Pontos de Carbono: Nanotermômetros Pioneiros de Próxima Geração – Uma Revisão Abrangente

Resumo

A detecção de temperatura em modo não-contato com alta sensibilidade é fundamental para estudar reações químicas básicas, processos biológicos e aplicações em diagnósticos médicos. Nanotermômetros baseados em nanoescala garantem sondas não-invasivas para detecção sensível e precisa de temperatura com resolução subcelular. Sensores baseados em fluorescência demonstraram grande capacidade, pois operam em modo "não-contato" e oferecem as funções duplas de imagem celular e detecção de temperatura no nível molecular. Avanços em nanomateriais e nanotecnologia levaram ao desenvolvimento de novos sensores, como nanotermômetros (novos materiais de detecção de temperatura com alta resolução espacial na nanoescala). Tais nanotermômetros foram desenvolvidos usando diferentes plataformas: proteínas fluorescentes, compostos orgânicos, nanopartículas metálicas, nanopartículas dopadas com terras raras e pontos quânticos de semicondutores. Pontos de carbono (CDs) atraíram interesse em muitos campos de pesquisa devido a propriedades excepcionais: fluorescência forte, resistência à fotodegradação, estabilidade química, precursores de baixo custo, baixa toxicidade e biocompatibilidade. Relatórios recentes mostraram o comportamento de detecção térmica de alguns CDs, tornando-os alternativas a outros nanotermômetros baseados em nanomateriais. Este tipo de termômetro luminescente é promissor para detecção de temperatura em nanocavidades e mapeamento térmico, permitindo melhor compreensão de processos biológicos. Com os CDs ainda em estágio inicial como material nanoescala para detecção térmica, esta revisão fornece compreensão abrangente deste novo nanotermômetro, métodos de funcionalização para aumentar sensibilidade e resolução térmica, e mecanismos do comportamento de detecção térmica.

Introdução

A temperatura é uma variável termodinâmica fundamental que influencia notavelmente sistemas biológicos e químicos. Devido à sua ampla gama de aplicações, em praticamente todos os campos das ciências naturais, engenharia, agricultura e ciências médicas, a determinação precisa de temperatura é de grande significado. Em aplicações médicas, a termometria é usada para detecção precoce de várias doenças, como acidente vascular cerebral, câncer ou inflamações, cujo sintoma incipiente é o surgimento de peculiaridades de temperatura localizadas.

Historicamente, a primeira estimativa de temperatura baseava-se em sensação ou observação. Na antiguidade, 200–10 a.C., experimentos pneumáticos (expansão do ar pelo calor) são as referências mais antigas reconhecidas de aparelhos utilizados para medições quantitativas de calor. Entre os escritos mais primitivos relacionados à expansão do ar pelo calor, creditam-se os trabalhos de Filão de Bizâncio e Herão de Alexandria sobre experimentos pneumáticos. Mais tarde, entre 1592 e 1603, Galileu Galilei inventou um termoscópio realizando experimentos com expansão do ar pelo calor através da construção de um aparelho simples usando um tubo com ar aprisionado acima de uma coluna de água. Seguindo Galileu, o italiano Santório é creditado como o primeiro a integrar este aparelho simples em exames médicos de febre. O primeiro termômetro de líquido em vidro totalmente selado, tubo de vidro cheio de álcool, foi montado por Fernando II em 1641. Ele conseguiu medir temperatura sem influência da pressão barométrica, ao contrário do termoscópio aberto de Galileu e Santório. O trabalho prático de Fahrenheit em termometria surgiu em 1706; começou com álcool, mas tornou-se lendário por seus termômetros de mercúrio. O reconhecimento da escala de temperatura centesimal foi dado a Anders Celsius, que em 1742 propôs uma escala com zero na temperatura de ebulição da água e 100 na temperatura de congelamento. Experimentações eletrônicas no século XIX, quando Thomas Johann Seebeck considerou o conceito de termoeletricidade. Em uma sucessão de experimentos entre 1820 e 1823, ele verificou o potencial elétrico nos pontos de junção de dois metais diferentes quando há diferença de calor entre as juntas. Isso ficou conhecido como Efeito Seebeck e serve como origem do termopar, considerado a medição mais precisa de temperatura. O esquema cronológico do termômetro é mostrado na Fig. 1.

