Sulfato de condroitina / policaprolactona / nanofibras eletrofiadas de gelatina com antitrombogenicidade e afinidade celular endotelial aprimorada como um andaime potencial para engenharia de tecidos de vasos sanguíneos

Resumo

Nanofibras poliméricas eletrofiadas têm ganhado muita atenção na engenharia de tecidos de vasos sanguíneos. No entanto, os materiais convencionais de nanofibras com deficiências de endotelização lenta e trombose não são eficazes na promoção do reparo e regeneração do tecido dos vasos sanguíneos. Aqui, nanofibras de compósito de gelatina biomimética (Gt) / policaprolactona (PCL) incorporando uma quantidade diferente de sulfato de condroitina (CS) foram desenvolvidas por meio de tecnologia de eletrofiação para investigar seus efeitos na antitrombogenicidade e afinidade da célula endotelial. As concentrações variáveis de CS em nanofibras de PG afetam a morfologia e o diâmetro da fibra. As nanofibras CS / Gt / PCL têm porosidade adequada (~ 80%) e absorção de solução PBS (até 650%). A introdução de CS em nanofibras de Gt / PCL aumenta muito suas propriedades anticoagulantes, prolonga seu tempo de coagulação e facilita as respostas celulares. Particularmente, as nanofibras de CS / Gt / PCL a 10% exibem fixação, alongamento e proliferação de células favoráveis. Assim, as nanofibras de Gt / PCL contendo uma certa quantidade de CS podem ser excelentes candidatas como um arcabouço de engenharia de tecidos promissor no reparo e regeneração de vasos sanguíneos.

Introdução

O desenvolvimento de materiais nanofibrosos tem atraído muita atenção como arcabouços biomiméticos no reparo e regeneração de tecidos devido às suas características (bio) físico-químicas únicas, incluindo sua estrutura de fibra ultrafina semelhante à matriz extracelular (ECM), excelentes propriedades mecânicas, grande área de superfície específica e alta porosidade com interconectividade [1, 2]. Foi demonstrado que as estruturas nanofibrosas desempenham um papel fundamental na mediação das respostas celulares, como adesão celular, morfologia (por exemplo, espalhamento, alinhamento, alongamento, etc.), arranjo, migração, proliferação, fenótipo e diferenciação via orientação de contato [3 , 4,5]. Embora várias estratégias de nanofabricação (por exemplo, nanofibras, síntese de molde, separação de fases, etc.) tenham fornecido uma tecnologia disponível para fabricar materiais nanofibrosos, a eletrofiação é um dos métodos mais eficazes para fabricar nanofibras de diferentes materiais (metais, cerâmica, polímero , materiais compostos, etc.) em escala industrial [6,7,8].

Além dos sinais (bio) físicos, a seleção de biomateriais adequados pode afetar significativamente as atividades celulares, bem como a reparação e regeneração de tecidos [9]. Algumas características-chave, como biocompatibilidade, bioreabsorvibilidade, propriedades mecânicas e biofunção, devem ser consideradas [9, 10]. Comparados aos compósitos naturais / naturais e sintéticos / sintéticos, os materiais compósitos de nanofibras constituídos por polímeros naturais e sintéticos têm recebido mais atenção devido à combinação das excelentes características biológicas dos polímeros naturais e a resistência mecânica dos polímeros sintéticos [9]. Entre eles, a combinação de gelatina (Gt) / policaprolactona (PCL) é um dos sistemas híbridos natural-sintéticos mais representativamente investigados e é amplamente utilizada na engenharia de tecido vascular sanguíneo [11,12,13,14]. No entanto, as nanofibras de compósito Gt / PCL ainda apresentam algumas limitações, como endotelização lenta e trombose. Recentemente, o sulfato de condroitina (CS) é um polissacarídeo sulfatado contendo glicosaminoglicano e galactosamina, que demonstrou possuir alta adesão às células endoteliais (ECs), interação fraca com proteínas e plaquetas, bem como repulsão eletrostática de componentes do sangue carregados negativamente [15 , 16,17]. Além disso, o CS pode inibir a apoptose celular e facilitar a cicatrização de feridas vasculares [18, 19]. Portanto, nanofibras eletrofiadas Gt / PCL (PG) incorporando CS seriam excelentes candidatos como um andaime bioinstrutivo de engenharia de tecidos para reparo e regeneração vascular do sangue.

