Desenvolvimento de biocompósito de quitosana-óxido de polietileno / fibrinogênio para aplicações potenciais de cicatrização de feridas

Resumo

A cicatrização normal de feridas é um processo altamente complexo que requer a interação de vários fatores de crescimento e tipos de células. Apesar dos avanços nos biomateriais, apenas alguns curativos bioativos para feridas chegam ao ambiente clínico. O objetivo desta pesquisa foi explorar a viabilidade de eletrofiação de um novo arcabouço nanofibroso de quitosana (CS) -fibrinogênio (Fb) capaz de liberação sustentada de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) para a promoção da migração de fibroblastos e cicatrização de feridas. Os scaffolds CS-Fb foram submetidos a eletrofiação com sucesso usando um spinneret dual spinneret e avaliados diretamente quanto às suas características físicas, químicas e biológicas. Os andaimes de polietileno CS / Fb exibiram diâmetros de fibra mais finos do que nanofibras eletrofiadas a partir dos componentes individuais, demonstrando propriedades mecânicas adequadas e distribuição homogênea do polímero. Além disso, o andaime demonstrou taxas de transferência de água aceitáveis ​​para aplicações de cicatrização de feridas. O PDGF foi incorporado com sucesso na estrutura e manteve a atividade funcional ao longo do processo de eletrofiação. Além disso, o PDGF liberado foi eficaz na promoção da migração de fibroblastos equivalente a uma dose única de 50 ng / mL de PDGF. O estudo atual demonstra que scaffolds nanofibrosos de CS-Fb carregados com PDGF possuem características que seriam altamente benéficas como novos curativos bioativos para melhorar a cicatrização de feridas.

Histórico

Apesar dos inúmeros avanços no campo do tratamento de feridas, poucos curativos bioativos têm sido comercializados com a capacidade de potencializar o processo de cicatrização. Essa falta de produto de sucesso pode ser atribuída à complexidade do processo de cicatrização de feridas, que envolve numerosos mediadores solúveis, células sanguíneas, células parenquimatosas e componentes da matriz extracelular (ECM). Os fatores de crescimento desempenham um papel central no processo de cicatrização de feridas, promovendo a proliferação, migração e diferenciação celular. No entanto, a eliminação rápida e meia-vida curta no corpo [1,2,3] limitaram a adoção clínica da terapia com fator de crescimento para a promoção da cura e regeneração do tecido [4, 5]. Atualmente, a administração repetitiva in vivo de fatores de crescimento é necessária para alcançar efeitos terapêuticos (por exemplo, recrutamento e diferenciação celular). O desenvolvimento de um curativo capaz de fornecer fator de crescimento localizado e sustentado melhoraria significativamente os resultados do tratamento e aceleraria a adoção clínica.

O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) desempenha um papel crítico como iniciador e mediador da cicatrização de feridas; atua como um agente quimiotático para neutrófilos, monócitos e fibroblastos [6] e ajuda a regular a deposição da matriz. Além disso, o PDGF pode inibir a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, o que pode afetar as contrações da ferida e diminuir a formação de cicatrizes [6]. PDGF, vendido sob a marca Regranex®, é o único fator de crescimento atualmente aprovado pelo FDA e se destina ao tratamento de úlceras diabéticas de membros inferiores. Aplicação tópica diária de gel Regranex® (2,2 μg / cm ² de úlcera) demonstrou resultar em um tempo de cura 30% mais rápido com o mínimo de efeitos adversos. No entanto, a aplicação tópica diária e a remoção de Regranex® são inconvenientes e podem afetar negativamente a qualidade de vida do paciente.