Esquema cronológico para a evolução dos termômetros

Termômetros convencionais podem ser categorizados em:

1. Termômetros de vidro com líquido baseados na expansão térmica de materiais
2. Termopares baseados no efeito Seebeck
3. Sensores ópticos

Além disso, podem ser classificados como termômetros de contato ou não-contato. Modo de contato, incluindo termômetros clássicos de líquido em vidro, termopares, termistores e detectores de temperatura por resistência (RTDs), todos necessitam de cabos elétricos e contato direto entre o termômetro e o substrato. Este modo não é apropriado para aplicações onde o ruído eletromagnético é forte, faíscas podem ser perigosas, o ambiente é destrutivo ou as partes estão se movendo rapidamente. Além disso, termômetros tradicionais não são capazes de medições quando a resolução espacial baixa para a escala sub-micrométrica, por exemplo, em variações de temperatura intracelular e mapeamento de temperatura de microcircuitos e microfluídica. Da mesma forma, aplicações de engenharia necessitam estratégias termossensíveis avançadas para regiões miniaturizadas e ambientes difíceis. Assim, para domínios na nanoescala, deve-se pensar em outras abordagens e materiais.

A termometria não-contato inovadora pode superar os problemas mencionados. Por exemplo, termossensores ópticos (termômetros moleculares) são uma geração mais recente de ferramentas analíticas que consistem em classes moleculares que usam a medição de luz emitida para extrair temperatura. Sondas fluorescentes sensíveis à temperatura oferecem área promissora para termometria em aplicações de nano-sistemas. A informação de temperatura pode ser extraída baseada em sua intensidade de fluorescência, forma de banda, deslocamento de Stokes ou tempo de vida de decaimento, que podem relacionar temperatura se devidamente calibrados.

Termômetros moleculares têm grande potencial no diagnóstico de células doentes ou cancerígenas, que têm temperaturas fisiológicas variadas em relação a células ordinárias. Em aplicações médicas, as possibilidades vão desde controle de expressão gênica induzido por temperatura e metabolismo celular até penetração e tratamento seletivo de células doentes e melhoria da dissipação de calor de fontes de calor integradas. Recentemente, nanomateriais como semicondutores, poliméricos e nanopartículas metálicas têm sido usados como sensores térmicos (nanotermômetros) que mostraram resolução térmica sub-micrométrica.

Termômetros que podem resolver sub-graus de temperatura sobre uma ampla faixa de temperaturas e que também podem ser integrados em sistemas vivos poderiam oferecer uma nova ferramenta influente em inúmeras áreas de pesquisa biológica, física e química. Portanto, nesta revisão, focamos em uma "nova geração" ou "nova classe" de nanotermômetro baseada em nanomateriais de carbono (materiais carbonáceos). Para o melhor de nosso conhecimento, não há artigo de revisão relatado sobre pontos de carbono como nanotermômetro. Recentemente, pontos de carbono (pontos quânticos de carbono, pontos quânticos de grafeno) junto com suas características únicas mostraram propriedades térmicas sensíveis, tornando-os excelentes candidatos para comportamento termométrico no domínio da nanoescala. Aqui, definições, vantagens e mecanismos do comportamento de detecção térmica de pontos de carbono são revisados. Finalmente, perspectivas futuras desta nova classe de termo-materiais são apresentadas.

Nanotermometria

O que se entende por "nano-termometria" é o uso de materiais termosensíveis na nanoescala para fornecer informação de temperatura sobre o ambiente local de regiões na nano ou microescala. Sondas térmicas baseadas em nanopartículas têm grande capacidade em um amplo espectro de aplicações de detecção, e numerosos "nanotermômetros" progressivos têm sido relatados recentemente. Além disso, diferentes tipos de nanomateriais convencionais têm sido relatados como tendo propriedades luminescentes termosensíveis, como polímeros, nanocristais, nanopartículas dopadas com terras raras e nanopartículas metálicas.

Assim, nanossensores térmicos são termômetros não-invasivos, de modo não-contato, precisos, trabalhando na nanoescala com alta resolução de sensibilidade. Detecção térmica utilizando nanomateriais pode ser alcançada manipulando suas propriedades ópticas. Nanotermometria de fluorescência pode ser classificada em várias classes dependendo do parâmetro preciso do qual a medição térmica é derivada, envolvendo intensidade do sinal, forma da banda, tempos de vida de fluorescência, deslocamento de banda, polarização do comprimento de onda de excitação e deslocamento espectral. No primeiro caso, a fluorescência muda com diferentes temperaturas e pode ser detectada como aumento (ou diminuição) absoluto no sinal.

