Aptassensor Fluorescente de Óxido de Grafeno de Alta Sensibilidade para Detecção Rápida de Células de Leucemia CCRF-CEM

Resumo

Um aptassensor fluorescente conveniente, de baixo custo e altamente sensível para detecção de leucemia foi desenvolvido baseado em complexo óxido de grafeno-aptâmero (GO-apt). Óxido de grafeno (GO) pode adsorver aptâmero Sgc8 marcado com carboxifluoresceína (FAM-apt) por empilhamento π-π e extinguir a fluorescência através de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Na ausência de células-alvo Sgc8 CCRF-CEM, a fluorescência é quase totalmente extinta. Inversamente, quando células CCRF-CEM são adicionadas, a fluorescência extinta pode ser recuperada rápida e significativamente. Portanto, baseando-se na mudança de sinais de fluorescência, podemos detectar o número de células CCRF-CEM em ampla faixa de 1 × 10² a 1 × 10⁷ células/mL com limite de detecção (LOD) de 10 células/mL. Portanto, esta estratégia de aptassensor fluorescente baseado em óxido de grafeno pode ser promissora para detecção de câncer.

Introdução

Leucemia é uma doença hematológica maligna agressiva e comum, que ameaça a sobrevivência de seres humanos e saúde, especialmente crianças e adolescentes [1, 2]. Afeta não apenas as células hematopoiéticas normais do corpo mas também a medula óssea, bem como o sistema imune [3,4,5]. Portanto, o diagnóstico precoce de leucemia para tratamento e melhora da qualidade de vida dos pacientes é essencial. Atualmente, o método comumente usado para detectar leucemia é coletar células sanguíneas periféricas e medula óssea, após o que muitos tipos de análise [6] têm sido realizadas, incluindo morfologia celular, citoquímica [7,8,9], imunofenótipo [10, 11], imuno-histoquímica [12, 13], e citometria de fluxo baseada em aptâmeros [14, 15]. Esses métodos podem detectar células de leucemia, mas ainda têm muitas deficiências como alto custo, baixa sensibilidade e complexidade. Portanto, é muito urgente encontrar um método de baixo custo, alta sensibilidade e simples para detectar leucemia.

Aptâmeros, que são DNA de fita simples (ssDNA) ou RNA curtos, foram selecionados por triagem in vitro de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) [16, 17]. Baseados em estruturas terciárias especiais, aptâmeros têm afinidade de ligação robusta e alta especificidade com alvos, incluindo pequenas moléculas orgânicas, proteínas e até células [18,19,20]. Além disso, aptâmeros também têm características de serem facilmente sintetizados e modificados para que sejam amplamente usados como sondas de detecção de câncer [21]. Nanomateriais funcionalizados baseados em aptâmeros para detecção de câncer também são focos de pesquisa recentes [22, 23], como pontos quânticos e nanopartículas de sílica [24].

Óxido de grafeno (GO), como novo nanomaterial de carbono planar bidimensional, recebeu atenção substancial devido a suas propriedades únicas incluindo boa solubilidade aquosa [25], grande área superficial específica e excelente capacidade de extinção de fluorescência [26, 27]. Baseado nessas propriedades, GO é considerado um excelente receptor de energia em transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), o que faz GO ter ampla perspectiva de aplicação em aptassensor fluorescente [28]. Além disso, GO pode ligar a aptâmeros por interações de empilhamento π-π, mas não com DNA de fita dupla ou complexos aptâmero-alvo [19, 29, 30]. Portanto, o sensor de aptâmero baseado em grafeno pode melhorar a estabilidade do aptâmero comparado à sonda de aptâmero livre [31].

Atualmente, muitas pesquisas relataram que a estratégia de aptassensor fluorescente baseado em óxido de grafeno para detecção de alvo é viável [21, 32]. No entanto, poucos estudos foram realizados usando aptassensor baseado em GO para células de leucemia, até agora. Aqui, projetamos nova estratégia para detecção 'turn-on' de células de leucemia baseada em GO e aptâmero Sgc8 marcado com carboxifluoresceína (FAM-apt). GO e aptâmero foram usados como extintor de fluorescência e agente alvo, respectivamente. Na ausência de células de leucemia, GO pode interagir com FAM-apt e extinguir quase toda a fluorescência, e o sinal de detecção desliga. No entanto, quando as células-alvo estão presentes, os aptâmeros ativamente visam células e se desprendem do GO, resultando em recuperação de fluorescência no sistema de detecção, e o sinal de detecção liga. Portanto, a concentração de células-alvo pode ser medida correspondentemente de acordo com a mudança na intensidade de fluorescência.

