos Quânticos de Carbono

O sistema de processamento por microplasma é resumido no Arquivo Adicional 1: Figura S1. Um tubo oco de aço inoxidável com diâmetro interno de 180 µm foi conectado a fonte de alimentação de corrente contínua de alta tensão (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) e mantido a 2 mm acima da superfície da solução. Um eletrodo Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) foi conectado ao cátodo da fonte de alimentação e imerso na solução. Então, 400 mg de o-fenilenodiamina (Shanghai, China) foi dissolvido em 40 mL de água desionizada, e 20 mL da solução de o-fenilenodiamina foi adicionada a uma placa de Petri e agitada usando agitador magnético. Durante tratamento por microplasma, gás argônio (Ar) fluiu através do tubo a vazão de 60 sccm, e a corrente CC foi mantida a 17 mA. Após 10 min de tratamento por plasma, o produto marrom-escuro foi dialisado usando membrana de diálise (corte de peso molecular, 500 Da) contra 2 L de água desionizada por 12 h e subsequentemente filtrado através de membrana de ultrafiltração de 0,22 µm. Finalmente, CQDs puros foram obtidos por liofilização.

Caracterização da Estrutura, Composição, e Propriedades Ópticas dos CQDs

O tamanho e morfologia dos CQDs foram caracterizados por MET usando sistema JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japão). Espectroscopia de fluorescência foi realizada usando Espectrômetro de Luminescência Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, EUA). Os espectros de absorção UV/Vis foram medidos usando espectrofotômetro Varian Cary 50 UV-VIS (Palo Alto, CA, EUA). Espectros FTIR foram obtidos usando espectroscópio Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), e espectroscopia Raman foi realizada usando espectrômetro micro-Raman UV 800 (Invia-reflex, UK). Experimentos XPS foram realizados usando sistema Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japão).

Cultura Celular e Ensaio de Citotoxicidade

Células HeLa (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% CO₂. Para estudos de citotoxicidade dos CQDs, células foram contadas e semeadas em placas de 96 poços contendo 200 µL de meio completo a densidade de 6000 células por poço. Após 24 h de cultura, células foram incubadas com CQDs em concentrações de 0, 25, 50, 100, 200, e 400 μg mL⁻¹ por mais 24 h, e então, as viabilidades celulares foram detectadas usando ensaios MTT para avaliar citotoxicidade dos CQDs. Brevemente, estas soluções foram substituídas com 100 µL solução de teste MTT (0,5 mg mL⁻¹) e incubadas por 4 h em incubadora no escuro. O sobrenadante foi removido e os cristais dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO). Finalmente, a absorbância de cada poço foi medida a 490 nm. A densidade óptica foi relacionada à viabilidade celular assumindo 100% viabilidade para amostra controle sem CQDs.

Ensaio MTT também foi usado para avaliar IC50 de CQDs excitados em células HeLa. Brevemente, células HeLa em placa de 96 poços foram incubadas com CQDs em concentrações de 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, e 6400 μg mL⁻¹ por 24 h na incubadora, tratadas com luz a 460 nm por 10 min ou 15 min separadamente, e então cultivadas por mais 24 h. A viabilidade celular de cada poço foi detectada usando ensaio MTT e os dados usados para avaliação IC50.

Imagem Celular

Células a concentração de 2 × 10⁴ mL⁻¹ foram semeadas em prato confocal (diâmetro = 15 mm), cultivadas por 24 h, e lavadas com PBS duas vezes para garantir sem células mortas. Solução de CQD (200 μg mL⁻¹; pH 7) foi adicionada e células incubadas por 6 h. As células foram subsequentemente lavadas com PBS três vezes para remover CQDs não ligados e fixadas com 4% paraformaldeído. Então, as amostras foram observadas usando CLSM (LSM510, Zeiss, Alemanha) com excitação em comprimentos de onda variando de 400 a 450 nm.

Terapia Fotodinâmica e Medição de ROS

Para investigar efeitos antitumorais, células HeLa foram incubadas com 200 μg mL⁻¹ CQDs por 24 h a 37 °C no escuro e tratadas com luz a 460 nm (30 mW cm⁻²) por 5, 10, e 15 min. Após 24 h de incubação, ensaio MTT padrão foi realizado para determinar viabilidade celular relativa. A geração intracelular de ROS foi detectada quimicamente usando método espectrofotométrico com Kit de Ensaio ROS Intracelular Fluorométrico (sigma, EUA). Células foram cultivadas em prato confocal (diâmetro = 15 mm) durante noite para adesão celular. Então, células foram incubadas com 200 μg mL⁻¹ CQDs por 4 h. Subsequentemente, 100 µL/poço de Mistura Mestra de Reação foi adicionado. Após incubação por 1 h, células foram fixadas com 4% paraformaldeído por 10 min, e imagens de fluorescência das células foram observadas por CLSM. Quanto à detecção de produção de ROS, células foram cultivadas em placas de 96 poços com 200 µL meio de cultura. Após 24 h incubação, o meio foi substituído com 100 µL solução de CQDs nas concentrações de 0, 100, 200 μg mL⁻¹, e células incubadas por mais 4 h. Subsequentemente, amostras foram lavadas três vezes com PBS, irradiadas por 15 min ou não, e incubadas com 100 µL/poço Mistura Mestra de Reação por 1 h. Finalmente, intensidade de fluorescência foi detectada usando leitor de fluorescência (excitação 520 nm, emissão 605 nm).

Análises Estatísticas

Experimentos envolvidos neste estudo foram repetidos três vezes, e análises estatísticas foram realizadas usando SPSS19.0. Diferenças entre dois grupos foram comparadas usando teste Mann-Whitney U. IC50 de CQDs excitados em células HeLa foi avaliado usando regressão não-linear. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados e materiais do estudo atual estão disponíveis do autor correspondente mediante solicitação razoável.

Abreviações

TFD:

Terapia fotodinâmica

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

CQDs:

Pontos quânticos de carbono

MET:

Microscópio eletrônico de transmissão

CLSM:

Microscópio confocal a laser

DMEM:

Meio Eagle modificado de Dulbecco

MTT:

3-(4,5-Dimetiltiazolil-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo

DMSO:

Dimetil sulfóxido

IC50:

Concentração inibitória máxima metade