Insulina

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Antecedentes

A insulina é um hormônio que regula a quantidade de glicose (açúcar) no sangue e é necessária para o funcionamento normal do corpo. A insulina é produzida pelas células do pâncreas, chamadas ilhotas de Langerhans. Essas células liberam continuamente uma pequena quantidade de insulina no corpo, mas liberam picos do hormônio em resposta a um aumento no nível de glicose no sangue.

Certas células do corpo transformam os alimentos ingeridos em energia, ou glicose do sangue, que as células podem usar. Cada vez que uma pessoa come, a glicose no sangue aumenta. O aumento da glicose no sangue ativa as células das ilhotas de Langerhans para liberar a quantidade necessária de insulina. A insulina permite que a glicose no sangue seja transportada do sangue para as células. As células têm uma parede externa, chamada membrana, que controla o que entra e sai da célula. Os pesquisadores ainda não sabem exatamente como a insulina funciona, mas sabem que a insulina se liga a receptores na membrana celular. Isso ativa um conjunto de moléculas de transporte para que a glicose e as proteínas possam entrar na célula. As células podem então usar a glicose como energia para realizar suas funções. Uma vez transportado para a célula, o nível de glicose no sangue volta ao normal em algumas horas.

Sem insulina, a glicose do sangue se acumula no sangue e as células ficam sem sua fonte de energia. Alguns dos sintomas que podem ocorrer incluem fadiga, infecções constantes, visão turva, dormência, formigamento nas mãos ou nas pernas, aumento da sede e redução da velocidade de cicatrização de hematomas ou cortes. As células começarão a usar gordura, a fonte de energia armazenada para emergências. Quando isso acontece por muito tempo, o corpo produz cetonas, substâncias químicas produzidas pelo fígado. As cetonas podem envenenar e matar células se se acumularem no corpo por um longo período de tempo. Isso pode levar a doenças graves e coma.

Pessoas que não produzem a quantidade necessária de insulina têm diabetes. Existem dois tipos gerais de diabetes. O tipo mais grave, conhecido como diabetes tipo I ou diabetes juvenil, ocorre quando o corpo não produz insulina. Os diabéticos tipo I geralmente se injetam com diferentes tipos de insulina três a quatro vezes ao dia. A dosagem é medida com base na leitura de glicose no sangue da pessoa, obtida de um medidor de glicose. Os diabéticos do tipo II produzem alguma insulina, mas não é suficiente ou suas células não respondem normalmente à insulina. Isso geralmente ocorre em pessoas obesas ou de meia-idade ou mais velhas. Os diabéticos do tipo II não precisam necessariamente de insulina, mas podem injetar insulina uma ou duas vezes ao dia.

Existem quatro tipos principais de insulina fabricados com base na rapidez com que a insulina começa a funcionar, quando atinge o pico e por quanto tempo dura no corpo. De acordo com a American Diabetes Association, a insulina de ação rápida chega ao sangue em 15 minutos, atinge o pico em 30-90 minutos e pode durar cinco horas. A insulina de ação curta chega ao sangue em 30 minutos, atinge seu pico cerca de duas a quatro horas depois e permanece no sangue por quatro a oito horas. A insulina de ação intermediária chega ao sangue duas a seis horas após a injeção, atinge seu pico de quatro a 14 horas depois e pode durar 14-20 horas no sangue. E a insulina de ação prolongada leva de seis a 14 horas para começar a fazer efeito, tem um pequeno pico logo em seguida e permanece no sangue por 20 a 24 horas. Cada um dos diabéticos tem diferentes respostas e necessidades de insulina, portanto não existe um tipo que funcione melhor para todos. Alguma insulina é vendida com dois dos tipos misturados em um frasco.

História

Se o corpo não produz insulina suficiente ou nenhuma, as pessoas precisam tomar uma versão manufaturada dela. O principal uso da produção de insulina é para diabéticos que não produzem insulina suficiente ou nenhuma insulina naturalmente.