No presente trabalho, nanofibras de compósito PG biomimético contendo diferentes razões CS foram desenvolvidas por meio de eletrofiação em uma etapa. A morfologia, a porosidade do aspecto químico e a degradação das nanofibras compostas CS / PG foram detectadas por diferentes técnicas de caracterização. O anticoagulante de nanofibras compostas PG / CS foi avaliado. Além disso, essas nanofibras compostas com diferentes proporções de CS foram semeadas com células endoteliais da aorta humana (HAECs) para investigar seus efeitos nas respostas celulares.

Materiais e métodos

Materiais

CS (traqueia bovina, tipo A, pureza:95%) foi fornecido por Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). PCL foi obtido de Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China). Gt (pele bovina, tipo B) foram obtidos de Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (China). O kit de tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) foi adquirido na Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). O ácido acético (pureza:99,5%) foi adquirido na Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China). As células endoteliais da aorta humana (HAECs) foram obtidas no hospital afiliado da Qingdao University (China). Meio de cultura Meio Eagle modificado por Dulbecco / Mistura de nutrientes F-12 (DMEM / F-12), soro bovino fetal (FBS), 0,25% de tripsina-EDTA foram adquiridos na Biological Industries (Israel). Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma Aldrich (China), a menos que indicado de outra forma. A água utilizada em todos os experimentos foi desionizada.

Eletrofiação de nanofibras

PCL (10% p / v) foi dissolvido em ácido acético sob agitação mecânica à temperatura ambiente durante 4 h. Gt (10% p / v) foi dissolvido em ácido acético 90% com agitação constante durante 2 h. CS em diferentes concentrações foi adicionado à solução de Gt e agitado suavemente à temperatura ambiente por 1 h para obter as soluções homogêneas contendo 5, 10 e 15% em peso de CS em relação à concentração total de polímero. Em seguida, a solução de PG foi preparada pela mistura de duas soluções acima em uma proporção em peso de 50/50 (p / p) sob agitação por 2 h, denominada como 5% CS @ PG, 10% CS @ PG e 15% CS @ PG .

As soluções homogêneas preparadas foram submetidas ao processo de eletrofiação, dotadas de seringa de 1 mL com agulha 21 G e coletor revestido por folha de alumínio. Neste estudo, a distância entre a placa coletora e a ponta da agulha foi fixada em cerca de 18 cm, a tensão foi fixada em 23 kV e as soluções poliméricas foram bombeadas a uma taxa de 1 mL / h. Todas as soluções foram submetidas a eletrofiação em um instrumento de eletrofiação (Technology, Tk602TH, China) em temperatura ambiente e umidade cuidadosamente controlada (<40%). Antes de quaisquer outros experimentos, as amostras foram colocadas em um forno de secagem a vácuo por 72 h, pelo menos, para remover qualquer solvente remanescente.

Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) e Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM)

A morfologia dos scaffolds nanofibrosos CS @ PG foi investigada por um SEM (VEGAS, TESCAN, Czech) a uma tensão de aceleração de 20 kV à temperatura ambiente. O diâmetro das nanofibras ( n =100) foi posteriormente medido a partir de imagens SEM usando software de análise de imagem (Imagem J).

As observações de TEM e análises de espectroscopia de raios-X de dispersão de energia (EDS) foram realizadas usando um JEOL JEM-2100 plus (Japão).

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

O FTIR foi realizado por um espectrômetro Nicolet iN10 FTIR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) para avaliar os grupos funcionais característicos de nanofibras CS, PG e nanofibras CS @ PG. Os espectros das amostras foram registrados com o modo de transmissão em uma faixa de comprimento de onda de 4000–500 cm ⁻¹ com uma resolução de 2 cm ⁻¹ .