Métodos

Reagentes

FAM-apt com sequência 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' foi sintetizado pela Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Neste trabalho, tampão Tris-HCl autorregulável foi empregado, incluindo 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂ e 100 mM NaCl. Os aptâmeros usados neste experimento foram dissolvidos por tampão Tris-HCl. Pó de óxido de grafeno foi comprado da Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura de 18 MΩ purificada de sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA).

Células

CCRF-CEM (linhagens de células de leucemia linfoblástica aguda humana), Ramos (linhagens de linfoma de Burkitt humano), 293T (linhagens de células renais embrionárias humanas) e H22 (linhagens de carcinoma hepatocelular murino) foram compradas do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China). Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 5% dióxido de carbono e 37 °C, e o meio 1640 contém 10% soro fetal bovino (FBS; HyClone) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA).

Aparelhos

Todos os espectros de fluorescência e intensidade de fluorescência foram medidos e registrados por espectrofotômetro de fluorescência F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Japão). Cubeta de quartzo de 700 µL foi usada para manter a solução de amostra. Devido aos comprimentos de onda de pico característicos de carboxifluoresceína (FAM), a intensidade de luminescência foi monitorada excitando a amostra a 490 nm e medindo emissão a 518 nm.

Todas as imagens de microscopia de força atômica (AFM) foram obtidas por microscópio SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japão).

Potencial zeta do GO, FAM-apt e complexo óxido de grafeno-aptâmero (GO-apt) foi determinado por analisador de tamanho de nanopartícula, potencial zeta e peso molecular absoluto (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).

Espectros de absorbância UV-visível de GO, FAM-apt e GO-apt foram registrados em NanoDrop 2000 (Thermo, EUA).

Preparação do Aptassensor Fluorescente GO-apt

O pó de óxido de grafeno foi dissolvido e disperso em água purificada Milli-Q e então disperso por ultrassom para obter solução preta homogênea com concentração de 1 mg/mL. Diluindo a solução estoque por tampão 20 mM Tris-HCl, obtivemos concentração de 20 nM FAM-apt. E depois, 1 µL FAM-apt (10 µM) e 10 µL solução GO (1 mg/mL) como preparados foram misturados e então diluídos com tampão Tris-HCl a 500 µL.

Imagem Celular

Células CCRF-CEM e Ramos foram cultivadas por 12 h em placas de seis poços (5 × 10⁵ células por poço). Células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato salino frio (PBS) e incubadas com solução GO-apt a 4 °C no escuro por 30 min. Então, células foram lavadas três vezes e fixadas por 20 min com 4% polioximetileno. Células foram lavadas novamente com PBS e coradas com 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloreto (DAPI; Life Co., EUA) por 5 min no escuro. Finalmente, células foram lavadas três vezes com PBS e examinadas por microscopia de fluorescência (Nikon DS-Ri1; Japão).

Detecção de Células CCRF-CEM

Células CCRF-CEM foram coletadas por centrifugação e suspensas em 1 mL PBS. Diferentes concentrações de células CCRF-CEM (0 a 1,0 × 10⁷/mL) foram incubadas com aptassensor fluorescente GO-apt a 4 °C no escuro por 30 min. Após incubação, as células CCRF-CEM foram detectadas por espectroscopia de fluorescência na faixa de comprimento de onda 560-500 nm. O limite de detecção (LOD) é estimado baseado no cálculo 3σ/S, onde σ é o desvio padrão para a solução GO-apt (n = 10) e S é a inclinação da equação linear [33].

Ensaio de Especificidade

Para investigar a especificidade do aptassensor fluorescente baseado em GO, testamos o sistema com várias células diferentes, incluindo células Ramos, H22 e 293T. Cada um dos sistemas de reação de 100 µL incluiu 1 × 10⁶ células.