A eletrofiação foi estabelecida como uma técnica notável na fabricação de estruturas nanofibrosas biomiméticas usando polímeros biologicamente significativos. Numerosos polímeros sintéticos biodegradáveis ​​(por exemplo, policaprolactona) e naturais (por exemplo, colágeno) foram submetidos a eletrofiação em estruturas de nanofibras não tecidas que demonstram altas proporções de área de superfície para volume e características de porosidade, que são importantes para aplicação de drogas e curativos. Polímeros de ocorrência natural (por exemplo, colágeno, elastina e fibrinogênio) são materiais de curativo particularmente atraentes devido à sua bioatividade, biocompatibilidade e capacidade única de se ligar a fatores de crescimento específicos, como PDGF. O fibrinogênio (Fb), uma proteína plasmática globular de 340 kDa, desempenha um papel importante na formação do coágulo por meio de sua forma ativada, a fibrina, que funciona como uma matriz temporária para reparo e regeneração de tecidos. A ausência de Fb e fibrina foi correlacionada com defeitos de cicatrização de feridas [7]. Os produtos à base de Fb demonstram biodegradabilidade, não imunogenicidade e promoção da migração celular e foram desenvolvidos anteriormente como hidrogéis [8,9,10] e cabos de extrusão úmida [11, 12]; entretanto, as propriedades físicas e estruturais desses materiais limitaram sua adoção clínica. Os hidrogéis não têm integridade estrutural e mecânica para uso a longo prazo, e as fibras de extrusão úmida exibem tamanhos de diâmetro exponencialmente maiores (200–250 μm) do que o ECM nativo (200–500 nm). Wnek et al. demonstraram que a eletrofiação, no entanto, oferece a capacidade de fabricar andaimes de Fb que se assemelham a estruturas naturais de MEC [13]. Embora as nanofibras resultantes exibam propriedades mecânicas melhoradas em relação aos hidrogéis, a estrutura ainda carece de propriedades mecânicas ideais para aplicações em curativos [14].

Para melhorar as propriedades mecânicas do arcabouço de fibrinogênio submetido a eletrofiação, polímero adicional poderia ser introduzido para fortalecer as nanofibras [15]. Especificamente, quitosana (CS), um N Foi demonstrado que o derivado desacetilado de quitina produz propriedades antimicrobianas desejáveis ​​em aplicações de curativos [16, 17]. Além de ser um antimicrobiano potente, o CS foi submetido a eletrofiação para várias aplicações biomédicas, incluindo regeneração óssea guiada [18, 19], administração transdérmica de drogas [20], diferenciação direcionada de células-tronco [21] e hemostato [22]. Devido à natureza policatiônica da quitosana, existem dificuldades significativas na eletrofiação usando solventes comuns. Para superar essas dificuldades e melhorar a eletrospinninability, CS foi misturado com vários outros polímeros, como poli (vinil pirrolidona) [23], poli (óxido de etileno) (PEO) [16] e poli (álcool vinílico) [24]. Da mesma forma, a natureza policatiônica de CS limitou a combinação bem-sucedida com Fb em um único andaime devido a fortes interações eletrostáticas. Neste trabalho, essa limitação foi superada pela utilização de um sistema versátil de eletrofiação de bico duplo. Os andaimes nanofibrosos resultantes foram analisados ​​usando várias caracterizações físico-químicas. Nossa hipótese é que o novo arcabouço nanofibroso combinatório CS-Fb apresentaria um candidato viável para um curativo bioativo e biomimético que poderia entregar PDGF e poderia ser eficaz em influenciar a migração de fibroblastos necessária para a cicatrização de feridas.

Métodos

Materiais

Ácido acético (glacial, ≥ 99,85%), CS (baixo peso molecular, 75-85% de desacetilação), PEO (MW 300.000 g / mol), Fb (tipo IS, 65-85% de proteína), 1,1,1, 3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) e albumina de soro bovino (BSA, ≥ 96%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O dimetilsulfóxido (DMSO) foi adquirido na EMD Millipore (Billerica, MA, EUA). Fibroblastos dérmicos humanos (PCS-201-012) e reagentes de cultura de células foram adquiridos na American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Fator de crescimento derivado de plaquetas humano recombinante livre de transportador-BB (rhPDGF-BB) foi adquirido de PeproTech (Rocky Hill, NJ, EUA). Todos os reagentes eram de grau reagente e usados ​​sem purificação ou modificação adicional.

Preparação de andaimes compostos de quitosana-óxido de polietileno / fibrinogênio por eletrofiação

