Examinando os papéis do tamanho da gota da emulsão e do surfactante no processo de fabricação baseado na instabilidade interfacial de nanocristais micelares

Resumo

O processo de instabilidade interfacial é um método geral emergente para fabricar micelas encapsuladas em nanocristais (também chamadas de nanocristais micelares) para detecção biológica, imagem e terapia. O presente trabalho utilizou nanocristais semicondutores fluorescentes (pontos quânticos ou QDs) como nanocristais modelo para investigar o processo de fabricação baseado na instabilidade interfacial de micelas encapsuladas por nanocristais. Nossos resultados experimentais sugerem papéis intrincados e entrelaçados do tamanho de gota da emulsão e do surfactante poli (álcool vinílico) (PVA) usado no processo de fabricação de micelas de poli (estireno-b-etilenoglicol) (PS-PEG) encapsuladas em QD. Quando nenhum PVA é usado, nenhuma gota de emulsão e, portanto, nenhuma micela é formada com sucesso; Gotículas de emulsão com tamanhos grandes (~ 25 μm) resultam em dois tipos de micelas encapsuladas por QD, uma das quais é micelas PS-PEG encapsuladas por QD coloidalmente estáveis, enquanto a outra é micelas PVA encapsuladas por QD coloidalmente instáveis; Em contraste, as gotículas de emulsão com tamanhos pequenos (~ 3 μm ou menores) resultam em apenas micelas de PS-PEG encapsuladas em QD coloidalmente estáveis. Os resultados obtidos neste trabalho não apenas ajudam a otimizar a qualidade de micelas encapsuladas por nanocristais preparadas pelo método de instabilidade interfacial para aplicações biológicas, mas também oferecem novos conhecimentos úteis sobre o processo de instabilidade interfacial em particular e automontagem em geral.

Histórico

O potencial de aplicação de nanomateriais, como nanocristais semicondutores fluorescentes (pontos quânticos, QDs) [1,2,3], nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (SPIONs) [4,5,6] e nanopartículas de ouro [7,8,9] , para detecção biomédica, imagem e terapia estão bem estabelecidas após quase duas décadas de pesquisa [10, 11]. Assim, nos últimos anos, o foco da pesquisa de nanobiomateriais mudou de experimentos de prova de conceito para estudos mecanísticos, que visam obter insights e compreensão sistemática sobre processos de fabricação de nanomateriais, relações de estrutura-propriedade de nanomateriais, bem como interações nanomaterial-biossistema e pesquisa translacional, que visa identificar e resolver os principais problemas na tradução de nanomateriais para a indústria e a clínica. O presente trabalho se concentra em obter um novo entendimento sobre um processo emergente de fabricação, conhecido como método de instabilidade interfacial, de nanocristais micelares, que se tornaram uma importante classe de nanobiomateriais.

Uma estratégia principal para solubilizar nanomateriais hidrofóbicos (por exemplo, QDs, SPIONs e nanopartículas de ouro sintetizadas pela síntese de alta temperatura à base de solvente orgânico comumente usada [12,13,14]) em água é usar uma micela para encapsular os nanomateriais hidrofóbicos [ 15,16,17]. Uma micela é um sistema de automontagem clássico, no qual as moléculas anfifílicas formam espontaneamente uma estrutura de núcleo-casca (chamada micela) em um ambiente aquoso, com o segmento hidrofílico das moléculas anfifílicas voltado para fora como a casca da micela e o segmento hidrofóbico voltado para para dentro como o núcleo da micela, para minimizar a energia total do sistema. As micelas têm uma longa história de aplicações como agentes de limpeza e sistemas de distribuição de drogas [18,19,20,21,22], principalmente com base no fato de que as moléculas hidrofóbicas (por exemplo, óleos, muitas drogas anticâncer) podem ser encapsuladas nos núcleos hidrofóbicos das micelas impulsionadas principalmente pela interação hidrofóbica [23]. Mais recentemente, as micelas foram aplicadas para encapsular nanocristais únicos (com cada micela encapsulando um único nanocristal) para imagens e detecção biomédica [24]. Mais recentemente, alguns grupos de pesquisa relataram o uso de uma micela para encapsular vários nanocristais, para multifuncionalidade ou efeitos sinérgicos entre os diferentes nanocristais em uma micela [25,26,27,28,29,30,31,32].