Análises Estatísticas

Cada experimento foi repetido três vezes. Os dados foram processados pelo software SigmaPlot 12.5, e análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). O limiar de significância em todas as análises foi P < 0,0001.

Resultados e Discussão

Princípio do Aptassensor Fluorescente GO-apt para Detecção de CCRF-CEM

Neste estudo, GO e FAM-apt foram usados para projetar um aptassensor fluorescente para detectar células CCRF-CEM. O princípio do sensor fluorescente para detecção de células CCRF-CEM é mostrado na Fig. 1. Na ausência de células CCRF-CEM, os aptâmeros modificados com FAM são adsorvidos na superfície do GO por empilhamento π-π. Como GO e o fluoróforo estão muito próximos para transferência de energia, assim, como extintor, GO extingue a fluorescência de FAM. Na presença de células CCRF-CEM, a fraca força de ligação do GO-aptâmero permite que o aptâmero se desprenda da superfície do GO e ligue às células, causando restauração da fluorescência. Portanto, o número de células CCRF-CEM pode ser detectado correspondentemente de acordo com a recuperação da intensidade de fluorescência FAM.

Ilustração esquemática do aptassensor fluorescente GO-apt para detecção de células CCRF-CEM

Extinção e Recuperação de Fluorescência

Este processo contínuo de extinção de fluorescência de GO e retorno de fluorescência na presença de células CCRF-CEM pode ser observado por espectrofotômetro de fluorescência. Todo o processo de sensoriamento baseado em aptâmeros de fluorescência GO é mostrado na Fig. 2a. O espectro de fluorescência de FAM-apt em tampão Tris-HCl 25 nM apresenta forte intensidade de fluorescência graças à presença do FAM (Fig. 2a, curva a). No entanto, após adição de GO, a intensidade de fluorescência foi notavelmente reduzida (Fig. 2a, curva b), indicando que GO foi capaz de extinguir eficientemente fluorescência quando GO e os aptâmeros estavam próximos e adsorvidos juntos. Surpreendentemente, quando 5 × 10⁶ células CCRF-CEM foram adicionadas, a fluorescência extinta foi capaz de recuperar a tempo (Fig. 2a, curva c). No entanto, a intensidade de fluorescência de FAM-apt sem conjugação GO não tem mudança óbvia quando células CCRF-CEM foram adicionadas (Fig. 2a, curva d). CCRF-CEM é uma célula não fluorescente (Fig. 2a, curva e); portanto, recuperação de fluorescência é principalmente devido à dissociação do aptâmero da superfície do grafeno e exposição do grupo fluorescente. Esses experimentos de extinção e recuperação de fluorescência ilustram claramente que complexo CCRF-CEM-aptâmero (CEM-apt) pode manter FAM-apt de ser extinto por GO, e CEM tem afinidade de ligação mais forte a seu aptâmero que GO. Graças à diferença de estrutura entre aptâmero de fita simples e complexo CEM-aptâmero, aptâmeros na superfície do GO podem interagir com CEM e então transformar no complexo CEM-aptâmero. Este fenômeno também indica claramente que a ligação do complexo CEM-aptâmero ao aptâmero é mais fraca que a de GO, permitindo assim que o aptâmero se desprenda da superfície do GO. Como o FAM-apt está localizado longe da superfície do GO e a eficiência de transferência de energia é reduzida, a fluorescência é restaurada. Análise estatística de espectros de emissão de fluorescência de aptâmero Sgc8 marcado com FAM e CCRF-CEM foi realizada em diferentes condições (Fig. 2b).