Porosidade e absorção de solução salina tamponada com fosfato (PBS)

A porosidade das nanofibras foi realizada pelo método de deslocamento de líquido. Em primeiro lugar, o peso seco das nanofibras foi pesado como W ₁ . Em seguida, quatro grupos de nanofibras foram imersos em etanol por 2 h a 25 ° C e pesados como W ₂ . O etanol na superfície da amostra foi removido por papel de filtro e os pesos das amostras foram anotados como W ₃ . A porosidade das nanofibras foi calculada pela seguinte fórmula:
$$ {\ text {Porosidade}} \ esquerda (\% \ direita) =\ esquerda ({W_ {3} - W_ {1}} \ direita) / \ esquerda ({W_ {3} - W_ {2}} \ right) \ times 100 $$
Para o teste de absorção da solução de PBS, as nanofibras obtidas foram pesadas a seco e registradas como Wd. Em seguida, as nanofibras foram embebidas em PBS por 24 h a 25 ° C e o peso no estado úmido foi registrado como Ww após a remoção do excesso de líquido na superfície da amostra. A razão de dilatação pode ser medida pela seguinte equação:
$$ {\ text {PBS}} \; {\ text {absorção}} \ left (\% \ right) =\ left ({W _ {{\ text {W}}} - W _ {{\ text {d} }}} \ direita) / W _ {{\ text {d}}} \ vezes 100 $$
Todos os valores nos experimentos acima são expressos como a média ± SD ( n =3).

Comportamento de degradabilidade in vitro

Para determinar a resistência das nanofibras obtidas à lisozima, a degradabilidade das amostras foi medida em um tempo programado (1, 4, 7, 10 e 14 dias). O peso inicial das nanofibras foi registrado como W _i . Em seguida, as amostras foram imersas em solução de PBS (pH 7,4) contendo lisozima (500 μg / mL) e incubadas in vitro a 37 ° C. Nos intervalos de degradação predeterminados, cada grupo de amostras foi removido e lavado com água desionizada e liofilizado para obter o peso final ( W _f ) A solução de lisozima foi trocada três vezes por semana. A massa restante (%) dos andaimes de nanofibras foi estimada conforme definido na seguinte fórmula:
$$ {\ text {Mass}} \; {\ text {restantes}} \ left (\% \ right) =\ left ({1 - \ frac {{w_ {i} - w_ {f}}} {{ w_ {i}}}} \ right) \ times 100 \% $$
Para avaliar o comportamento de degradação da amostra após 7 dias, a morfologia das nanofibras foi observada por MEV.

Análise de compatibilidade sanguínea

Tempos de coagulação

O tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) foi usado para avaliar a atividade das vias intrínsecas e comuns de coagulação através do teste dos tempos de coagulação do plasma pobre em plaquetas (PPP) após a incubação com nanofibras eletrofiadas em lamelas. Para isso, sangue anticoagulado (aproximadamente 10 mL) foi coletado e centrifugado a 3.000 rpm por 20 min para obtenção de plasma pobre em plaquetas (PPP). Cada amostra foi incubada com 200 μL de PPP por 10 min a 37 ° C e analisada usando o kit APTT seguindo as instruções do fabricante ( n =3).

Teste de hemólise

A taxa de hemólise foi avaliada medindo a concentração de hemoglobina liberada na fase de solução dos eritrócitos em sangue total diluído exposto às nanofibras eletrofiadas. As amostras nas lamelas foram colocadas individualmente em placas de 24 poços e imersas em 2 mL de PBS a 37 ° C por 30 min. Os grupos de controle negativo continham apenas 2 mL de PBS, enquanto os grupos de controle positivo eram compostos de 2 mL de água desionizada com o objetivo de induzir a lise máxima de eritrócitos ( n =3 para cada grupo de teste). Em seguida, 40 μL do supracitado sangue total fresco anticoagulado foram adicionados a cada poço e incubados por 60 min a 37 ° C, após o que as suspensões foram removidas em tubos de centrifugação e centrifugadas a 100 × g por 5 min. Os sobrenadantes foram submetidos à medição da absorbância a 570 nm usando um leitor de microplaca (SynergyH1 / H1M, BioTek, China).

Trombogenicidade

O potencial trombogênico foi avaliado in vitro após incubação de amostras submetidas a eletrofiação com plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP foi preparado por centrifugação (1500 rpm, 20 min) e a metade superior do plasma foi descartada. Em seguida, as nanofibras nas lamelas foram incubadas em 100 μL de PRP a 37 ° C por 2 he lavadas suavemente com PBS três vezes para experimentos subsequentes. Para avaliar a atividade plaquetária após a incubação com PRP, nanofibras eletrofiadas foram mantidas no DMEM suplementado com FBS a 10% por 2 he 24 h e, em seguida, um kit de ensaio CCK-8 foi utilizado para medir a viabilidade de trombócitos nas nanofibras. CCK-8 (20 μL) foi adicionado a 200 μL de meio DMEM sem soro em placas de 24 poços e incubado por 1 h. Finalmente, as suspensões foram medidas por um leitor de microplaca no comprimento de onda de 450 nm.