Um método emergente para preparar nanocristais micelares (micelas encapsuladas por nanocristais) é o método de instabilidade interfacial [33,34,35]. O processo de instabilidade interfacial foi relatado pela primeira vez em 2008 por Zhu e Hayward para preparar micelas encapsuladas em nanopartículas de óxido de ferro [33] e foi posteriormente usado por Ruan e Winter et al. para preparar micelas encapsulando QDs e SPIONs em 2010 e micelas encapsulando QDs de diferentes cores de emissão fluorescente em 2011 [25, 26]. O processo de instabilidade interfacial para a preparação de micelas de poli (estireno-b-etilenoglicol) (PS-PEG) encapsuladas em QD envolve duas etapas principais:(1) Formação de gotículas de emulsão de óleo em água. Nesta emulsão, a fase oleosa contém QDs hidrofóbicos e o copolímero em bloco anfifílico PS-PEG dissolvido em um solvente orgânico não polar (clorofórmio no presente trabalho); a fase aquosa contém um surfactante poli (álcool vinílico) (PVA) dissolvido em água; (2) Formação de micelas encapsuladas por nanocristais. Após a evaporação do solvente orgânico, a interface óleo / água da emulsão torna-se instável e a interação hidrofóbica leva o sistema a formar espontaneamente micelas de PS-PEG encapsulando QDs hidrofóbicos. Um indicador simples para a formação bem-sucedida de micelas normalmente usadas nos experimentos é a dramática transformação visual do sistema de uma dispersão leitosa (emulsão) para uma transparente (dispersão nanocristal micelar), graças ao tamanho do nanômetro (diâmetro típico de 30-40 nm ) das micelas. Em experimentos anteriores de Ruan e Winter com o encapsulamento de QDs em micelas de PS-PEG usando o processo de instabilidade interfacial, foi descoberto que, embora esse processo tivesse muitas características positivas, um grande problema era a grande perda frequentemente observada de fluorescência QD do sistema durante o processo de fabricação / armazenamento e a causa da perda de fluorescência era desconhecida. Os objetivos do presente trabalho são duplos:por um lado, pretendemos minimizar a perda de fluorescência de micelas de PS-PEG encapsuladas em QD preparadas pelo processo de instabilidade interfacial; por outro lado, por meio do processo de otimização de tecnologia e aproveitando a fluorescência de QDs como um repórter para seguir o processo de fabricação de materiais nanocompósitos contendo QD, pretendemos obter um novo entendimento sobre o processo geral emergente para a preparação de micelas encapsuladas em nanocristais , ou seja, o processo de instabilidade interfacial. Nossos resultados sugerem que o tamanho da gota de emulsão e o surfactante PVA desempenham papéis importantes no processo de fabricação:cada gota de emulsão funciona essencialmente como um "micro-reator" no qual ocorrem instabilidade interfacial e "reações" de automontagem, com o surfactante PVA sendo necessários para a formação dos “micro-reatores”; Usar um grande tamanho de "micro-reator" (~ 25 μm) leva a uma grande porção de micelas de PVA coloidalmente instáveis ​​encapsuladas por nanocristal, além de micelas de PS-PEG encapsuladas por nanocristal coloidalmente estáveis, ao usar um pequeno tamanho de "micro-reator" (~ 3 μm ou menor, gerado por sonicação ou eletrospray) leva apenas a micelas de PS-PEG encapsuladas em nanocristais estáveis ​​coloidalmente.

Métodos

Materiais

Pontos quânticos de núcleo-shell CdSe / ZnS (QDs, comprimento de onda de emissão 600 nm, coberto com octadecilamina) foram adquiridos da Ocean Nanotech. Poli (estireno-b-etilenoglicol) (PS-PEG) e poli (estireno-b-etilenoglicol) terminado com ácido carboxílico (PS-PEG-COOH) (PS 9,5 k Dalton, PEG 18,0 k Dalton) foram adquiridos na Polymer Source . O poli (álcool vinílico) (PVA) (peso molecular 13–23 kg / mol, 87–89% hidrolisado) foi adquirido da Sigma-Aldrich. O peptídeo Tat (sequência YGRKKRRQRRR) e o peptídeo RGD (Arg-Gly-Asp) foram adquiridos na ChinaPeptides. O cloridrato de 1-etil-3 - (- 3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e o sulfo-NHS foram adquiridos a Sigma-Aldrich. Todos os outros produtos químicos eram de qualidade reagente. A água usada para todos os experimentos foi duplamente destilada e purificada por um sistema de purificação Millipore Milli-Q.