Viabilidade da detecção de células CEM por Go-apt. a Espectros de emissão de fluorescência de FAM-apt e células CCRF-CEM em diferentes condições: (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, e (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 µg/mL); CCRF-CEM (1 × 10⁶ células). Excitação 490 nm. b Análise estatística de espectros de emissão de fluorescência de FAM-apt e CCRF-CEM em diferentes condições. NS não significativo. ****P < 0,0001

Caracterizações do Aptassensor Fluorescente GO-apt

Para verificar o design, GO uniforme e descentralizado foi obtido. Da Fig. 3a, sabemos que uma folha de GO com espessura de 1,17 nm possui aparência bidimensional típica por AFM. No entanto, GO-apt com espessura de 1,94 nm mostrou que FAM-apt foi absorvido à superfície do GO com sucesso. O potencial zeta de FAM-apt e GO foi -11,35 e -23,90 mV, respectivamente, mas quando GO interage não-covalentemente com FAM-apt, o valor absoluto do potencial zeta aumentou (Fig. 3b). Esses resultados indicaram que aptassensores foram construídos com sucesso. Da Fig. 3c, sabemos que GO exibiu forte absorção a 234 nm atribuída a transições π-π* de ligações C=C aromáticas. FAM-apt é caracterizado por bandas de absorção da sequência de DNA (260 nm) e FAM (503 nm), enquanto a adição de GO na solução de FAM-apt causa deslocamento para vermelho e a absorbância de FAM a 503 nm é aumentada. A possível razão é que FAM-apt é adsorvido na superfície do GO, indicando interações eletrônicas entre os dois sistemas π de GO e corantes no estado fundamental. Portanto, os resultados indicaram que GO-apt foi construído com sucesso.

Caracterização de GO-apt. a Imagens AFM de GO e CEM-apt. b Potencial zeta de superfície de FAM-apt, GO e CEM-apt. Barras de erro indicam ± DP (n = 3). c Espectros de absorbância UV-visível de (a) GO, (b) FAM-apt, e (c) GO-apt

Microscopia de Fluorescência de Células

Para visualizar diretamente a especificidade do FAM-apt desprendido ligando ao nível celular, incubamos células CCRF-CEM e Ramos com Go-apt e então as analisamos usando microscopia de fluorescência. Consistente com experimentos espectrais de fluorescência, FAM-apt pode se desprender de Go-apt e então ligar a células CCRF-CEM para coloração fluorescente, mas não a células Ramos (Fig. 4).

Micrografias de fluorescência de células CCRF-CEM e Ramos após mistura com GO-apt. Núcleos corados com DAPI. Barras de escala indicam 25 µm

Otimização de Condições Experimentais para Detecção de CCRF-CEM

Para obter excelente desempenho do aptassensor fluorescente, o tempo de extinção e recuperação de fluorescência foram otimizados. Os comportamentos cinéticos de FAM-apt e GO, bem como FAM-apt em solução GO homogênea com células CCRF-CEM, foram investigados monitorando intensidade de fluorescência como função de tempo de extinção e recuperação (Fig. 5a, b). Como mostrado na Fig. 5a, a extinção de fluorescência de FAM-apt como função de tempo de incubação na presença de GO pode ser observada. O FAM-apt adsorve rapidamente à superfície do GO e, depois disso, sofre transferência de energia, e ao mesmo tempo, a intensidade de fluorescência é significativamente reduzida e tende a desacelerar após 2 min. Em contraste, CEM-apt é formado e a liberação da superfície do GO é mais lenta. A intensidade de fluorescência atingiu platô quando o tempo de incubação foi maior que 30 min (Fig. 5b). Esses experimentos tempo-dependentes mostram que GO, como excelente extintor, extingue rapidamente fluorescência FAM-apt e gradualmente recupera fluorescência na presença de CEM.

Otimização de condições experimentais. a Extinção de fluorescência de FAM-apt (20 nM) em tampão Tris-HCl por GO como função do tempo. b Restauração de fluorescência de FAM-apt em solução GO por CCRF-CEM (1 × 10⁶) como função do tempo. c Efeito da concentração de GO na intensidade de fluorescência de FAM-apt na ausência (curva a) e na presença (curva b) de 1 × 10⁶ células CCRF-CEM. d Taxa de intensidade de fluorescência (F/F₀) de FAM-apt por 1 × 10⁶ células CCRF-CEM como função da concentração de GO. Excitação 490 nm