Antes que os pesquisadores descobrissem como produzir insulina, as pessoas que sofriam de diabetes tipo I não tinham chance de ter uma vida saudável. Então, em 1921, os cientistas canadenses Frederick G. Banting e Charles H. Best purificaram com sucesso a insulina do pâncreas de um cão. Ao longo dos anos, os cientistas fizeram melhorias contínuas na produção de insulina. Em 1936, os pesquisadores descobriram uma maneira de fazer insulina com uma liberação mais lenta no sangue. Eles adicionaram uma proteína encontrada no esperma dos peixes, a protamina, que o corpo decompõe lentamente. Uma injeção durou 36 horas. Outro avanço veio em 1950, quando os pesquisadores produziram um tipo de insulina que agia um pouco mais rápido e não permanece na corrente sanguínea por muito tempo. Na década de 1970, os pesquisadores começaram a tentar produzir uma insulina que mais imitava o funcionamento da insulina natural do corpo:liberando uma pequena quantidade de insulina o dia todo, com picos ocorrendo na hora das refeições.

Os pesquisadores continuaram a melhorar a insulina, mas o método básico de produção permaneceu o mesmo por décadas. A insulina foi extraída do pâncreas de bovinos e suínos e purificada. A estrutura química da insulina nesses animais é apenas ligeiramente diferente da insulina humana, razão pela qual ela funciona tão bem no corpo humano. (Embora algumas pessoas tivessem sistema imunológico negativo ou reações alérgicas.) Então, no início dos anos 1980, a biotecnologia revolucionou a síntese de insulina. Os pesquisadores já haviam decodificado a estrutura química da insulina em meados dos anos 1950. Eles logo determinaram a localização exata do gene da insulina no topo do cromossomo 11. Em 1977, uma equipe de pesquisa havia unido um gene da insulina de rato em uma bactéria que então produziu insulina.

Frederick Bonting.

Em 1891, Frederick Banting nasceu em Alliston, Ontário. Ele se formou em 1916 na faculdade de medicina da Universidade de Toronto. Após o serviço do Medical Corps na Primeira Guerra Mundial, Banting se interessou pelo diabetes e estudou a doença na University of Western Ontario.

Em 1919, Moses Barron, pesquisador da Universidade de Minnesota, mostrou que o bloqueio do duto que conecta as duas partes principais do pâncreas causou o encolhimento de um segundo tipo de célula, o acinar. Banting acreditava que, ao desligar o ducto pancreático para destruir as células acinares, ele poderia preservar o hormônio e extraí-lo das células das ilhotas. Banting propôs isso ao chefe do Departamento de Fisiologia da Universidade de Toronto, John Macleod. Macleod rejeitou a proposta de Banting, mas forneceu espaço de laboratório, 10 cães e um estudante de medicina, Charles Best

Começando em maio de 1921, Banting e Best amarraram os dutos pancreáticos em cães para que as células acinares atrofiassem e, em seguida, removeram os pâncreas para extrair fluido das células das ilhotas. Enquanto isso, eles removeram o pâncreas de outros cães para causar diabetes e, em seguida, injetaram o fluido das células das ilhotas. Em janeiro de 1922, Leonard Thompson, de 14 anos, se tornou o primeiro ser humano a ser tratado com sucesso para diabetes usando insulina.

Best recebeu seu diploma de médico em 1925. Banting insistiu que Best também recebesse o crédito e quase recusou o Prêmio Nobel porque Best não foi incluído. Best tornou-se chefe do departamento de fisiologia da Universidade de Toronto em 1929 e diretor do Banting and Best Department of Medical Research da universidade após a morte de Banting em 1941.

Na década de 1980, os pesquisadores usaram a engenharia genética para fabricar uma insulina humana. Em 1982, a Eli Lilly Corporation produziu uma insulina humana que se tornou o primeiro produto farmacêutico geneticamente modificado aprovado. Sem a necessidade de depender de animais, os pesquisadores poderiam produzir insulina geneticamente modificada em suprimentos ilimitados. Ele também não continha nenhum dos contaminantes animais. O uso de insulina humana também eliminou quaisquer preocupações sobre a transferência de quaisquer doenças animais em potencial para a insulina. Embora as empresas ainda vendam uma pequena quantidade de insulina produzida a partir de animais - principalmente porcina - da década de 1980 em diante, os usuários de insulina mudaram cada vez mais para uma forma de insulina humana criada por meio da tecnologia de DNA recombinante. De acordo com a Eli Lilly Corporation, em 2001, 95% dos usuários de insulina na maior parte do mundo tomavam alguma forma de insulina humana. Algumas empresas pararam de produzir insulina animal completamente. As empresas estão se concentrando na síntese de insulina humana e análogos da insulina, uma modificação da molécula de insulina de alguma forma.

Matérias-primas

A insulina humana é cultivada em laboratório dentro de bactérias comuns. Escherichia coli é de longe o tipo de bactéria mais amplamente usado, mas também se usa levedura.