Nanotermometria de luminescência sem contato, que usa nanomateriais luminescentes com emissões dependentes de temperatura, é predominantemente apropriada para aplicações biológicas. Esses nanomateriais luminescentes incluem polímeros fluorescentes, nanopartículas metálicas, nanopartículas dopadas com terras raras e nanodiamantes que têm propriedade termosensível na faixa fisiológica. Esses trabalhos pioneiros foram capazes de fornecer a temperatura média para células individuais. Sondas luminescentes dependentes de temperatura baseadas em corantes orgânicos (ex: Rodamina 6G) e polímeros (ex: poli(N-isopropil acrilamida)) geralmente exibem baixa fotostabilidade e sensibilidade cruzada pronunciada ao oxigênio, o que é indesejável para trabalho em células vivas. Além disso, há forte dependência de pH no tempo de vida do fluoróforo, o que dificulta seu uso sem controle preciso do pH do ambiente analisado.

Outra classe de nanotermômetros baseada em nanocristais de semicondutores puros e dopados foi relatada, com candidatos mais proeminentes como CdSe, ZnS, InP ou PbSe. Pontos quânticos de semicondutores (SQDs) são candidatos para termômetros na nanoescala, considerando que têm alto rendimento quântico, longo tempo de vida antes da fotodegradação e biocompatibilidade adequada após modificação de superfície apropriada. Além disso, podem ser facilmente conjugados a proteínas e DNA para detecção e imagem. O desafio excepcional enfrentado por este tipo de termômetros luminescentes é o reconhecimento associado de brilho, fotostabilidade, sensibilidade e precisão a T = 20–40 °C ao sondar microambientes subcelulares. SQDs foram extensivamente revisados em termos de síntese, propriedades físico-químicas, luminescência e potenciais aplicações. Aqui, direcionamos a atenção do leitor a estas numerosas revisões notáveis. Comparados a corantes orgânicos, SQDs exibem brilho superior para detecção, perfil de excitação mais amplo para multiplexação e melhor fotostabilidade para estudos de longo prazo. Além disso, SQDs como sensores de temperatura são resistentes a pH e outras variações ambientais esperadas dentro de uma célula.

Geralmente, em SQDs, devido a uma combinação de diferentes processos, um aumento de temperatura produz diminuição na intensidade de fluorescência (quenching), acompanhada por deslocamento espectral. Este deslocamento pode ser assumido como linear na faixa biofísica. A magnitude de ambos os efeitos (quenching de luminescência e deslocamento espectral) depende fortemente do material constituinte dos QDs e de seu tamanho.

Cada grupo de nanomateriais luminescentes tem limitações de uso junto com suas vantagens. Como descrito acima, SQDs são favorecidos mais que polímeros fluorescentes e corantes orgânicos. SQDs são bons em termos de fotostabilidade, eficiência quântica e fluorescência ajustável, mas QDs não podem ser usados para rastrear uma única molécula para monitoramento de longo prazo devido ao seu piscar intrínseco. Além disso, a principal desvantagem dos QDs é sua toxicidade, devido ao conteúdo de metais pesados, incluindo metais como cádmio; isso limita suas aplicações biológicas e ambientais. Além disso, a disponibilidade de elementos precursores na natureza é relativamente baixa e, portanto, SQDs são considerados caros.

Pontos de Carbono como Nanotermômetros

Para superar problemas que surgiram de nanotermômetros não-baseados em carbono (como explicado na seção anterior), nanomateriais baseados em carbono foram preparados e exibiram propriedades únicas, como baixa toxicidade, preparação fácil, precursor de baixo custo, fotostabilidade e biocompatibilidade. Esses nanomateriais baseados em carbono mostraram propriedades de detecção térmica sensíveis. Além disso, a melhoria de nanopartículas livres de metal é importante e urgente devido ao perigo ambiental para aplicações biológicas de tais materiais tóxicos. Entre a família de nanomateriais baseados em carbono, nanodiamantes fluorescentes foram os primeiros relatados como nanotermômetros. Nanodiamantes fluorescentes possuem biocompatibilidade intrínseca resultante de sua superfície quimicamente robusta e inerte. Outros nanodiamantes têm sido usados recentemente para detecção térmica intracelular com precisão sub-grau. A sensibilidade térmica desses nanodiamantes baseia-se nos chamados centros de cor de vacância de nitrogênio, que são defeitos pontuais consistindo de um átomo de nitrogênio substituindo um átomo de carbono da rede e um sítio de rede vago próximo. O centro de vacância de nitrogênio de nanodiamantes fluorescentes é estudado extensivamente e foi bem caracterizado para sua fotofísica e uso em aplicações biológicas. O princípio de funcionamento da termometria baseada em vacância de nitrogênio depende da medição precisa deste centro de cor, que pode ser detectado opticamente com alta resolução espacial. No entanto, baixa eficiência de fluorescência e pobre controlabilidade impedem tremendamente a aplicação de nanodiamantes fluorescentes.