Cultura de células e viabilidade celular

Células endoteliais aórticas humanas (HAECs) foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS (10%, v / v) e estreptomicina / penicilina (1%, v / v) em uma atmosfera de 37 ° C e 5% CO ₂ . O meio de cultura foi substituído três vezes por semana. As células foram geralmente isoladas por 0,05% de tripsina / EDTA durante 3 min, centrifugadas a 1000 rpm e suspensas no meio fresco para realizar a passagem ou semeadura das células.

Antes da semeadura das células, todos os materiais nanofibrosos em uma placa de 24 poços foram esterilizados sob irradiação UV por 1 he imersos em etanol 75% (v / v,%) por 1 h. Em seguida, as nanofibras foram enxaguadas quatro vezes com solução de PBS e embebidas em DMEM por 12 h em CO ₂ incubadora. As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 ⁴ células por poço em nanofibras e o meio foi substituído todos os dias. Após co-cultura de 24 h, as células foram lavadas com solução de PBS três vezes e, em seguida, coradas com um Kit de coloração dupla Calcein-AM / PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). PI foi usado para corar células mortas e Calcein-AM corado para células vivas.

Morfologia celular nas nanofibras

Para observar a adesão celular nas nanofibras, a morfologia das células foi observada após co-cultura de 24 horas por Microscópio de Fluorescência (Nikon A1 MP, Japão). Primeiramente, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% em temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, solução de Triton X-100 0,5% foi usada por 5 min para permeabilizar a membrana celular. Finalmente, 4′6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foi usado para corar núcleos de células e rodamina-faloidina foi usada para corar a F-actina. A análise quantitativa (densidade celular, área de célula única, alongamento celular) foi posteriormente realizada com Image J.

Proliferação celular

A atividade de proliferação celular nas nanofibras compostas foi realizada com um kit de ensaio CCK-8. As HAECs foram semeadas em nanofibras a uma densidade de 8 × 10 ³ células / poço. O meio de cultura foi trocado a cada dois dias. Após 1, 4, 7 dias de co-cultura, as células foram lavadas com solução de PBS para remover as células não aderentes. Em seguida, 20 μL de CCK-8 e o meio completo em uma proporção de volume de 1:10 foram adicionados à placa de 24 poços por 1 h na incubadora. A absorbância foi testada por Elisa Reader a 450 nm.

A coloração celular com DAPI e rodamina-faloidina foi realizada com Microscópio de Fluorescência para observar diretamente as mudanças nas contagens de células após co-cultura com diferentes nanofibras por dois dias e seis dias.

Análise estatística

Todas as amostras dos experimentos foram processadas em triplicata. Todos os dados são representados como médias ± desvios padrão (DP). A análise estatística das amostras foi determinada por análise de variância unilateral (ANOVA) para comparar as diferenças com significância atribuída em p <0,05.

Resultado e discussão

Preparação e caracterização de nanofibras CS @ PG

A Figura 1 exibiu o diagrama esquemático do processo de eletrofiação para arcabouços nanofibrosos CS @ PG e avaliação in vitro de anticoagulação e citocompatibilidade. Para desenvolver estruturas de tecido vascular projetado para promover a proliferação de células endoteliais, diferentes proporções de CS (5, 10 e 15% em peso) foram incorporadas em soluções de PG (10%, v / v) para nanofibras compostas fabricadas por meio do processo de eletrofiação.