Os pesquisadores precisam da proteína humana que produz insulina. Os fabricantes obtêm isso por meio de uma máquina de sequenciamento de aminoácidos que sintetiza o DNA. Os fabricantes sabem a ordem exata dos aminoácidos da insulina (as moléculas baseadas em nitrogênio que se alinham para formar as proteínas). Existem 20 aminoácidos comuns. Os fabricantes inserem os aminoácidos da insulina e a máquina de sequenciamento conecta os aminoácidos. Também são necessários para sintetizar a insulina grandes tanques para o crescimento da bactéria, e os nutrientes são necessários para o crescimento da bactéria. Vários instrumentos são necessários para separar e purificar o DNA, como uma centrífuga, junto com vários instrumentos de cromatografia e cristalografia de raios-x.

O processo de fabricação

Sintetizar a insulina humana é um processo bioquímico de várias etapas que depende de técnicas básicas de DNA recombinante e da compreensão do gene da insulina. O DNA carrega as instruções de como o corpo funciona e um pequeno segmento do DNA, o gene da insulina, codifica a proteína insulina. Os fabricantes manipulam o precursor biológico da insulina para que cresça dentro de bactérias simples. Embora cada fabricante tenha suas próprias variações, existem dois métodos básicos para a fabricação de insulina humana.

Trabalho com insulina humana

• 1 O gene da insulina é uma proteína que consiste em duas cadeias separadas de aminoácidos, um A acima de uma cadeia B, que são mantidas juntas por ligações. Os aminoácidos são as unidades básicas que constroem todas as proteínas. A cadeia A da insulina consiste em 21 aminoácidos e a cadeia B tem 30.
• 2 Antes de se tornar uma proteína insulínica ativa, a insulina é produzida pela primeira vez como pré-pró-insulina. Esta é uma única cadeia longa de proteína com as cadeias A e B ainda não separadas, uma seção no meio que liga as cadeias e uma sequência de sinal em uma extremidade informando à proteína quando começar a segregar fora da célula. Após a pré-pró-insulina, a cadeia evolui para pró-insulina, ainda uma única cadeia, mas sem a sequência de sinalização. Em seguida, vem a proteína insulina ativa, a proteína sem a seção que liga as cadeias A e B. Em cada etapa, a proteína precisa de enzimas específicas (proteínas que realizam reações químicas) para produzir a próxima forma de insulina.

COMEÇANDO COM A E B

• 3 Um método de fabricação de insulina é fazer crescer as duas cadeias de insulina separadamente. Isso evitará a fabricação de cada uma das enzimas específicas necessárias. Os fabricantes precisam de dois minigenes:um que produz a cadeia A e outro para a cadeia B. Como a sequência exata de DNA de cada cadeia é conhecida, eles sintetizam o DNA de cada minigene em uma máquina de sequenciamento de aminoácidos.
• 4 Essas duas moléculas de DNA são então inseridas em plasmídeos, pequenos pedaços circulares de DNA que são mais prontamente absorvidos pelo DNA do hospedeiro.
• 5 Os fabricantes primeiro inserem os plasmídeos em um tipo não prejudicial da bactéria E. coli. Eles o inserem ao lado do lacZ gene. LacZ codifica a 8-galactosidase, um gene amplamente utilizado em procedimentos de DNA recombinante por ser fácil de localizar e cortar, permitindo que a insulina seja facilmente removida para que não se perca no DNA da bactéria. Ao lado desse gene está o aminoácido metionina, que inicia a formação da proteína.
• 6 Os plasmídeos recombinantes, recém-formados, são misturados às células bacterianas. Os plasmídeos entram na bactéria em um processo denominado transfecção. Os fabricantes podem adicionar DNA ligase às células, uma enzima que atua como cola para ajudar o plasmídeo a aderir ao DNA da bactéria.
• 7 A bactéria que sintetiza a insulina passa então por um processo de fermentação. Eles são cultivados em temperaturas ideais em grandes tanques em fábricas. Os milhões de bactérias se replicam aproximadamente a cada 20 minutos por meio da mitose celular, e cada uma expressa o gene da insulina.
• 8 Após a multiplicação, as células são retiradas dos tanques e abertas para extrair o DNA. Uma maneira comum de fazer isso é primeiro adicionando uma mistura de lisozoma que digere a camada externa da parede celular e, em seguida, adicionando uma mistura de detergente que separa a membrana da parede celular gordurosa. O DNA da bactéria é então tratado com brometo de cianogênio, um reagente que divide as cadeias de proteínas nos resíduos de metionina. Isso separa as cadeias de insulina do resto do DNA.
• 9 As duas cadeias são então misturadas e unidas por ligações dissulfeto por meio da reação de redução-reoxidação. Um agente oxidante (um material que causa a oxidação ou a transferência de um elétron) é adicionado. O lote é então colocado em uma centrífuga, um dispositivo mecânico que gira rapidamente para separar os componentes da célula por tamanho e densidade.
• 10 A mistura de DNA é então purificada de forma que apenas as cadeias de insulina permaneçam. Os fabricantes podem purificar a mistura por meio de várias técnicas de cromatografia, ou separação, que exploram as diferenças na carga, tamanho e afinidade da molécula com a água. Os procedimentos usados ​​incluem uma coluna de troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e uma coluna de cromatografia de filtração em gel. Os fabricantes podem testar lotes de insulina para garantir que nenhuma das bactérias E. coli as proteínas são misturadas à insulina. Eles usam uma proteína marcadora que os permite detectar E. coli DNA. Eles podem então determinar que o processo de purificação remove a E. coli bactérias.