As soluções estoque de quitosana-PEO foram feitas dissolvendo CS e PEO em ácido acético a 1% com BSA (0,5% v / v ) e DMSO (10% v / v ) para obter um teor total de polímero de 5,5% em peso com uma proporção de massa de 2:1 CS para PEO. O óxido de polietileno foi adicionado para melhorar a capacidade de eletrospin CS como descrito anteriormente [16]. As soluções de estoque de fibrinogênio (110 mg / mL) foram feitas dissolvendo Fb em uma parte de meio essencial mínimo de 10 × Eagle (EMEM) e nove partes de HFIP. As soluções estoque de CS-PEO e Fb foram agitadas à temperatura ambiente até estarem completamente dissolvidas. Para andaimes carregados, PDGF foi misturado em cada solução de polímero imediatamente antes da eletrofiação. Os andaimes nanofibrosos de compósito CS-PEO / Fb de eletrofiação foram fabricados usando um sistema de eletrofiação de múltiplos bicos (Fig. 1). As soluções foram carregadas individualmente e bombeadas mecanicamente no sistema usando uma seringa descartável, conectada a uma fieira de calibre 18 e bomba de seringa NE-1000 (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY), a uma taxa de fluxo de 0,7 e 1,0 mL h ^-1 para CS-PEO e Fb, respectivamente. O coletor do mandril, girando a 25 RPM, foi localizado entre as pontas da fieira a uma distância de 22 cm para CS-PEO e 12,5 cm para Fb. Durante o processo de fabricação, tensões DC de 28 e 22 kV foram aplicadas às pontas da fieira para soluções de polímero CS-PEO e Fb, respectivamente. Os andaimes fabricados de nanofibras foram coletados em lamínulas de vidro de 18 cm para ensaios biológicos ou cortados diretamente do mandril para análise de permeabilidade e resistência à tração. Todos os experimentos de eletrofiação foram realizados em temperatura ambiente e umidade relativa de 35–45% por 3 h. As amostras contendo PDGF foram armazenadas a -20 ° C em um dessecador, enquanto os suportes não carregados foram armazenados em um dessecador em temperatura ambiente após a fabricação.

Esquema do eletrospinner dual-spinneret

Morfologia e diâmetro da nanofibra

Os andaimes nanofibrosos eletrofiados foram revestidos por pulverização catódica com ouro e observados usando microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Alemanha). Vinte micrografias foram tiradas por cada estrutura, e três estruturas fiadas individualmente foram analisadas por formulação. Os diâmetros médios das nanofibras foram calculados medindo cinco pontos aleatórios por micrografia usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Um número total de 100 medições foi feito por formulação de andaime.

Caracterização química de superfície

A espectrometria de massa de íons de tempo de voo (ToF-SIMS) foi usada para analisar a química da superfície e as contribuições dos componentes do polímero no andaime. ToF-SIMS é uma metodologia analítica de superfície sensível e aprofundada que avalia a composição química da camada nanométrica superior de um material por bombardeio com Bi de alta energia ₃ ²⁺ clusters sob ultra-alto vácuo [25, 26]. Os fragmentos de íons secundários ejetados da superfície do material são então analisados ​​com base em suas proporções de massa atômica para carga (m / z) e usados ​​para inferir a composição química geral da superfície.

A análise ToF-SIMS foi realizada pelo Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) usando um ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Alemanha) com uma pistola de íons de metal líquido de bismuto (30 kV). O instrumento foi operado em um modo de microssonda de íons, onde três espectros de íons positivos e negativos foram adquiridos de cada amostra. Íons positivos e negativos selecionados foram mapeados em uma área de varredura de 50 × 50 μm com resolução de imagem de 2048 × 2048 pixels para fornecer mapeamento de componentes de polímero dos andaimes. Uma intensidade normalizada, definida como a contagem de cada íon secundário dividido pela contagem total de íons registrados multiplicado por 10.000, foi relatada para cada fragmento. A média de três locais diferentes na superfície de seis amostras fabricadas independentemente foi analisada ( n =6). A distribuição de polímero CS-PEO e Fb analisada por ToF-SIMs foi representativa de todo o arcabouço.

Os ângulos de contato com a água dos andaimes CS-PEO, CS-PEO / Fb e Fb foram determinados de acordo com os Padrões Americanos para Métodos de Teste (ASTM) D7334-08. Os andaimes nanofibrosos foram eletrofiados em lamelas de vidro. Uma única gota de água destilada (2 μL) foi aplicada à superfície do andaime e o ângulo de contato medido em 30 s usando o analisador de forma de gota Krüss DSA10 MK2 (Krüss, Hamburgo, Alemanha). As medições foram repetidas três vezes em locais diferentes para cada amostra, e o ângulo de contato médio foi calculado. Seis estruturas de eletrofiação independentes foram analisadas ( n =6).