Uma das classes mais novas da família de nanomateriais baseados em carbono são pontos de carbono (CDs) altamente luminescentes, que têm fotoluminescência excepcionalmente brilhante, estabilidade fotoquímica, solubilidade em água, grande biocompatibilidade e não-toxicidade. CDs são nanopartículas zero-dimensionais e esféricas possuindo diâmetros menores que 10 nm. Várias abordagens foram aplicadas para preparar diversos tipos de CDs, e.g., ablação a laser, solvotérmica, síntese hidrotérmica, assistida por micro-ondas, descarga a arco, oxidação ácida e mais abordagens químicas e físicas. Adicionalmente, CDs exibem perspectiva desejável para várias aplicações, como imagem biológica, detecção química e biológica, liberação direcionada de fármacos, análise farmacêutica e catálise. Pontos de carbono foram extensivamente revisados em termos de síntese, propriedades físico-químicas e potenciais aplicações. Aqui, encaminhamos o leitor às numerosas boas revisões sobre pontos de carbono.

Nos últimos anos, CDs fluorescentes como sensores de temperatura atraíram muita atenção de pesquisadores. Em princípio, algum requisito é necessário para medição eficaz de temperatura, como pontos nanométricos de carbono devem exibir variação apreciável em sua fotoluminescência sobre a faixa de temperaturas relevantes. A fotostabilidade, estabilidade de pH e vida de prateleira são outros requisitos que devem ser considerados para aplicação prática.

CDs são alternativas promissoras para pontos quânticos de semicondutores convencionais (SQDs). Comparados com QDs, CDs mostram muitas vantagens excepcionais como baixo custo, baixa toxicidade e suas propriedades ópticas/químicas robustas únicas. Adicionalmente, CDs mostram muito menos fotodegradação. Comparados a outros materiais fluorescentes brutos, CDs são produzidos de fontes de carbono baratas e abundantes na natureza. Além disso, existem vários métodos simples para modificar e funcionalizar o estado de superfície dos CDs, permitindo adaptar solubilidade, estabilidade, propriedades físico-químicas e rendimentos quânticos dos CDs de acordo com seus requisitos experimentais.

Na literatura, há um número escasso de artigos relatados de pontos de carbono com fluorescência dependente de temperatura, mostrados na Tabela 1.

Yu et al. em 2012 foram os primeiros a investigar a fluorescência dependente de temperatura em pontos nanométricos de carbono e compará-los a nanopartículas baseadas em semicondutores e metais. Eles dependeram da medição de tempos de vida de fotoluminescência dependentes de temperatura via técnica de contagem de fóton único correlacionada no tempo (TCSPC). A dinâmica de relaxamento de fotoluminescência torna-se mais rápida em temperaturas mais altas (Fig. 2a), o que pode ser atribuído a processos de decaimento não-radiativos. A medição dos espectros de fluorescência do filme de CD como função de temperatura de criogênica a temperatura ambiente foi realizada (Fig. 2b). Com aumento de temperatura, a intensidade de fluorescência exibe diminuição repetitiva.

a Medidas de fotoluminescência resolvidas no tempo como função de temperatura. b Espectros de fluorescência do filme de CD como função de temperatura. c Espectros de fluorescência a 300 K ajustados por função de dois Gaussianos. d Largura de banda de fluorescência como função de temperatura. (Reproduzido com permissão da referência [51])

O espectro de PL exibe picos assimétricos, portanto os espectros de PL em cada temperatura poderiam ser bem ajustados por uma função de dois Gaussianos mostrada na Fig. 2c. A banda de alta energia, banda I; a banda de baixa energia, banda II (Fig. 2d).

