Um Aptasensor Fluorescente à Base de Óxido de Grafeno para a Detecção Ligada de CCRF-CEM

Resumo

Um aptasensor fluorescente conveniente, de baixo custo e altamente sensível para a detecção de leucemia foi desenvolvido com base no complexo de óxido de grafeno-aptâmero (GO-apt). O óxido de grafeno (GO) pode absorver o aptâmero Sgc8 marcado com carboxifluoresceína (FAM-apt) por π - π empilhar e extinguir a fluorescência através da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Na ausência de células alvo Sgc8 CCRF-CEM, a fluorescência é quase totalmente extinta. Por outro lado, quando as células CCRF-CEM são adicionadas, a fluorescência extinta pode ser recuperada rápida e significativamente. Portanto, com base na alteração dos sinais de fluorescência, podemos detectar o número de células CCRF-CEM em uma ampla faixa de 1 × 10 ² para 1 × 10 ⁷ células / mL com um limite de detecção (LOD) de 10 células / mL. Portanto, esta estratégia de aptasensor fluorescente à base de óxido de grafeno pode ser promissora para a detecção de câncer.

Histórico

A leucemia é uma doença hematológica maligna agressiva e comum, que ameaça a sobrevivência do ser humano e a saúde, principalmente de crianças e adolescentes [1, 2]. Afeta não apenas as células hematopoéticas normais do corpo, mas também a medula óssea, bem como o sistema imunológico [3,4,5]. Portanto, o diagnóstico precoce da leucemia para o tratamento e a melhora da qualidade de vida dos pacientes é fundamental. Atualmente, o método comumente utilizado para detecção de leucemia é a coleta de células do sangue periférico e da medula óssea, após vários tipos de análises [6], incluindo morfologia celular, citoquímica [7,8,9], imunofenótipo [10, 11], imunohistoquímica [12, 13], e citometria de fluxo baseada em aptâmero [14, 15], foram realizadas. Esses métodos podem detectar células de leucemia, mas ainda apresentam muitas deficiências, como alto custo, baixa sensibilidade e serem complicados. Portanto, é muito urgente encontrar um método simples, de baixo custo e altamente sensível para detectar a leucemia.

Os aptâmeros, que são DNA de fita simples curta (ssDNA) ou RNA, foram selecionados por triagem in vitro de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) [16, 17]. Com base nas estruturas terciárias especiais, os aptâmeros têm afinidade de ligação robusta e alta especificidade com alvos, incluindo pequenas moléculas orgânicas, proteínas e até mesmo células [18,19,20]. Além disso, aptâmeros também têm as características de serem facilmente sintetizados e modificados, de modo que são amplamente utilizados como sondas de detecção de câncer [21]. Nanomateriais funcionalizados baseados em aptâmeros para detecção de câncer também são hotspots nos últimos anos [22, 23], como pontos quânticos e nanopartículas de sílica [24].

O óxido de grafeno (GO), como um novo nanomaterial de carbono planar bidimensional, tem recebido atenção substancial devido às suas propriedades únicas, incluindo boa solubilidade aquosa [25], grande área de superfície específica e excelente capacidade de extinção de fluorescência [26, 27]. Com base nessas propriedades, o GO é considerado um excelente receptor de energia na transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), o que faz com que o GO tenha uma ampla perspectiva de aplicação em aptasensor de fluorescência [28]. Além disso, GO pode se ligar a aptâmeros por π - π empilhamento de interações, mas não com DNA de fita dupla ou complexos aptâmero-alvo [19, 29, 30]. Portanto, o sensor de aptâmero baseado em grafeno pode melhorar a estabilidade do aptâmero em comparação com a sonda de aptâmero livre [31].

Atualmente, muitas pesquisas relatam que a estratégia de aptasensor fluorescente à base de óxido de grafeno para a detecção de alvos é viável [21, 32]. No entanto, poucos estudos foram realizados usando um aptasensor baseado em GO para células de leucemia, até o momento. Aqui, nós projetamos uma nova estratégia para a detecção de sinal "ligado" de células de leucemia com base em GO e aptâmero Sgc8 marcado com carboxifluoresceína (FAM-apt). GO e aptâmero foram usados como supressor de fluorescência e agente alvo, respectivamente. Na ausência de células de leucemia, o GO pode interagir com o FAM-apt e extinguir quase toda a fluorescência, e o sinal de detecção é desligado. No entanto, quando as células-alvo estão presentes, os aptâmeros alvejam ativamente as células e caem do GO, resultando na recuperação da fluorescência no sistema de detecção e o sinal de detecção ligado. Portanto, a concentração de células alvo pode ser medida correspondentemente de acordo com a mudança na intensidade de fluorescência.