Preparação de nanocristais micelares por meio do processo de instabilidade interfacial

Em um procedimento típico, uma fase oleosa foi formada primeiro pela mistura de QDs (0,1 μM, 0,1 ml) e PS-PEG (10 mg / ml, 20 μl) no solvente orgânico clorofórmio. Seguiu-se a adição de uma fase aquosa (0,6 ml de água contendo 5 mg / ml de PVA). Uma emulsão de óleo em água foi formada por agitação manual (agitando vigorosamente a mistura à mão por 1 min) ou sonicação (sonicação da mistura em um sonicador de banho ShuMei KQ218 por 30 s). Em alguns experimentos, o eletrospray foi usado para gerar gotas de emulsão ultrafina para o processo de instabilidade interfacial [35]. Os diferentes tratamentos foram usados ​​para gerar gotículas de emulsão com tamanhos diferentes para estudar os efeitos do tamanho das gotículas:gotículas de ~ 25 μm (em diâmetro) foram formadas por agitação manual, gotículas de ~ 3 μm (em diâmetro) foram formadas por sonicação e algumas gotículas de cem nanômetros a alguns micrômetros (de diâmetro) foram formadas por eletropulverização. A emulsão foi diluída por um fator adicional de quatro com água ultrapura (2,4 ml). A emulsão foi deixada em uma capela química com agitação magnética a 100 rpm para permitir a evaporação do clorofórmio, levando à formação de QDs micelares. Uma transição visível na aparência de uma dispersão leitosa para uma transparente foi indicativa de formação de micelas bem-sucedida.

Quando o tetrahidrofurano (THF) foi usado como solvente orgânico, uma fase oleosa foi primeiro formada pela mistura de QDs (0,1 μM, 1 ml) e PS-PEG (10 mg / ml, 0,2 ml) em THF. Água desionizada foi adicionada à solução gota a gota (1 gota / 20 s) até o teor de água atingir 50% v / v . A solução foi então misturada por votex por 10-15 min e foi então dialisada contra água desionizada por 2 dias para remover o THF (peso molecular de corte de 100.000 Dalton).

Quando o electrospray foi usado para gerar gotículas para o processo de instabilidade interfacial, a operação foi a seguinte [35]. Foi usada uma configuração de electrospray coaxial. A agulha capilar interna era um capilar de aço inoxidável de calibre 27 (diâmetro externo 500 μm; diâmetro interno 300 μm) e a agulha externa era um conector de três vias de aço inoxidável de calibre 20 (diâmetro externo 1000 μm; diâmetro interno 500 μm). A ponta do bico foi posicionada 0,8 cm acima de um anel de aço aterrado e 10 cm acima de um prato de coleta de vidro. Uma fase oleosa foi formada pela mistura de QDs e PS-PEG e foi então distribuída ao capilar de aço inoxidável interno a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / h usando uma bomba de seringa (SPLab01, Shenzhen, China). As concentrações de PS-PEG e QDs na fase de óleo foram de 5 mg / ml e 0,2 μM, respectivamente. Uma fase aquosa foi preparada por dissolução de PVA em H ₂ desionizado O a 40 mg / ml. A solução aquosa foi fornecida ao anel externo da agulha coaxial a uma taxa de fluxo de 1,5 ml / h usando uma segunda bomba de seringa (SPLab01, Shenzhen, China). Normalmente, a uma tensão na faixa de 6–7 kV, um jato cônico côncavo (cone de Taylor) foi observado na ponta do bico coaxial. Um prato de coleta de vidro contendo 10 ml de água desionizada foi colocado abaixo da ponta do bico para coletar as gotículas. O tempo de eletropulverização (após a formação de um cone de Taylor estável) foi de 30–90 min. Isso foi seguido por mais evaporação na capela química durante a noite. Finalmente, a dispersão na placa de coleta de vidro foi transferida para um tubo de centrífuga de 15 ml para caracterizações.