SEM foi realizado para observar a estrutura de nanofibras eletrofiadas CS @ PG. Como mostrado na Fig. 2, as imagens SEM de PG, 5% CS @ PG, 10% CS @ PG, 15% CS @ PG nanofibras exibiram a arquitetura fibrosa densa, contendo fibras contínuas, suaves e nanoescala por técnica de eletrofiação . As nanofibras PG (Fig. 2a) exibiram muitos grânulos irregulares nas nanofibras através do processo de eletrofiação, tendo um diâmetro médio de 406,01 ± 146,28 nm. Pode ser explicado que 10% w / v da solução eletrofiada exibiu baixa viscosidade, resultando na formação de nanofibras não homogêneas contendo grânulos [20]. Com o aumento da quantidade de CS na solução polimérica de 5 para 10% em peso, nanofibras homogêneas sem grânulos podem ser alcançadas devido ao aumento da viscosidade da solução (Fig. 2b, c). Correspondentemente, 5% CS @ PG e 10% CS @ PG mostraram um diâmetro médio menor de 382,35 ± 152,99 nm e 300,29 ± 100,85 nm, respectivamente. Este resultado é principalmente porque o aumento do conteúdo de CS aumentou correspondentemente a condutividade da solução de eletrofiação [20]. No entanto, quando a concentração do polímero era de até 15%, a viscosidade da solução do polímero é muito alta para ser esticada no campo elétrico. Com a mesma vazão de 1 mL / h dos grupos anteriores, observamos que sob a tensão aplicada de 23 kV apareceu o fenômeno de obstrução da ponta da agulha e o cone de Taylor não pôde ser observado. Portanto, a taxa de fluxo da solução de eletrofiação e a voltagem aplicada foram ajustadas para 0,9 mL / he 20 kV, respectivamente. As nanofibras CS @ PG de 15% foram produzidas com sucesso com um diâmetro médio de 266,92 ± 105,43 nm.

Conforme representado na Fig. 3a, verificou-se que o CS estava uniformemente distribuído nas nanofibras 5% CS @ PG e 10% CS @ PG. No entanto, a agregação CS foi detectada nas fibras CS @ PG de 15%. Conforme indicado na Fig. 3b, a análise elementar de EDX foi realizada para detectar o teor de enxofre das fibras preparadas. Como esperado, o teor de enxofre aumentou com o aumento da concentração de CS nas fibras obtidas.

Análise de espectros de FTIR

A análise de espectros de FTIR foi realizada para determinar os picos de absorção característicos do grupo químico de estruturas nanofibrosas preparadas. O espectro FTIR de PG e CS foi considerado como o grupo de controle para comparação com os grupos de nanofibras CS @ PG. No espectro PG, bandas de absorção fortes que apareceram em 3300 cm ⁻¹ e 2935 cm ⁻¹ pode ser atribuído ao –NH ₂ e –OH de vibração de alongamento e CH ₂ alongamento assimétrico, respectivamente. Vários picos de absorção característicos apareceram em 1652 cm ⁻¹ (amida I) para vibração de alongamento C =O, 1542 cm ⁻¹ (amida II) para vibração de flexão N – H, 1441 cm ⁻¹ para CH ₂ alongamento e 1267 cm ⁻¹ (amida III) para vibração de alongamento C – N [21, 22]. O espectro CS realizou banda de absorção característica em 1245 cm ⁻¹ , representando a vibração de alongamento S =O em SO ₄ carregado negativamente ²⁻ [23, 24].

Como mostrado na Fig. 4, os espectros de FTIR de 5% CS @ PG, 10% CS @ PG e 15% de nanofibras CS @ PG mostraram picos característicos de PCL, Gt e CS juntos. Comparado com o espectro do grupo PG, os grupos CS @ PG mostraram a banda característica de CS a 1245 cm ^-1 , e a intensidade da banda CS aumentou pela presença de CS nas nanofibras. Esta descoberta confirmou a presença de conteúdos variáveis de CS nas nanofibras eletrofiadas CS @ PG.

Porosidade, proporção de intumescimento e degradabilidade das nanofibras

A alta porosidade da fibra indica que o material possui excelente interconectividade, o que favorece a difusão de oxigênio e nutrientes nos poros e promove a infiltração celular [25, 26]. A Figura 5a exibiu a porosidade dos filmes nanofibrosos. A porosidade das nanofibras obtidas contendo diferentes proporções de CS foi de aproximadamente até 80%. A alta arquitetura porosa obtida por nanofibras eletrofiadas pode imitar a ECM natural, proporcionando assim um microambiente 3D favorável para as células [27]. Foi relatado que scaffolds em engenharia de tecidos com porosidade de até 80% eram benéficos para o transporte de nutrientes e metabólitos.