Métodos

Reagentes

O FFAM-apt com uma sequência de 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3 ′ foi sintetizado pela Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Neste trabalho, tampão Tris-HCl auto-regulador foi empregado, incluindo Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl 5 mM ₂ e NaCl 100 mM. Os aptâmeros usados neste experimento foram dissolvidos por tampão Tris-HCl. O pó de óxido de grafeno foi adquirido da Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura de 18 MΩ purificada de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA).

Células

As linhas celulares CCRF-CEM (linhas de células de linfoblastos leucêmicos humanos agudos), Ramos (linhas de células de linfoma de Burkitt humano), 293T (linhas de células de rim embrionário humano) e H22 (linhas de células de carcinoma hepatocelular murino) foram adquiridas no Cell Bank of the Chinese Academia de Ciências (Xangai, China). Todas as linhas celulares foram cultivadas a 5% de dióxido de carbono e 37 ° C, e o meio de 1640 contém 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone) e 100 U / mL de penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA).

Aparelho

Todos os espectros de fluorescência e intensidade de fluorescência foram medidos e registrados por um espectrofotômetro de fluorescência F-7000 (Hitachi Company, Tóquio, Japão). Uma cubeta de quartzo de 700 μL foi usada para conter a solução de amostra. Devido aos comprimentos de onda de pico característicos da carboxilfluoresceína (FAM), a intensidade da luminescência foi monitorada excitando a amostra a 490 nm e medindo a emissão a 518 nm.

Todas as imagens de microscopia de força atômica (AFM) foram obtidas por um microscópio SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tóquio, Japão).

O potencial zeta do GO, FAM-apt e complexo de óxido de grafeno-aptâmero (GO-apt) foi determinado por um tamanho de nanopartícula, potencial zeta e analisador de peso molecular absoluto (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido).

Os espectros de absorbância de UV-visível de GO, FAM-apt e GO-apt foram registrados no NanoDrop 2000 (Thermo, EUA).

Preparação do Aptasensor Fluorescente GO-apt

O pó de óxido de grafeno foi dissolvido e espalhado em água purificada Milli-Q e então disperso por ultrassom para se obter uma solução preta homogênea com a concentração de 1 mg / mL. Diluindo a solução estoque em tampão Tris-HCl 20 mM, obtivemos a concentração de FAM-apt 20 nM. E depois disso, 1 μL de FAM-apt (10 μM) e 10 μL de solução GO (1 mg / mL) preparada foram misturados e depois diluídos com tampão Tris-HCl para 500 μL.

Imagem celular

Células CCRF-CEM e Ramos foram cultivadas por 12 h em placas de seis poços (5 × 10 ⁵ células por poço). As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com solução GO-apt a 4 ° C no escuro por 30 min. Em seguida, as células foram lavadas três vezes e fixadas por 20 min com polioximetileno 4%. As células foram lavadas novamente com PBS e coradas com dicloridrato de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Life Co., EUA) durante 5 min no escuro. Finalmente, as células foram lavadas três vezes com PBS e examinadas por microscopia de fluorescência (Nikon DS-Ri1; Japão).

Detecções de células CCRF-CEM

As células CCRF-CEM foram coletadas por centrifugação e suspensas em 1 mL de PBS. As diferentes concentrações de células CCRF-CEM (0 a 1,0 × 10 ⁷ / mL) foram incubados com um aptasensor fluorescente GO-apt a 4 ° C no escuro por 30 min. Após a incubação, as células CCRF-CEM foram detectadas por espectroscopia de fluorescência na faixa de comprimento de onda de 560–500 nm. O limite de detecção (LOD) é estimado com base em 3 σ / S cálculo, onde σ é o desvio padrão para a solução GO-apt ( n =10) e S é a inclinação da equação linear [33].