Caracterizações das propriedades físicas de QDs micelares

A morfologia dos QDs micelares foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, JEOL JEM-2100 (HR)), e todas as amostras investigadas por TEM no presente trabalho foram coradas negativamente por 1% de ácido fosfotúngstico (PTA). O tamanho de partícula foi caracterizado por TEM ou espalhamento dinâmico de luz (DLS). Os espectros fluorescentes foram obtidos por um espectrofotômetro Hitachi F-4600 Fluorescent.

Citotoxicidade de nanomateriais

O estudo de citotoxicidade foi realizado em três linhas celulares de câncer humano bem caracterizadas, a saber, células A549 (epitelial basal alveolar), MCF-7 (mama) e células HeLa (colo do útero) (adquiridas na KeyGen Biotech, China). As células foram mantidas com cultura de DMEM com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (penicilina / estreptomicina) em uma incubadora úmida (37 ° C e 5% de CO ₂ ) Para avaliação da citotoxicidade, as células foram semeadas em placas de 96 poços em 200 μl de meio por 24 h. Em seguida, as células foram incubadas com diferentes concentrações de QDs micelares em meio de cultura fresco a 37 ° C em 5% de CO ₂ atmosfera. Após 24 h de incubação, os meios de cultura com QDs micelares dispersos foram removidos e o ensaio de MTT foi aplicado de acordo com o protocolo do fabricante. Finalmente, a absorbância óptica em cada poço foi medida a 570 nm em um leitor de placas de microtitulação.

Conjugação de micelas PS-PEG-COOH encapsuladas em QD com peptídeos

As micelas de PS-PEG-COOH foram preparadas com o procedimento de instabilidade interfacial descrito acima, com moléculas de PS-PEG-COOH sendo usadas em vez das de PS-PEG. A conjugação com o péptido Tat ou péptido RGD foi então conduzida através do método EDC / sulfo-NHS. Para ativar os grupos carboxila de micelas, 0,3 ml de solução tampão 0,1 M MES contendo 2 mg / ml de EDC e 5 mg / ml de sulfo-NHS foi adicionado à dispersão de micelas (3 ml) e reagiu sem agitação por 30 min em temperatura ambiente . O EDC extra e o sulfo-NHS foram então removidos usando um tubo de ultrafiltração de 30 kD (centrifugação a 10 krpm por 5 min), e a dispersão obtida foi ressuspensa em PBS (1 mL). Posteriormente, 50 μl de peptídeo Tat (2 mg / ml em PBS) ou 50 μl de peptídeo RGD (0,5 mg / ml em PBS) foram adicionados e reagiram por 12 h a 4 ° C, respectivamente. A dispersão QD micelar PS-PEG conjugada com peptídeo obtida foi purificada usando um tubo de ultrafiltração de 50 kD (centrifugação a 10 krpm por 5 min) por três vezes para remover as moléculas de peptídeo extras e ressuspensas em PBS (1 mL).

Imagens de células vivas

A imagem de células vivas foi usada para estudar a internalização celular e o transporte intracelular de QDs micelares de PS-PEG conjugados com peptídeo Tat. As células HeLa (adquiridas da KeyGen Biotech, China) foram semeadas em placas de cultura de tecidos com fundo de vidro em uma confluência inicial de 20% (densidade de semeadura 1 × 10 ⁵ células / ml) em 600 μl de meio (DMEM + 10% de soro fetal bovino) e foram cultivadas por 40 h em 5% de CO ₂ a 37 ° C. Adicionou-se então QDs micelares de PS-PEG conjugados com o peptídeo Tat (10 nM de QDs em meio de cultura de células). Depois de serem incubadas com os QDs micelares por 1 h, as células foram lavadas duas vezes com meio de cultura fresco para remover os QDs micelares livres (a etapa de lavagem foi feita para que o tempo de início do transporte intracelular dos QDs micelares internalizados pudesse ser aproximadamente o mesmo para todas as nanopartículas adicionadas). Após 6 h, cada placa de células foi fotografada por um sistema de imagem de células vivas, que consiste em uma câmara de incubação de células (IX3W, Tokai Hit), um microscópio epi-fluorescente (IX-83, Olympus, com lâmpada de halogênio como fonte de luz ), um sistema confocal de disco giratório (Andor) e uma câmera de dispositivo multiplicador de carga acoplado de elétrons (EMCCD) (Evolve 512, Photometrics). O sistema de imagem confocal de células vivas usado aqui permite a imagem confocal de disco giratório de células vivas cultivadas no estágio de microscópio, o que é particularmente útil para estudar o processo de transporte celular. Ao manter as células vivas cultivadas no estágio do microscópio, pode-se garantir que o processo biológico natural seja monitorado com o mínimo de perturbação. Para contracolorar o núcleo da célula, logo antes da imagem (em um determinado ponto de transporte celular), o corante fluorescente Hoechst 33342 (5 μM em meio de cultura de células) foi incubado com células vivas por 20 min.