Resistência à tração uniaxial mecânica

As propriedades mecânicas dos andaimes de eletrofiação foram medidas à temperatura ambiente usando um Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA) equipado com uma célula de carga 250-N a uma taxa de deformação de 1 mm min ⁻¹ . A espessura das amostras foi medida em seis posições aleatórias por Microscópio de Varredura a Laser 3D Keyence VK-200 (Keyence, Itasca, IL). A espessura dos andaimes usados ​​para o teste de tração foi de 93,8 ± 7,4 μm. Antes do teste, os andaimes foram cortados em corpos de prova retangulares de 40 × 25 mm. Os dados obtidos foram relatados e plotados como curvas tensão-deformação, onde a tensão de tração foi definida como a razão entre a força e a área da seção transversal da amostra e onde a deformação foi definida como a mudança no comprimento sobre o comprimento original. Módulos de Young, tensão de tração e cálculos de deformação na ruptura foram obtidos a partir de curvas de tensão-deformação de uma média de dez amostras por formulação.

Taxa de transferência de vapor de água

A taxa de transferência de vapor de água dos andaimes CS-PEO / Fb foi medida de acordo com o método dessecante ASTM E96 / E96M. Um total de seis amostras submetidas a eletrofiação foram preparadas independentemente por formulação e colocadas na abertura de recipientes de teste contendo dessecante de sílica gel reutilizável em temperatura ambiente e umidade relativa média de 58,2 ± 5,2%. A taxa de transmissão de vapor de água (WVTR) foi calculada a partir do peso dos recipientes de teste medidos em diferentes pontos de tempo ao longo de 48 h:
$$ \ mathrm {WVTR} =\ frac {G} {t \ vezes A} $$ (1)
onde G representa a mudança no peso do recipiente de teste, t é o tempo decorrido, e A é a área da seção transversal do andaime.

Viabilidade celular in vitro

A citotoxicidade indireta dos andaimes foi avaliada com base em uma abordagem adaptada do método de teste padrão ISO10993-5 [27, 28]. Fibroblastos dérmicos humanos foram cultivados a 37 ° C e 5% de CO ₂ em meio de fibroblasto sem soro e atualizado a cada 3 dias. Assim que as células atingiram a confluência, foram tripsinizadas e semeadas em placas de 12 poços (10.000 células / mL). No dia seguinte, a mídia foi reabastecida e os andaimes de nanofibras foram introduzidos. A proliferação celular foi monitorada ao longo de 120 h usando um ensaio de proliferação celular de 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H-tetrazólio de sódio (WST-1).

Visualização de fibroblastos

Fibroblastos dérmicos humanos foram tripsinizados e semeados em estruturas CS-PEO, Fb e CS-PEO / Fb. Após 24 horas de incubação a 37 ° C e 5% de CO ₂ , as células foram lavadas e coradas com o kit de viabilidade celular LIVE / DEAD ™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as especificações do fabricante. Além disso, a adesão e fixação de fibroblastos humanos ao andaime foram avaliadas por coloração com Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich e dicloridrato de 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; ThermoFisher Scientific) de acordo com as especificações do fabricante. Imagens foram observadas e tomadas usando um microscópio confocal invertido (Nikon C1, C1EZ, Melville, NY, EUA).

Degradação In Vitro

A degradação dos scaffolds nanofibrosos CS-PEO / Fb foi realizada em meio basal de fibroblastos (FBM, ATCC) a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Os andaimes foram imersos em FBM e incubados por 1, 6, 24 ou 48 h. O peso seco inicial de cada andaime foi anotado; em cada ponto de tempo, os andaimes foram lavados, liofilizados e pesados ​​novamente. A degradação do andaime foi calculada a partir da seguinte fórmula:
$$ \ mathrm {Degradação} \% =\ left ({W} _0- {W} _ {\ mathrm {t}} \ right) / {W} _0 \ times 100 $$ (2)
onde W ₀ é o peso inicial do andaime, e W _t é o peso do andaime no respectivo ponto no tempo.

Liberação e detecção de PDGF

Os eluatos, coletados em pontos de tempo específicos durante o experimento de degradação in vitro, foram testados usando um kit ELISA específico para rhPDGF-BB (R&D System, Minneapolis, MN). Os valores de absorbância detectados foram comparados a um padrão, conforme especificado pelas instruções do fabricante para a determinação da concentração de PDGF. A quantidade de PDGF detectada foi normalizada para o peso (mg) do suporte correspondente usado.