Ensaio de especificidade

Para investigar a especificidade do aptasensor fluorescente baseado em GO, testamos o sistema com várias células diferentes, incluindo células Ramos, células H22 e células 293T. Cada um dos sistemas de reação de 100 μL incluiu 1 × 10 ⁶ células.

Análises estatísticas

Cada experimento foi repetido três vezes. Os dados foram processados no software SigmaPlot 12.5 e as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). O limite de significância em todas as análises foi P <0,0001.

Resultados e discussão

Princípio do Aptasensor Fluorescente GO-apt para detecção de CCRF-CEM

Neste estudo, GO e FAM-apt foram usados para projetar um aptasensor fluorescente para detectar células CCRF-CEM. O princípio do sensor fluorescente para detecção de células CCRF-CEM é mostrado na Fig. 1. Na ausência de células CCRF-CEM, os aptâmeros modificados por FAM são adsorvidos na superfície GO por π - π empilhamento. Como o GO e o fluoróforo estão muito próximos da transferência de energia, então, como um supressor, o GO apaga a fluorescência do FAM. Na presença de células CCRF-CEM, a força de ligação fraca do aptâmero GO permite que o aptâmero caia da superfície GO e se ligue às células, causando a restauração da fluorescência. Portanto, o número de células CCRF-CEM pode ser detectado correspondentemente de acordo com a recuperação da intensidade de fluorescência FAM.

Ilustração esquemática do aptasensor fluorescente GO-apt para detecção de células CCRF-CEM

Têmpera e recuperação de fluorescência

Este processo contínuo de extinção de fluorescência de GO e retorno de fluorescência na presença de células CCRF-CEM pode ser observado por um espectrofotômetro de fluorescência. Todo o processo de detecção com base em aptâmeros de fluorescência GO é mostrado na Fig. 2a. O espectro de fluorescência do FAM-apt em tampão Tris-HCl 25 nM apresenta forte intensidade de fluorescência graças à presença do FAM (Fig. 2a, curva a). No entanto, após a adição de GO, a intensidade de fluorescência foi notavelmente reduzida (Fig. 2a, curva b), indicando que GO foi capaz de extinguir a fluorescência de forma eficiente quando GO e os aptâmeros estavam próximos um do outro e adsorvidos juntos. Surpreendentemente, quando 5 × 10 ⁶ Células CCRF-CEM foram adicionadas, a fluorescência extinta foi capaz de se recuperar no tempo (Fig. 2a, curva c). No entanto, a intensidade de fluorescência do FAM-apt sem conjugação GO não tem nenhuma mudança óbvia quando as células CCRF-CEM foram adicionadas (Fig. 2a, curva d). CCRF-CEM é uma célula não fluorescente (Fig. 2a, curva e); portanto, a recuperação da fluorescência é principalmente devido à dissociação do aptâmero da superfície do grafeno e expondo o grupo fluorescente. Esses experimentos de extinção de fluorescência e recuperação ilustraram claramente que o complexo CCRF-CEM-aptâmero (CEM-apt) pode evitar que FAM-apt seja extinto por GO, e CEM tem afinidade de ligação mais forte para seu aptâmero do que GO. Graças à diferença de estrutura entre o aptâmero de fita simples e o complexo CEM-aptâmero, os aptâmeros na superfície GO podem interagir com o CEM e então se transformar no complexo CEM-aptâmero. Este fenômeno também indica claramente que a ligação do complexo CEM-aptâmero ao aptâmero é mais fraca do que a do GO, permitindo assim que o aptâmero caia da superfície do GO. Como o FAM-apt está localizado longe da superfície GO e a eficiência de transferência de energia é reduzida, a fluorescência é restaurada. A análise estatística dos espectros de emissão de fluorescência do aptâmero Sgc8 marcado com FAM e CCRF-CEM foi realizada em diferentes condições (Fig. 2b).