A imagem de células vivas também foi aplicada para estudar a ligação específica de QDs micelares PS-PEG conjugados com peptídeo RGD com α _v β ₃ - moléculas integradas, usando um α _v β ₃ -integrina sobre-expressa linha de células (células U87 MG, adquiridas de KeyGen Biotech, China) versus uma linha de células sem α _v β ₃ superexpressão de integrina (células MCF-7, adquiridas na KeyGen Biotech, China). O protocolo de imagem celular acima usado para QDs micelares de PS-PEG conjugados com peptídeo Tat foi adotado, com a modificação principal sendo que a concentração usada para QDs micelares conjugados com peptídeo RGD foi de 100 nM (QDs em meio de cultura de células).

Resultados e discussão

Nós e outros recentemente introduzimos o método de instabilidade interfacial para encapsular nanocristais para formar nanopartículas compostas para aplicações biológicas. No entanto, frequentemente encontramos resultados irreproduzíveis e às vezes conflitantes na intensidade de fluorescência de QDs (QDs foram usados ​​como o modelo de nanocristais aqui). Esta questão precisa ser tratada para tradução para a indústria e a clínica. Muitos fatores (por exemplo, solvente, polímero, temperatura, tamanho do "micro-reator") envolvidos ao longo do processo de fabricação podem levar à perda de fluorescência e resultados irreproduzíveis. Investigamos os vários fatores envolvidos e descobrimos que o tamanho do “micro-reator” (gotícula de emulsão) é um fator chave a este respeito, com o uso de surfactante PVA sendo um fator intimamente relacionado. Abaixo, descrevemos principalmente os resultados sobre os efeitos do tamanho de gota da emulsão, bem como do surfactante PVA.

Comparamos os efeitos de dois métodos diferentes de emulsificação com resistências mecânicas muito diferentes, a saber, agitação manual (agitando vigorosamente a mistura manualmente) e sonicação de banho (sonicação da mistura em um sonicador de banho). Descobrimos que ambos os métodos podem eventualmente levar a dispersões transparentes e homogêneas após a evaporação do solvente orgânico, indicando a formação de micelas encapsuladas por nanocristais bem-sucedida (Fig. 1b, c, parte inferior). Como a aparência visual transparente e homogênea é comumente usada como um indicador simples e conveniente de formação de micelas bem-sucedida no processo de fabricação baseado na instabilidade interfacial, o impacto potencial de diferentes métodos de emulsificação no produto micelar foi previamente esquecido. Usamos microscopia de luz para examinar os tamanhos das gotículas de emulsão geradas por esses dois métodos de emulsificação diferentes, respectivamente, e descobrimos que o método de agitação manual levou a gotículas de ~ 25 μm (de diâmetro), enquanto o método de sonicação de banho levou a ~ 3 μm ( de diâmetro) uns (Fig. 1b, c, topo). Aproximadamente os tamanhos de 500 gotas foram medidos para cada amostra usando imagens de microscopia de luz para obter o tamanho médio e a distribuição do tamanho. Análise estatística (Student’s t teste) mostra que a diferença entre o tamanho médio das gotas formadas por agitação manual (~ 25 μm) e que por sonicação (~ 3 μm) foi estatisticamente significativa ( P <0,001). É importante ressaltar que também realizamos experimentos de controle para confirmar que esses dois métodos de emulsificação diferentes produzem consistentemente tamanhos de gotículas de emulsão nas duas faixas de tamanho diferentes acima mencionadas, respectivamente:agitação manual com várias durações de tempo diferentes (0,5, 1, 2 e 3 min) todos resultaram em gotículas de emulsão de ~ 25 μm (com distribuição de tamanho semelhante) e sonicação de banho com várias durações de tempo diferentes (0,5, 1 e 2 min), todos resultaram em gotículas de emulsão de ~ 3 μm (com distribuição de tamanho semelhante, Arquivo adicional 1:Figura S1) .