Além disso, a lacuna de energia (largura de banda) de fluorescência foi inspecionada como função de temperatura (Fig. 2d). A largura de banda total é pronunciada por temperatura-independente (espalhamento elétron-elétron), e temperatura-dependente (espalhamento elétron-fônon e espalhamento de superfície/defeito). A largura de banda da banda I e banda II é temperatura-independente, o que especifica que o espalhamento elétron-elétron domina nos CDs.

Portanto, o fraco efeito de temperatura nos CDs está de acordo com o fato de que o mecanismo de interação principal envolve interações elétron-elétron em vez de acoplamento elétron-fônon. Adicionalmente, uma banda de PL larga (> 100 nm) geralmente observada mesmo em temperatura muito baixa (77 K) refere-se a forte interação elétron-elétron (Fig. 2c). Este resultado é semelhante a nanoclusters metálicos e diferente de QDs de semicondutores. Portanto, Yu e colaboradores especularam que os elétrons π nos CDs podem atuar similarmente aos elétrons livres nos nanoclusters metálicos.

Kalytchuk et al. sintetizaram CDs N,S altamente luminescentes solúveis em água por tratamento hidrotérmico em uma etapa de ácido cítrico e L-cisteína. Eles coletaram espectros de absorção em estado estacionário em uma ampla faixa de temperaturas para caracterizar as propriedades de PL dependentes de temperatura dos CDs. Os espectros de absorção de CDs N,S dispersos em água a temperaturas entre 10 e 70 °C (aumentando 5 °C por etapa) são mostrados na Fig. 3a. Diferente de nanocristais de semicondutores, a posição e a intensidade da banda de absorção não mudaram com a temperatura. Resultados semelhantes foram previamente relatados para CDs sintetizados por tratamento hidrotérmico de glicose na presença de glutationa.

a Absorção dependente de temperatura na faixa de 10 a 70 °C. b Gráfico de cores normalizado da emissão PL dependente de temperatura entre 2 e 80 °C com passo de 2 °C e excitação a 355 nm. Mudanças correspondentes no máximo do pico PL λmax (c), PL fwhm (d) e intensidade PL integrada (e). (Reproduzido da referência [89])

Em seu trabalho, eles mostraram um gráfico de cores dos espectros de PL de CDs N,S adquiridos a temperaturas variando de 2 a 80 °C com passo de 2 °C (Fig. 3b). O aumento de temperatura reduziu a intensidade de emissão PL aproximadamente por um fator de 2 sem qualquer deslocamento detectável das emissões PL. A posição do máximo de emissão PL, a largura total a meia altura (fwhm) do PL e a intensidade PL integrada foram determinadas quantitativamente nas temperaturas estudadas, condensando os resultados na Fig 3c–e, respectivamente.

A posição do pico PL de CDs N,S mostra fraca dependência de temperatura, diferente da maioria dos nanocristais de semicondutores, cuja lacuna de banda muda com temperatura, induzindo deslocamento de emissão PL. Além disso, seu fwhm PL exibe apenas alargamento insignificante (1,4 ± 1 nm) sobre a mesma faixa de temperatura (Fig. 3d), indicando que o pico PL dos CDs N,S mostra alargamento térmico desprezível. Para caracterizar os processos de relaxamento não-radiativos ocorrendo nos CDs, eles analisaram o quenching da intensidade PL integrada como função da temperatura. Um gráfico da intensidade PL integrada dependente de temperatura para CDs N,S é mostrado na Fig. 3e, com valores normalizados à intensidade a 2 °C, revelando que a intensidade diminui monotonicamente sobre a faixa de temperatura estudada, com a de 80 °C sendo aproximadamente metade da de 2 °C. Baseado nestes resultados, a energia de ativação do quenching térmico para os CDs a temperaturas entre 2 e 80 °C foi estimada em 17,0 ± 0,7 meV usando a fórmula de Arrhenius para CDs N,S, próximo ao valor relatado por Yu et al.