PROCESSO DE PROINSULINA

• 11 A partir de 1986, os fabricantes começaram a usar outro método para sintetizar a insulina humana. Eles começaram com o precursor direto do gene da insulina, a pró-insulina. Muitas das etapas são as mesmas da produção de insulina com as cadeias A e B, exceto que neste método a máquina de aminoácidos sintetiza o gene da pró-insulina.
• 12 A sequência que codifica a pró-insulina é inserida na E. coli não patogênica bactérias. A bactéria passa pelo processo de fermentação onde se reproduz e produz a pró-insulina. Em seguida, a sequência de conexão entre as cadeias A e B é removida com uma enzima e a insulina resultante é purificada.
• 13 No final do processo de fabricação, os ingredientes são adicionados à insulina para prevenir bactérias e ajudar a manter um equilíbrio neutro entre ácidos e bases. Ingredientes também são adicionados à insulina de ação intermediária e longa para produzir o tipo de insulina de duração desejada. Este é o método tradicional de produção de insulina de ação prolongada. Os fabricantes adicionam ingredientes à insulina purificada que prolongam suas ações, como o óxido de zinco. Esses aditivos retardam a absorção no corpo. Os aditivos variam entre as diferentes marcas do mesmo tipo de insulina.

Insulina analógica

Em meados da década de 1990, os pesquisadores começaram a melhorar a forma como a insulina humana funciona no corpo, alterando sua sequência de aminoácidos e criando um análogo, uma substância química que imita outra substância bem o suficiente para enganar a célula. A insulina analógica se aglomera menos e se dispersa mais rapidamente no sangue, permitindo que a insulina comece a agir no corpo minutos após a injeção. Existem várias insulinas analógicas diferentes. A insulina humulin não possui fortes ligações com outras insulinas e, portanto, é absorvida rapidamente. Outro análogo da insulina, chamado Glargine, altera a estrutura química da proteína para torná-la uma liberação relativamente constante ao longo de 24 horas, sem picos pronunciados.

Em vez de sintetizar a seqüência exata de DNA para a insulina, os fabricantes sintetizam um gene da insulina em que a seqüência é ligeiramente alterada. A mudança faz com que o resultado Um diagrama das etapas de fabricação da insulina. proteínas se repelem, o que causa menos aglomeração. Usando esta sequência de DNA alterada, o processo de fabricação é semelhante ao processo de DNA recombinante descrito.

Controle de qualidade

Depois de sintetizar a insulina humana, a estrutura e a pureza dos lotes de insulina são testadas por meio de vários métodos diferentes. A cromatografia líquida de alto desempenho é usada para determinar se há impurezas na insulina. Outras técnicas de separação, como cristalografia de raios-X, filtração em gel e sequenciamento de aminoácidos, também são realizadas. Os fabricantes também testam a embalagem do frasco para garantir que esteja devidamente selada.

A fabricação de insulina humana deve estar de acordo com os procedimentos do National Institutes of Health para operações em grande escala. A Food and Drug Administration dos Estados Unidos deve aprovar todas as insulinas fabricadas.