Observação visual das gotículas de emulsão e as micelas encapsuladas em QD resultantes após a evaporação do solvente orgânico. a Nenhum PVA foi usado. Poucas ou nenhuma gota de emulsão foram formadas ( imagem superior ); poucas ou nenhuma micelas encapsuladas em QD foram formadas após a remoção de solvente orgânico ( imagem inferior , a inserção mostra a imagem fluorescente correspondente usando uma lâmpada UV portátil para excitar o vermelho Fluorescência QD). b Agitação manual foi usada para formar gotículas de emulsão. Gotículas de emulsão de ~ 25 μm foram formadas ( imagem superior , a inserção mostra o resultado da medição do tamanho da gota da análise de imagem de 500 gotas). Além disso, a variação de tamanho devido aos diferentes tempos de agitação foi considerada mínima (Fig. S1). Após a remoção do solvente orgânico, uma dispersão transparente e homogênea foi formada, indicando a formação bem-sucedida de micelas encapsuladas em nanocristais ( imagem inferior , a inserção mostra a imagem fluorescente correspondente usando uma lâmpada UV portátil para excitar o vermelho Fluorescência QD). c O banho de sonicação foi usado para formar gotículas de emulsão. Gotículas de emulsão de ~ 3 μm foram formadas ( imagem superior , a inserção mostra o resultado da medição do tamanho da gota da análise de imagem de 500 gotas). Além disso, a variação de tamanho devido aos diferentes tempos de agitação foi considerada mínima (Fig. S1). Após a remoção do solvente orgânico, uma dispersão transparente e homogênea foi formada, indicando a formação bem-sucedida de micelas encapsuladas por nanocristais ( imagem inferior , a inserção mostra a imagem fluorescente correspondente usando uma lâmpada UV portátil para excitar o vermelho Fluorescência QD). Para analisar o tamanho das gotículas de emulsão de uma amostra particular, em primeiro lugar, uma imagem de microscopia de luz das gotículas de emulsão foi tirada e, posteriormente, os diâmetros de ~ 500 gotículas foram medidos pelo software livre ImageJ para obter o tamanho médio e distribuição de tamanho de as gotículas de emulsão da amostra

Além disso, também conduzimos o tratamento de emulsificação na ausência do surfactante PVA e descobrimos que virtualmente nenhuma gota de emulsão foi formada com sucesso, a julgar pelo resultado da microscopia de luz (Fig. 1a, topo), e virtualmente, nenhuma micela foi formada com sucesso, a julgar por a observação da separação de fases quase completa (precipitação QD) no produto final, ou seja, falha na formação do produto micelar (Fig. 1a, parte inferior). Os resultados da Fig. 1a sugeriram que o surfactante PVA é necessário no processo de instabilidade interfacial para a formação bem-sucedida de gotículas de emulsão (como os “micro-reatores”) e de micelas (como os produtos finais). Isto não é trivial porque sugere que, embora o PS-PEG também seja anfifílico na natureza, a presença de PS-PEG sozinho (sem a presença de PVA) no sistema não pode dar as gotículas de emulsão necessárias para o processo de instabilidade interfacial.