A taxa de absorção de PBS dos scaffolds nanofibrosos CS @ PG foi comparada para avaliar o efeito de CS na absorção de PBS dos filmes. Conforme indicado na Fig. 5b, a razão de absorção de PBS do andaime PG foi de 586,34 ± 49,44%, e as nanofibras de 5% CS @ PG e 10% CS @ PG foram 492,86 ± 21,99% e 510,04 ± 69,55%, respectivamente. A taxa de absorção de PBS de 15% dos grupos CS @ PG (665,07 ± 59,81%) foi significativamente maior do que 5% CS @ PG e 10% CS @ PG. Este resultado indicou que o aumento do conteúdo de CS nas nanofibras compostas poderia melhorar a propriedade de absorção de PBS dos filmes, o que poderia ser devido à alta hidrofilia nas moléculas de CS contendo grupos hidrofílicos (carboxila e hidroxila) [28].

Os dados do experimento de degradabilidade in vitro foram representados na Fig. 5c, e verificou-se que com o aumento da proporção de CS, a taxa de degradação dos andaimes de nanofibras de CS @ PG também aumentou. Isso pode ser atribuído à presença de SO ₄ ²⁻ grupos [29]. Como demonstrado na Fig. 5c, a taxa de degradação da maioria dos andaimes começou a aumentar após 7 dias, e os resultados de degradação no dia 14 foram 8,45%, 11,39%, 13,97% e 15,10% para PG, 5% CS @ PG, 10 % CS @ PG e 15% de andaimes de nanofibras CS @ PG, respectivamente. As imagens de SEM de andaimes de nanofibras (Fig. 5d) mostraram ligeiro inchaço após imersão em solução de PBS por 7 dias. As imagens de SEM indicam que as nanofibras desenvolvidas eram estáveis o suficiente para evitar degradação e expansão graves por até 7 dias, afetando a resposta celular in vivo ou in vitro.

Avaliação de hemocompatibilidade

APTT é um método simples e confiável para detectar o sangue ou plasma por meio do mecanismo de coagulação intrínseco. O APTT foi testado para medir a influência das nanofibras eletrofiadas no possível atraso da coagulação do sangue. O tempo de coagulação detectado por APTT exibiu uma diminuição estatisticamente significativa dos tempos de coagulação entre PG de controle e 5% de CS @ PG e 10% de nanofibras de CS @ PG. Em contraste, APTT prolongado foi encontrado após incubação de 15% de nanofibras CS @ PG com PPP, indicando sua característica anticoagulante melhorada. Conforme apresentado na Fig. 6a, o impacto da coagulação do sangue era dependente do diâmetro das amostras de nanofibras. O menor tempo de coagulação APTT foi encontrado após a interação com 5% de nanofibras CS @ PG e o maior APTT com 10% de eletrofiação CS @ PG, similar ao grau de hemólise. O tempo de coagulação foi prolongado com o aumento da relação CS.

De acordo com a ASTM F756-00 (2000), a taxa de hemólise dos biomateriais deve ser <5% [30]. O grau de hemólise neste estudo foi realizado usando um ensaio colorimétrico de hemoglobina liberada de eritrócitos e pode ser calculado pela equação:Hemólise (%) =(DO _sam - OD _neg ) / (OD _pos - OD _neg ) × 100%. Conforme indicado na Fig. 6b, todas as amostras eram não hemolíticas e não resultaram em qualquer hemólise acentuada (a taxa de hemólise é inferior a 5%).

Os dados da experiência de viabilidade das plaquetas são mostrados na Fig. 6c. Após 2 h, a atividade metabólica dos trombócitos aderidos foi a mais alta com valores máximos alcançados após a interação do PRP com as nanofibras, particularmente as nanofibras de PG. Curiosamente, após 24 horas, a atividade plaquetária reduziu em todas as amostras. Esse resultado pode ser devido à rápida ativação do trombócito pela estrutura das nanofibras, resultando em rápido consumo e liberação de fatores de crescimento em comparação à ativação plaquetária estável e de longo prazo ao contato com a superfície lisa [31]. A expectativa de vida normal dos trombócitos é de aproximadamente 8 a 10 dias e será reduzida quando as plaquetas começarem a se ativar.

Coloração de células vivas / mortas

A influência do CS na citocompatibilidade das nanofibras foi explorada pela viabilidade celular, morfologia adesiva e avaliação da proliferação de HAECs em nanofibras por 6 dias. As células anexadas foram avaliadas usando o kit de coloração dupla Calcein-AM / PI, coloração DAPI e kit de ensaio CCK-8.