Propriedade migratória do fator de crescimento derivado de plaquetas liberado

A migração de fibroblastos dérmicos humanos foi avaliada usando o kit de ensaio de migração de células ORIS ™ (Platypus Technologies, Madison, WI) para avaliar a bioatividade de PDGF. Resumidamente, os fibroblastos tratados com mitomicina C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram tripsinizados e semeados em placas de 96 poços contendo rolhas fornecidas pelo fabricante e incubados a 37 ° C e 5% CO ₂ durante a noite. No dia seguinte, as rolhas foram removidas criando zonas de migração às quais 100 μL de eluatos coletados em vários pontos de tempo foram adicionados e incubados por mais 24 h. Preparado de fresco 50 ng mL ⁻¹ PDGF e meio de fibroblasto basal foram usados ​​como controles positivo e negativo, respectivamente. A migração de fibroblastos foi expressa como uma alteração dobrada, em comparação com a migração induzida por 50 ng mL ⁻¹ Tratamento com PDGF. Os estudos foram realizados em triplicata em três experimentos independentes para três concentrações de carga (2, 4 e 8 μg / mL).

Análise estatística

Os dados contínuos foram expressos como média ± desvio padrão. As diferenças entre as médias dos grupos foram analisadas por meio da análise de variância unilateral (ANOVA). O teste de comparação múltipla de Tukey foi usado para determinar quais médias entre um grupo de médias eram estatisticamente diferentes. A significância estatística foi estabelecida em α =0,05. Todos os dados foram analisados ​​usando GraphPad Prism (San Diego, CA, EUA).

Resultados e discussão

A combinação de vários polímeros demonstrou melhorar significativamente as propriedades do composto resultante [29, 30]. Os sistemas de polímeros combinatórios permitem efetivamente a modulação da resistência do andaime, flexibilidade, biodegradação e cinética de liberação de drogas, que são parâmetros importantes para aplicações de curativos. No entanto, a criação de compostos exclusivos pode ser limitada por interações químicas intrínsecas entre os polímeros constituintes. Por exemplo, observou-se a formação de um precipitado de polímero ao misturar Fb carregado negativamente e CS carregado positivamente; esta observação está bem documentada para moléculas com fortes interações eletrostáticas sob várias condições de solvente [31,32,33]. Consequentemente, a fabricação de um andaime de compósito de polímero CS-Fb exigiu o uso de uma técnica de eletrofiação de extrusão dupla, conforme descrito anteriormente [34].

Morfologia das nanofibras CS-PEO / Fb

Os diâmetros médios das fibras para os andaimes CS-PEO, CS-PEO / Fb e Fb foram 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 e 351,1 ± 101,7 nm, respectivamente (Fig. 2). Curiosamente, os andaimes de compósito CS-PEO / Fb exibiram nanofibras mais finas do que os andaimes CS-PEO ou Fb. A diminuição no tamanho do diâmetro da fibra pode ser devido a forças eletrostáticas adicionais geradas por jatos de polímero carregados simultaneamente [35,36,37]. A repulsão dos jatos de polímero para longe um do outro causada por essas forças poderia, portanto, aumentar a distância entre as fieiras e o tempo de deposição. O tempo de deposição prolongado resultante se correlaciona com o aumento das instabilidades de flexão que são conhecidas por causar o alongamento da fibra e a formação de fibra mais fina.

Micrografias FESEM representativas de andaimes eletrofiados. a CS-PEO, diâmetro médio 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO / Fb, diâmetro médio 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, diâmetro médio 351,1 ± 101,7 nm ( n =100)

Caracterização química de superfície via ToF-SIMS e ângulo de contato com água

Os espectros de ToF-SIMS dos scaffolds CS, Fb e PEO são mostrados na Fig. 3. Normalmente, espécies de impressões digitais químicas únicas podem ser usadas para distinguir componentes de polímero individuais. Devido às semelhanças químicas entre CS e Fb, no entanto, havia uma série de espécies contendo nitrogênio (C ₃ H ₆ NÃO ⁺ , CH ₄ N ⁺ , CN ^- e CNO ^- ) presentes em ambos os espectros, tornando difícil distinguir os polímeros um do outro. No entanto, quando Fb foi incorporado ao andaime, o número total de CN ^- e CNO ^- as espécies aumentaram enquanto os outros fragmentos permaneceram inalterados ou diminuíram. Portanto, examinando as mudanças no CN ^- e CNO ^- as intensidades dos fragmentos permitiram a detecção indireta de Fb. Da mesma forma, o aumento de C ₂ H ₅ O ⁺ (45 m / z) íons foram usados ​​para identificar os fragmentos de óxido de etileno do PEO nos andaimes compostos.