Embora as dispersões do produto parecessem transparentes e homogêneas logo após serem formadas (os resultados de caracterização de TEM e DLS mostraram micelas encapsuladas em QD esféricas e monodispersas, Arquivo adicional 2:Figura S2), a diferença nos tamanhos de gotículas de emulsão dada pelos dois diferentes métodos de emulsificação, ou seja, agitação manual e sonicação, foram encontrados para levar a uma grande diferença nos produtos nanocristais micelares. Medimos e seguimos a mudança de intensidade fluorescente dos QDs micelares (micelas encapsuladas em QD) formados por agitação manual e sonicação, respectivamente, ao longo de um período de tempo de 40 dias a 4 ° C. Descobrimos que, para o micelar, QDs formados por agitação manual (por 1 min, formado a partir de gotículas de emulsão de ~ 25 μm), embora a intensidade fluorescente (medida por espectroscopia fluorescente) tenha sido mantida durante o processo de formação de micela, ao longo do tempo (~ 10 dias) a intensidade de fluorescência dos QDs micelares diminuiu gradualmente para apenas aproximadamente 50% do nível de intensidade de fluorescência original e permaneceu estável depois (Fig. 2a). Em contraste, os QDs micelares formados por sonicação (por 30 s, formados a partir de gotículas de emulsão de ~ 3 μm) mantiveram em grande parte a intensidade fluorescente (medida por espectroscopia fluorescente) ao longo de todo o período de tempo (Fig. 2a). Além disso, usamos os olhos nus para observar a parte inferior das dispersões micelares QD formadas por agitação manual e sonicação, respectivamente, depois que as amostras foram deixadas em repouso por 10 dias a 4 ° C. Na parte inferior do micelar, dispersões QD formadas por agitação manual (por 1 min) após 10 dias de armazenamento, precipitado visível foi observado a olho nu (Fig. 2a, inserção). Em contraste, na parte inferior das dispersões QD micelares formadas por sonicação (por 30 s) após 10 dias de armazenamento, nenhum precipitado visível foi observado a olho nu (Fig. 2a, inserção). Estes resultados sugerem que, embora ambos os métodos de emulsificação possam levar à formação bem-sucedida de micelas encapsuladas em QD com eficiência de encapsulação semelhante, uma grande parte das micelas encapsuladas em QD formadas por gotículas de emulsão maiores (~ 25 μm, produzidas por agitação manual por 1 min ) era coloidalmente instável e ao longo do tempo resultou em precipitação e, portanto, perda de fluorescência da dispersão, enquanto todas as micelas encapsuladas em QD formadas por gotículas de emulsão menores (~ 3 μm, produzidas por sonicação de banho por 30 s) eram coloidalmente estáveis ​​e, assim, mantidas fluorescência por um longo período de tempo (estudo TEM da dispersão após 10 dias de armazenamento também mostrou morfologia bem mantida de nanocristais micelares, como mostrado no arquivo adicional 3:Figura S3). Além disso, descobrimos que, quando o tempo de sonicação foi aumentado de 30 s para 1 e 2 min para formar gotículas de emulsão, a intensidade fluorescente foi drasticamente reduzida, embora as micelas encapsuladas em QD fossem coloidalmente estáveis ​​por um longo período de tempo para os diferentes durações de tempo de tratamento de sonicação a julgar pela intensidade fluorescente estável ao longo do tempo de armazenamento (Fig. 2b). A perda de fluorescência mostrada na Fig. 2b foi provavelmente causada pela geração de defeitos de superfície em QDs pelo tratamento mecânico forte e prolongado. Em um experimento de controle, a intensidade fluorescente de QDs hidrofóbicos dissolvidos em clorofórmio também diminuiu gradualmente sob tratamento de sonicação com aumento do tempo de sonicação (arquivo adicional 4:Figura S4), o que apóia esta causa proposta de perda de fluorescência. Juntos, a Fig. 2a, b revela os dois mecanismos principais de perda de fluorescência no sistema de micelas encapsuladas em QD fabricado pelo processo de instabilidade interfacial, a saber, micelas encapsuladas em QD coloidalmente instáveis ​​e defeitos de superfície QD gerados por tratamento mecânico.

Estabilidade de fluorescência de micelas encapsuladas em QD fabricadas pelo processo de instabilidade interfacial. a Mudança de intensidade de fluorescência (medida por espectroscopia fluorescente) ao longo do tempo para micelas encapsuladas em QD, com as gotículas de emulsão formadas por agitação manual (por 1 min, ou seja, gotas de ~ 25 μm) ou sonicação (por 30 s, ou seja, ~ 3 gotículas μm), respectivamente. As inserções são imagens das dispersões de micelas encapsuladas em QD após 10 dias de armazenamento a 4 ° C com as gotículas de emulsão formadas por agitação manual (por 1 min, ou seja, gotas de ~ 25 μm) ou sonicação (por 30 s, ou seja, ~ 3 gotículas μm), respectivamente. Painel a indica que uma das causas da perda de fluorescência de micelas encapsuladas em QD é a presença de micelas encapsuladas em QD coloidalmente instáveis. b Mudança de intensidade de fluorescência (medida por espectroscopia fluorescente) ao longo do tempo para micelas encapsuladas em QD com as gotículas de emulsão formadas por sonicação (isto é, gotículas de ~ 3 μm) para três durações de tempo de tratamento de sonicação diferentes. Painel b indica que uma das causas da perda de fluorescência de micelas encapsuladas em QD são defeitos de superfície QD gerados por tratamento mecânico forte e prolongado