Para tornar o aptassensor fluorescente mais sensível à detecção de CCRF-CEM, o sistema de reação usado para otimizar a concentração de GO torna-se indispensável. A Figura 5c, que ilustra claramente nossa estratégia, mostra o efeito de diferentes concentrações de GO na intensidade de fluorescência de FAM-apt na ausência (Fig. 5c, curva a) e na presença (Fig. 5c, curva b) de CCRF-CEM. Como vimos na Fig. 5c, após adição de GO, o sinal de fundo de fluorescência é significativamente reduzido. A Figura 5d mostra a fluorescência restaurada de FAM-apt por 1 × 10⁶ células CEM como função da concentração de GO. Da Fig. 5d, podemos encontrar que quando a concentração de GO é 20 µg/mL, a razão de F/F₀ (onde F₀ e F são as intensidades de fluorescência de FAM a 518 nm na ausência e presença de CCRF-CEM, respectivamente) obtém o maior valor, que é 13,0354. Portanto, 20 µg/mL foi considerado a concentração ótima de GO.

Detecção de CCRF-CEM com Aptassensor Fluorescente GO-apt

Para obter bons resultados experimentais, condições experimentais ótimas foram usadas para detectar CCRF-CEM. A Figura 6a mostra que com o aumento do número de CCRF-CEM de 0 a 1 × 10⁷, a intensidade de fluorescência também aumenta correspondentemente. Além disso, F/F₀ mostra clara dependência linear no número de CCRF-CEM na faixa de 1 × 10²–1 × 10⁷ (Fig. 6b). A equação de regressão linear é Y(F/F₀) = 3,2608 × log C − 5,1892 (onde C é o número de CCRF-CEM) com coeficiente de regressão R² = 0,9922. O limite de detecção é considerado menor que dez células. Portanto, sensoriamento de aptâmero fluorescente baseado em GO tem ampla faixa de detecção para que pode ser usado como biossensor ideal para detectar CCRF-CEM. Comparado com outros métodos, este método tem maior sensibilidade (Tabela 1) [34,35,36,37,38,39].

Detecção de células CEM por Go-apt. a Espectros de emissão de fluorescência do aptassensor fluorescente GO-apt na presença de diferentes concentrações de células CCRF-CEM. b Relação linear entre a taxa de intensidade de fluorescência (F/F₀) e a concentração de células CCRF-CEM

Especificidade do Aptassensor Fluorescente GO-apt

Para investigar a especificidade de adaptadores fluorescentes GO-apt, várias células diferentes foram usadas para testar o sistema, como células Ramos, H22 e 293T. Cada um dos sistemas de reação de 100 µL incluiu 1 × 10⁶ células. A Figura 7 mostra que CCRF-CEM obtém maior intensidade de fluorescência que os outros grupos controle. Os resultados também indicaram claramente que o aptassensor fluorescente projetado abraçou ser altamente específico.

Especificidade do aptassensor fluorescente para CEM. A taxa de intensidade de fluorescência (F/F₀) do aptassensor fluorescente GO-apt na presença de células CEM, Ramos, H22 e 293T, respectivamente (1 × 10⁶), onde F₀ e F são a intensidade de fluorescência sem e com células de detecção a 518 nm. Excitação 490 nm

Conclusões

Desenvolvemos um aptassensor fluorescente conveniente, de baixo custo e altamente sensível para detecção de células CCRF-CEM. Esta estrategia inteligentemente usa a interação de ligação não-covalente pelo empilhamento π-π entre grafeno e DNA de fita simples e o desempenho superior de extinção de fluorescência do grafeno. Comparado com o aptâmero, a ligação do complexo CEM-aptâmero a GO é fraca, então a fluorescência extinta pelo grafeno pode ser gradualmente restaurada. Sob condições otimizadas, o limite de detecção é considerado menor que 100 células. Portanto, baseando-se em seu excelente desempenho, o aptassensor fluorescente tem ampla perspectiva em detecção de células tumorais.

Histórico de Alterações

Abreviações

AFM

Microscopia de força atômica

CEM-apt

Complexo CCRF-CEM-aptâmero

FAM-apt

Aptâmero Sgc8 marcado com FAM

FRET

Transferência de energia por ressonância de fluorescência

GO

Óxido de grafeno

GO-apt

Complexo óxido de grafeno-aptâmero

PBS

Tampão fosfato salino