Representante a positivo e b espectros de ToF-SIMS de íon negativo para CS puro (superior), Fb (meio) e PEO (inferior). Fragmentos de íons circulados foram utilizados como impressão digital única para identificar o composto

Para elucidar a presença e distribuição de componentes Fb dentro dos andaimes compostos, CNO ^- e CN ^- íons foram mapeados em um raster de 50 × 50 μm dos andaimes prístinos e compostos para obter mapas de calor (Fig. 4a, b). A mesma técnica de mapeamento foi realizada em C ₂ H ₅ O ⁺ para determinar a distribuição de PEO (Fig. 4c). O aumento da intensidade do mapa de calor foi correlacionado com o maior teor de polímero de Fb ou PEO. Observamos que as intensidades do CNO ^- , CN ^- , e C ₂ H ₅ O ⁺ foram uniformemente distribuídos ao longo da área raster de 50 × 50 μm dos andaimes compostos. Devido à espessura dos andaimes (93,8 ± 7,4 μm) e deposição de fibra camada por camada, espera-se que a composição da superfície seja representativa de todo o andaime. Portanto, os dados do ToF-SIM sugerem que, quando os andaimes nanofibrosos CS-PEO / Fb são fabricados usando eletrofiação de fieira dupla, os componentes individuais são depositados uniformemente em todo o andaime composto.

Mapeamento ToF-SIMS de a CNO ^- , b CN ^- , e c C ₂ H ₅ O ⁺ fragmentos de íons em vários andaimes em uma área raster de 50 × 50 μm

Os ângulos de contato com a água dos andaimes fibrosos de eletrofiação CS-PEO, CS-PEO / Fb e Fb foram determinados como sendo 44,2 ° ± 5,1 °, 61,4 ° ± 7,6 ° e 115,7 ° ± 16,2 °, respectivamente (Fig. 5). Com base nos ângulos de contato com a água, os andaimes CS-PEO e CS-PEO / Fb eram hidrofílicos (> 90 °), enquanto os andaimes Fb eram hidrofóbicos (<90 °). Os ângulos de contato com a água dos andaimes de compósito CS-PEO / Fb demonstraram características de superfície que estavam entre as de seus componentes, o que sugere que CS-PEO e Fb foram depositados de forma homogênea durante a fabricação. As características da superfície das superfícies poliméricas desempenham um papel importante na deposição de proteínas e fatores de adesão. Especificamente, importantes fatores de adesão bacteriana são conhecidos por ocorrerem mais prontamente em superfícies hidrofóbicas, que promovem a colonização bacteriana [38]. Como tal, a natureza hidrofílica do CS-PEO / Fb pode ser benéfica na dissuasão da ligação bacteriana.

Comportamento da água desionizada na superfície de um substrato de vidro, CS-PEO, CS-PEO / Fb e andaimes Fb

Resistência mecânica à tração uniaxial de andaimes CS-PEO / Fb

O teste de tração uniaxial foi realizado em andaimes de nanofibras com uma espessura média de 93,8 ± 7,4 μm. Um resumo dos resultados é mostrado na Tabela 1, e as curvas tensão-deformação correspondentes são mostradas na Fig. 6. Geralmente, as propriedades mecânicas dos materiais compósitos estão correlacionadas com seu constituinte mais fraco. Os resultados sugerem que os andaimes apenas com Fb não teriam propriedades mecânicas ideais para aplicações de curativos. Isso enfatiza a importância de incorporar CS-PEO para obter um produto mais estável mecanicamente.