Entre esses dois mecanismos de perda de fluorescência, embora seja bem conhecido que a perda de fluorescência QD pode ser causada por danos à superfície QD, o resultado de parte das micelas sendo coloidalmente instáveis ​​foi uma surpresa para nós. Assim, conduzimos um estudo mais aprofundado sobre este mecanismo específico. Em primeiro lugar, perguntamos se os QDs precipitados acima mencionados foram ou não encapsulados em micelas (ou estruturas de montagem semelhantes a micelas). Descobrimos que simplesmente agitar a dispersão com esses precipitados poderia levar ao retorno da intensidade fluorescente da dispersão ao nível original (Fig. 3a, à esquerda); em contraste, um estudo de controle sobre o uso do mesmo tratamento para QDs hidrofóbicos precipitados em água não mostrou tal aumento de intensidade fluorescente (Fig. 3a, direita). Além disso, imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da parte inferior das amostras de produto formadas por agitação manual após 10 dias de armazenamento mostraram um grande número de QDs agrupados em grandes estruturas esféricas e não esféricas (Fig. 3b, à esquerda); em contraste, na parte inferior das amostras de produto formadas por sonicação após 10 dias de armazenamento, as imagens TEM correspondentes mostraram apenas um pequeno número de QDs agrupados em estrutura esférica (Fig. 3b, no meio). Estes resultados mostram, assim, que os QDs precipitados foram de fato encapsulados em micelas ou estruturas de montagem semelhantes a micelas, isto é, esses QDs não eram QDs hidrofóbicos nus. Em seguida, perguntamos qual é a natureza química dessas micelas coloidalmente instáveis ​​(ou estruturas de montagem semelhantes a micelas). Como uma micela de PS-PEG deve ser coloidalmente estável, formulamos a hipótese de que as micelas instáveis ​​(ou estruturas de montagem semelhantes a micelas) foram formadas pelo surfactante PVA. Esta hipótese é apoiada pelas seguintes duas linhas de evidência experimental. Em primeiro lugar, descobrimos que o uso de PVA sem PS-PEG no processo de instabilidade interfacial poderia de fato resultar em micelas encapsulando QDs (Fig. 3b, direita). Em segundo lugar, realizamos experimentos de diálise em QDs micelares de PS-PEG e QDs micelares de PVA, respectivamente, para comparação. Após o tratamento de diálise (com o peso molecular de corte da bolsa de diálise sendo 200 kD, que é maior do que os pesos moleculares de PVA e PS-PEG) contra água pura, os QDs micelares PS-PEG permaneceram coloidalmente estáveis, a julgar pelo fato de que a fluorescência QD permaneceu homogênea na dispersão (Fig. 3c, esquerda). Em forte contraste, a dispersão QD micelar de PVA conduziu a agregados fluorescentes claramente visíveis após tratamento de diálise quase idêntico como acima (Fig. 3c, direita). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. a Left , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Left and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), respectively. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. a , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ) c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. a PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ) In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)

Conclusões

In conclusion, we have used QDs as the model nanocrystals to follow the interfacial instability process, an emerging general method to fabricate nanocrystal-encapsulated micelles. Our results reveal the key roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA in the interfacial instability process. These results not only help to optimize the quality of nanocrystal-encapsulated micelles for biological applications such as biological detection, imaging and therapy, but offer helpful new knowledge on the interfacial instability process in particular and self-assembly in general.

Abreviações

EDC:

1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PS-PEG:

Poly (styrene-b-ethylene glycol)

PS-PEG-COOH:

Carboxylic acid terminated poly (styrene-b-ethylene glycol)

PTA:

Phosphotungstic acid

PVA:

Poly (vinyl alcohol)

QD:

Quantum dot

SPION:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticle

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

THF:

Tetrahydrofuran

Síntese One-Pot Green da Microsfera SnO2 Decorada com Ag:um Catalisador Eficiente e Reutilizável para Redução de 4-Nitrofenol Investigações da sorção de íons de metal pesado usando nanocompósitos de biocarvão modificado com ferro