Viabilidade da detecção Go-apt de células CEM. a Espectros de emissão de fluorescência de células FAM-apt e CCRF-CEM em diferentes condições:(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM, e (e) CCRF-CEM; Apt-FAM (20 nM); GO (25 μg / mL); CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ células). Excitação 490 nm. b Análise estatística dos espectros de emissão de fluorescência de FAM-apt e CCRF-CEM em diferentes condições. NS não significativo. **** P <0,0001

Caracterizações do Aptasensor Fluorescente GO-apt

Para verificar o projeto, obteve-se um GO uniforme e descentralizado. Pela Fig. 3a, sabemos que uma folha GO com a espessura de 1,17 nm possui uma aparência bidimensional típica por AFM. No entanto, o GO-apt com a espessura de 1,94 nm mostrou que o FAM-apt foi absorvido pela superfície GO com sucesso. O potencial zeta do FAM-apt e GO era - 11,35 e - 23,90 mV, respectivamente, mas quando o GO interage de forma não convalente com o FAM-apt, o valor absoluto do potencial zeta aumentou (Fig. 3b). Esses resultados indicaram que os aptasensores foram construídos com sucesso. A partir da Fig. 3c, sabemos que GO exibiu uma forte absorção em 234 nm, que é atribuída ao π - π * transições de ligações C =C aromáticas. O FAM-apt é caracterizado por bandas de absorção da sequência de DNA (260 nm) e FAM (503 nm), enquanto a adição de GO na solução de FAM-apt causa um desvio para o vermelho e a absorbância de FAM a 503 nm é aumentada. A possível razão é que o FAM-apt é adsorvido na superfície do GO, indicando interações eletrônicas entre os dois π sistemas de GO e os corantes no estado fundamental. Portanto, os resultados indicaram que o GO-apt foi construído com sucesso.

Caracterização do GO-apt. a Imagens AFM de GO e CEM-apt. b Potencial zeta de superfície de FAM-apt, GO e CEM-apt. Barras de erro indicam ± SD ( n =3). c Espectros de absorvância UV-visível de (a) GO, (b) FAM-apt, e (c) GO-apt

Microscopia de fluorescência de células

Para visualizar diretamente a especificidade da ligação de FAM-apt caído no nível celular, incubamos as células CCRF-CEM e Ramos com Go-apt e depois as analisamos usando microscopia de fluorescência. Consistente com os experimentos espectrais de fluorescência, FAM-apt pode cair de Go-apt e, em seguida, ligar a células CCRF-CEM para coloração fluorescente, mas não a células Ramos (Fig. 4).

Micrografias de fluorescência de células CCRF-CEM e Ramos após mistura com GO-apt. Os núcleos foram corados com DAPI. Barras de escala indicam 25 μm

Otimização de condições experimentais para detecção de CCRF-CEM

A fim de obter o excelente desempenho do aptasensor fluorescente, o tempo de extinção de fluorescência e recuperação foram otimizados. Os comportamentos cinéticos do FAM-apt e GO, bem como do FAM-apt em solução homogênea GO com células CCRF-CEM, foram investigados monitorando a intensidade de fluorescência em função do tempo de extinção e recuperação (Fig. 5a, b). Como mostrado na Fig. 5a, a extinção de fluorescência de FAM-apt como uma função do tempo de incubação na presença de GO pode ser observada. O FAM-apt é rapidamente absorvido pela superfície do GO e, em seguida, sofre transferência de energia, ao mesmo tempo que a intensidade da fluorescência é significativamente reduzida e tende a desacelerar após 2 min. Em contraste, CEM-apt é formado e a liberação da superfície GO é mais lenta. A intensidade de fluorescência atingiu uma plataforma quando o tempo de incubação foi superior a 30 min (Fig. 5b). Estas experiências dependentes do tempo mostram que o GO, como um excelente inibidor, extingue rapidamente a fluorescência FAM-apt e recupera gradualmente a fluorescência na presença de CEM.

Otimização das condições experimentais. a Extinção de fluorescência de FAM-apt (20 nM) em tampão Tris-HCl por GO em função do tempo. b Restauração de fluorescência de FAM-apt em solução GO por CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ) em função do tempo. c Efeito da concentração de GO na intensidade de fluorescência do FAM-apt na ausência (curva a) e na presença (curva b) de 1 × 10 ⁶ Células CCRF-CEM. d A taxa de intensidade de fluorescência ( F / F ₀ ) de FAM-apt por 1 × 10 ⁶ Células CCRF-CEM em função da concentração de GO. Excitação 490 nm