Curvas de tensão-deformação de andaimes CS-PEO, CS-PEO / Fb e Fb. Os dados são representativos de dez andaimes produzidos independentemente

Taxa de transferência de vapor de água de andaimes CS-PEO / Fb

WVTR desempenha um papel vital na manutenção de uma umidade ideal do ambiente da ferida, o que impacta positivamente a granulação celular e epitelização [39, 40]. Valores mais altos de WVTR se correlacionam com a rápida desidratação da ferida devido à evaporação e exsudação, que pode diminuir adversamente a temperatura corporal e aumentar o metabolismo. Por outro lado, valores de WVTR extremamente baixos se correlacionam com o acúmulo de exsudato, inibição da cicatrização e aumento do risco de infecção. Lamke et al. relatou o WVTR para pele normal como 204 ± 12 g m ⁻² dia ⁻¹ e entre 279 e 5138 g m ⁻² dia ⁻¹ para pele ferida, dependendo da condição da ferida [41, 42]. Para epitelização da ferida e melhora na cicatrização, um WVTR ideal de 2028,3 ± 237,8 g m ⁻² dia ⁻¹ foi relatado [43]. WVTRs de andaimes CS-PEO e Fb foram 693,2 ± 95,7 e 686,1 ± 44,17 g m ⁻² dia ⁻¹ , respectivamente. Embora mais próximo do WVTR ideal do que os andaimes originais, os andaimes CS-PEO / Fb (806,5 ± 56,1 g m ⁻² dia ⁻¹ ) ainda estava abaixo do WVTR ideal (Fig. 7). As manipulações dos parâmetros físicos do andaime podem melhorar os WVTRs para imitar melhor as taxas ideais relatadas.

Taxas de transferência de vapor de água dos andaimes eletrofiados CS-PEO, CS-PEO / Fb e Fb. Barras de erro representam o desvio padrão ( n =6, * p <0,05 quando comparado aos andaimes CS-PEO / Fb)

Viabilidade celular in vitro de fibroblastos dérmicos humanos

Os andaimes de quitosana-PEO / Fb não exibiram um efeito proliferativo significativo em fibroblastos humanos durante as 48 h iniciais (Fig. 8); no entanto, a exposição prolongada em 72 h produziu uma redução estatisticamente significativa na proliferação em comparação com o controle sem andaime. Os resultados sugerem que há inibição da proliferação celular exibida pelo scaffold, que pode ser cumulativa ao longo do tempo.

Comparação da proliferação de fibroblastos dérmicos humanos quando expostos a estrutura de eletrofiação Fb e CS-PEO / Fb ( n =9, * p <0,05 comparação feita com "nenhum controle de andaime" em cada ponto de tempo)

A capacidade proliferativa diminuída pode ser devido ao grau de acetilação (DA) associado ao CS, que demonstrou ter fortes interações celulares através de suas cargas positivas [44]. Younes et al. demonstraram que células de carcinoma de bexiga tratadas com SC (> 50% DA) reduziram significativamente a viabilidade após 24 h, sugerindo que a citotoxicidade da SC está diretamente relacionada à sua DA, que pode impactar a proliferação [45]. Este efeito também pode ser isolado em condições experimentais in vitro; estudos anteriores demonstraram que a SC não é tóxica in vivo, pois seus produtos de biodegradação podem ser eliminados por meio de vias metabólicas [46]. O HFIP residual do processo de eletrofiação também pode contribuir para a citotoxicidade observada. No entanto, a mesma citotoxicidade não foi observada no scaffold Fb puro por eletrofiação, que também foi preparado no HFIP. O HFIP foi provavelmente eliminado dos andaimes eletrofiados durante o processo de fabricação devido à sua alta volatilidade. Uma diminuição observável na viabilidade celular seria evidente se HFIP residual incorporado no sistema de fibra fosse liberado durante a exposição cronometrada a fibroblastos dérmicos humanos.

Ensaio LIVE / DEAD e conexão celular

A Figura 9a-c mostra a distribuição e a viabilidade dos fibroblastos dérmicos semeados na superfície do vidro revestido com fibronectina, andaimes CS-PEO / Fb descarregados e andaimes CS-PEO / Fb carregados com PDGF (4 μg / mL). Após 24 h em cultura, células mortas mínimas foram observadas em comparação com as células vivas. Não foram observadas diferenças discerníveis entre os andaimes carregados e não carregados com PDGF.

Micrografias confocais de fibroblastos semeados em a , d vidro revestido com fibronectina; b , e andaime CS-PEO / Fb descarregado; e c , f Estruturas de CS-PEO / Fb carregadas com PDGF (4 μg / mL). a – c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n =6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

Abreviações

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Matriz extracelular

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Factor de crescimento derivado de plaquetas

PEO:

Polyethylene oxide

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate

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