O Futuro

O futuro da insulina oferece muitas possibilidades. Desde que a insulina foi sintetizada pela primeira vez, os diabéticos precisavam injetar regularmente a insulina líquida com uma seringa diretamente na corrente sanguínea. Isso permite que a insulina entre no sangue imediatamente. Por muitos anos, foi a única maneira conhecida de mover a proteína insulina intacta para o corpo. Na década de 1990, os pesquisadores começaram a fazer incursões na síntese de vários dispositivos e formas de insulina que os diabéticos podem usar em um sistema alternativo de entrega de drogas.

Atualmente, os fabricantes estão produzindo vários dispositivos de entrega de medicamentos relativamente novos. As canetas de insulina parecem uma caneta de escrever. Um cartucho contém a insulina e a ponta é a agulha. O usuário define uma dose, insere a agulha na pele e pressiona um botão para injetar a insulina. Com as canetas, não há necessidade de usar um frasco para injetáveis ​​de insulina. No entanto, as canetas requerem a inserção de pontas separadas antes de cada injeção. Outra desvantagem é que a caneta não permite que os usuários misturem tipos de insulina e nem todas as insulinas estão disponíveis.

Para pessoas que odeiam agulhas, uma alternativa à caneta é o injetor a jato. Parecidos com as canetas, os injetores a jato usam pressão para propelir um minúsculo jato de insulina através da pele. Esses dispositivos não são tão usados ​​quanto a caneta e podem causar hematomas no ponto de entrada.

A bomba de insulina permite uma liberação controlada no corpo. Esta é uma bomba computadorizada, do tamanho de um bipe, que os diabéticos podem usar no cinto ou no bolso. A bomba possui um pequeno tubo flexível que é inserido logo abaixo da superfície da pele do diabético. O diabético configura a bomba para administrar uma dose constante e medida de insulina ao longo do dia, aumentando a quantidade logo antes de comer. Isso imita a liberação normal de insulina pelo corpo. Manufacturers have produced insulin pumps since the 1980s but advances in the late 1990s and early twenty-first century have made them increasingly easier to use and more popular. Researchers are exploring the possibility of implantable insulin pumps. Diabetics would control these devices through an external remote control.

Researchers are exploring other drug-delivery options. Ingesting insulin through pills is one possibility. The challenge with edible insulin is that the stomach's high acidic environment destroys the protein before it can move into the blood. Researchers are working on coating insulin with plastic the width of a few human hairs. The coverings would protect the drugs from the stomach's acid.

In 2001 promising tests are occurring on inhaled insulin devices and manufacturers could begin producing the products within the next few years. Since insulin is a relatively large protein, it does not permeate into the lungs. Researchers of inhaled insulin are working to create insulin particles that are small enough to reach the deep lung. The particles can then pass into the bloodstream. Researchers are testing several inhalation devices much like that of an asthma inhaler.

Another form of aerosol device undergoing tests will administer insulin to the inner cheek. Known as buccal (cheek) insulin, diabetics will spray the insulin onto the inside of their cheek. It is then absorbed through the inner cheek wall.

Insulin patches are another drug delivery system in development. Patches would release insulin continuously into the bloodstream. Users would pull a tab on the patch to release more insulin before meals. The challenge is finding a way to have insulin pass through the skin. Ultrasound is one method researchers are investigating. These low frequency sound waves could change the skin's permeability and allow insulin to pass.

Other research has the potential to discontinue the need for manufacturers to synthesize insulin. Researchers are working on creating the cells that produce insulin in the laboratory. The thought is that physicians can someday replace the non-working pancreas cells with insulin-producing cells. Another hope for diabetics is gene therapy. Scientists are working on correcting the insulin gene's mutation so that diabetics would be able to produce insulin on their own.

Onde aprender mais

Livros

Clark, David P, and Lonnie D. Russell. Molecular Biology Made Simple and Fun. 2ª ed. Vienna, IL:Cache River Press, 2000.

Considine, Douglas M., ed. Van Nostrand's Scientific Encyclopedia. 8ª ed. New York:International Thomson Publishing Inc., 1995.

Periódicos

Dinsmoor, Robert S. "Insulin:A Never-ending Evolution." Countdown (Spring 2001).

Outro

Diabetes Digest Web Page. 15 November 2001. .

Discovery of Insulin Web Page. 16 November 2001. .

Eli Lilly Corporation. Humulin and Humalog Development. CD-ROM, 2001.

Eli Lilly Diabetes Web Page. 16 November 2001. .

Novo Nordisk Diabetes Web Page. 15 November 2001. .

M. Rae Nelson

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