A Figura 7a-e mostrou as imagens de fluorescência de HAECs vivos e mortos anexados às diferentes nanofibras. Calceína-AM (verde) e PI (vermelho) foram usados para colorir as células vivas e células mortas, respectivamente. Pôde-se observar que células vivas aderiram às nanofibras de compósito CS @ PG, indicando que as nanofibras contendo diferentes proporções de CS não apresentaram toxicidade para HAECs. Uma análise quantitativa adicional do número de células vivas / mortas nas nanofibras foi examinada por Image J (Fig. 7f). Em comparação com a proporção de células vivas e mortas em nanofibras de PG, os outros três grupos de PG contendo diferentes proporções de CS, especialmente os grupos 10% CS @ PG e 15% CS @ PG exibiram uma porcentagem maior de células vivas, e a porcentagem foi aumentada com o aumento da concentração de CS. Este resultado mostrou que a presença de CS nas nanofibras foi vantajosa para manter a viabilidade celular [32].

Comportamento de adesão celular em nanofibras

Os andaimes nanofibrosos com boa biocompatibilidade são considerados o principal requisito para a geração de vasos sanguíneos. PCL com boa biodegradabilidade e Gt natural com excelente biocompatibilidade foram amplamente utilizados na engenharia de tecidos com diferentes estruturas, incluindo hidrogéis, nanofibras eletrofiadas e andaimes tridimensionais [21, 33, 34]. A morfologia das HAECs nas nanofibras compostas e na interação célula-materiais em 24 h foi observada por microscópio de fluorescência. A densidade celular 10% CS @ PG e 15% CS @ PG foi estatisticamente significativa do que PG e 5% CS @ PG, indicando que a adição de CS a um nível superior promove a adesão celular. Conforme mostrado na Fig. 8c, a área de célula única de 5% CS @ PG e 15% CS @ PG era maior do que os outros grupos de nanofibras. No entanto, o alongamento celular de 10% CS @ PG foi significativamente maior do que PG, 5% CS @ PG e 15% CS @ PG (Fig. 8d). Esse resultado pode ser explicado que a adição de CS na concentração de 10% pode facilitar a disseminação de HAECs. Verificou-se que as HAECs podem aderir, se espalhar e crescer bem nas nanofibras compostas, especialmente 10% CS @ PG e 15% CS @ PG. Assim, esses dois materiais de nanofibra podem ser considerados como um material vascular candidato seguro e promissor em aplicação clínica.

Proliferação celular

O crescimento celular e a viabilidade em nanofibras CS @ PG foram investigados in vitro por microscópio de fluorescência e teste CCK-8 (Fig. 9a-c). O andaime PG eletrofiado foi selecionado como o controle positivo. Os resultados do ensaio CCK-8 para diferentes filmes nanofibrosos são exibidos na Fig. 9c. Em 2, 4, 6 dias de cultivo das células, o número de células aumentou com o tempo de cultivo para todos os grupos. No dia 6, o valor de DO de 10% de nanofibras CS @ PG foi significativamente maior do que o do andaime PG. A comparação da proliferação celular de 5% CS @ PG, 10% CS @ PG e 15% CS @ PG indicou que a taxa de proliferação celular aumentou conforme a presença de CS em nanofibras compostas em um determinado intervalo. No entanto, a capacidade de proliferação celular também foi influenciada pela morfologia da superfície dos materiais nanofibrosos. Uma vez que a nanofibra CS @ PG de 15% exibiu forte viscosidade devido à maior proporção de CS em solução polimérica de eletrofiação, a proliferação celular pode ser afetada.

Conclusões

Em resumo, as nanofibras compostas biomiméticas CS @ PG foram fabricadas com sucesso usando a tecnologia de eletrofiação. A morfologia e o diâmetro da fibra alterados foram obtidos por meio da variação das concentrações de CS em nanofibras de PG. As nanofibras CS @ PG possuíam porosidade apropriada (~ 80%) e absorção de solução de PBS (até 650%). A incorporação de CS em nanofibras de PG melhorou significativamente suas propriedades anticoagulantes, prolongou seu tempo de coagulação e aumentou as respostas celulares. Particularmente, 10% de nanofibras CS @ PG exibiram adesão celular favorável, alongamento e proliferação. Portanto, as nanofibras compostas de PG incorporadas com uma certa quantidade de CS inibiram a antitrombogenicidade e aumentaram as respostas das células endoteliais, o que poderia ser desenvolvido como um arcabouço de engenharia de tecidos promissor no reparo e regeneração de vasos sanguíneos.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo.

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