Para tornar o aptasensor fluorescente mais sensível à detecção de CCRF-CEM, o sistema de reação utilizado para otimizar a concentração de GO torna-se indispensável. A Figura 5c, que ilustra claramente nossa estratégia, mostra o efeito de diferentes concentrações de GO na intensidade de fluorescência de FAM-apt na ausência (Fig. 5c, curva a) e na presença (Fig. 5c, curva b) de CCRF -CEM. Como vimos na Fig. 5c, após a adição de GO, o fundo do sinal de fluorescência é significativamente reduzido. A Figura 5d mostra a fluorescência restaurada do FAM-apt por 1 × 10 ⁶ Células CEM em função da concentração de GO. Na Fig. 5d, podemos descobrir que quando a concentração de GO é de 20 μg / mL, a proporção de F / F ₀ (onde F ₀ e F são as intensidades de fluorescência de FAM em 518 nm na ausência e presença de CCRF-CEM, respectivamente) obtém o valor mais alto, que é 13,0354. Portanto, 20 μg / mL foi considerado a concentração ideal de GO.

Detecção CCRF-CEM com Aptasensor Fluorescente GO-apt

A fim de obter bons resultados experimentais, condições experimentais ótimas foram usadas para detectar CCRF-CEM. A Figura 6a mostra que com o aumento do número de CCRF-CEM de 0 a 1 × 10 ⁷ , a intensidade de fluorescência também é aumentada em conformidade. Além disso, o F / F ₀ mostra uma dependência linear clara do número de CCRF-CEM na faixa de 1 × 10 ² –1 × 10 ⁷ (Fig. 6b). A equação de regressão linear é Y ( F / F ₀ ) =3,2608 × log C - 5,1892 (onde C é o número de CCRF-CEM) com o coeficiente de regressão R ² =0,9922. O limite de detecção é considerado inferior a dez células. Portanto, a detecção de aptâmero de fluorescência baseada em GO tem uma ampla faixa de detecção para que possa ser usada como um biossensor ideal para detectar CCRF-CEM. Comparado com os outros métodos, este método apresenta maior sensibilidade (Tabela 1) [34,35,36,37,38,39].

Detecção Go-apt de células CEM. a Espectros de emissão de fluorescência do aptasensor fluorescente GO-apt na presença de diferentes concentrações de células CCRF-CEM. b Relação linear entre a taxa de intensidade de fluorescência ( F / F ₀ ) e a concentração de células CCRF-CEM

Especificidade do Aptasensor Fluorescente GO-apt

Para investigar a especificidade dos adaptadores fluorescentes GO-apt, várias células diferentes foram usadas para testar o sistema, como células Ramos, células H22 e células 293T. Cada um dos sistemas de reação de 100 μL incluiu 1 × 10 ⁶ células. A Figura 7 mostra que o CCRF-CEM obtém maior intensidade de fluorescência do que os outros grupos de controle. Os resultados também indicaram claramente que o aptasensor fluorescente projetado é altamente específico.

Especificidade do aptasensor fluorescente para CEM. A taxa de intensidade de fluorescência ( F / F ₀ ) de aptasensor fluorescente GO-apt na presença de células CEM, células Ramos, células H22 e células 293T, respectivamente (1 × 10 ⁶ ), onde F ₀ e F são a intensidade de fluorescência sem e com células de detecção em 518 nm. Excitação 490 nm

Conclusões

Nós desenvolvemos um aptasensor fluorescente conveniente, de baixo custo e altamente sensível para a detecção de células CCRF-CEM. Esta estratégia usa habilmente a interação de ligação não covalente pelo π - π empilhamento entre grafeno e DNA de fita simples e o desempenho superior da fluorescência de extinção de grafeno. Em comparação com o aptâmero, a ligação do complexo CEM-aptâmero ao GO é fraca, de modo que a fluorescência extinta pelo grafeno pode ser restaurada gradualmente. Em condições otimizadas, o limite de detecção é considerado inferior a 100 células. Portanto, com base em seu excelente desempenho, o aptasensor fluorescente tem uma ampla perspectiva na detecção de células tumorais.

Histórico de alterações

Abreviações

AFM:: Força atômica microscópica
CEM-apt:: Complexo CCRF-CEM-aptâmero
FAM-apt:: Aptâmero Sgc8 rotulado com FAM
FRET:: Transferência de energia de ressonância de fluorescência
GO:: Óxido de grafeno
GO-apt:: Complexo de óxido de grafeno-aptâmero
PBS:: Salina tamponada com fosfato

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