Além disso, Kalytchuk et al. examinaram a dinâmica de emissão dos CDs a diferentes temperaturas. A Figura 4a–c exibe a forte dependência de temperatura de sua emissão PL resolvida no tempo, mostrando dados de espectroscopia de emissão resolvida no tempo para três temperaturas diferentes. Mapas transitórios de emissão PL de CDs foram adquiridos na região espectral entre 375 e 650 nm a 2, 50 e 80 °C, como mostrado na Fig. 4a–c. Há um claro declínio no decaimento PL à medida que a temperatura aumenta, sugerindo que os CDs têm propriedades satisfatórias para detecção de temperatura baseada em tempo de vida PL. É importante notar que decaimento monoexponencial espectralmente uniforme foi observado através dos perfis de emissão dos pontos em todas as temperaturas estudadas, indicando que a recombinação ocorre via canais altamente emissivos e muito semelhantes em todo o conjunto de CDs. A dinâmica PL dos CDs é arguivelmente sua qualidade mais promissora relacionada a aplicações de detecção de temperatura. Especificamente, a sensibilidade de temperatura dos CDs os torna nanotermômetros de tempo de vida PL.

Emissão PL dependente de temperatura resolvida no tempo de CDs. Gráficos de cores normalizados mostrando mapas de emissão PL resolvida no tempo para CDs a a 2 °C, b 50 °C e c 80 °C. d Gráfico de cores normalizado da intensidade PL resolvida no tempo no máximo de emissão PL (λem = 421 nm) a temperaturas entre 2 e 80 °C. e Tempos de vida PL extraídos plotados como função de temperatura na faixa de 2–80 °C. (Reproduzido da referência [89])

A variação do tempo de vida PL dos CDs a temperaturas entre 2 e 80 °C foi investigada profundamente; Fig. 4d, e mostra dados de PL resolvida no tempo coletados no máximo de emissão PL dos pontos como função da temperatura. Um gráfico de cores de PL transitória através da faixa de temperatura estudada é apresentado na Fig. 4d, mostrando que o aumento de temperatura leva a um encurtamento monótono do decaimento PL aparente. Todas as curvas de decaimento registradas foram ajustadas usando função monoexponencial. Dados sobre os tempos de vida extraídos são apresentados na Fig. 4e. À medida que a temperatura aumenta de 2 a 80 °C, o tempo de vida PL diminui monotonicamente de 11,0 a 5,3 ns. A faixa de temperatura sobre a qual esta sensibilidade de tempo de vida PL baseada em CD foi demonstrada (2–80 °C) cobre tanto a faixa de temperatura fisiologicamente relevante quanto as temperaturas típicas de operação de muitos dispositivos eletrônicos. A sensibilidade pseudo-linear absoluta desta sonda térmica baseada em tempo de vida PL de CD é 0,08 ns K⁻¹, e sua sensibilidade relativa máxima é 1,79% K⁻¹ a 62 °C. O ajuste monoexponencial do decaimento PL de nanossonda luminescente baseada em CD através da faixa de temperatura estudada produz um único parâmetro, o tempo de vida PL (τ), que pode ser diretamente convertido em unidades de temperatura usando uma curva de calibração. Esta é uma vantagem importante sobre pontos quânticos de semicondutores típicos, que exibem decaimento multi-exponencial que limita sua utilidade em aplicações envolvendo medições de tempo de vida PL.

Eles também estudaram a dependência de temperatura do tempo de vida PL de CDs em tampão fosfato salino (PBS) e meio modificado de Dulbecco (DMEM) e mostraram comportamento semelhante.

Para demonstrar a reutilizabilidade de termômetros luminescentes baseados em CD, as curvas de decaimento PL de amostras selecionadas foram medidas sobre sete ciclos sucessivos de aquecimento e resfriamento a temperaturas entre 15 e 45 °C (Fig. 5a).

a Gráfico de cores normalizado de reversibilidade de decaimento PL sobre sete ciclos sequenciais de aquecimento e resfriamento. b Estabilidade térmica correspondente dos tempos de vida PL sobre sete ciclos de aquecimento e resfriamento entre 15 e 40 °C. (Reproduzido da referência [89])

Em cada ciclo de medição, o decaimento PL foi medido após 5 min de equilíbrio térmico. Nenhuma histerese térmica foi observada durante os ciclos de aquecimento e resfriamento, e a variação resultante do tempo de vida PL é plotada como função do tempo na (Fig. 5b), demonstrando que o tempo de vida PL dos CDs exibe excelente estabilidade térmica.

Posteriormente, vários CDs com emissão dependente de temperatura foram preparados usando variedade de métodos de síntese, como tratamento hidrotérmico e solvotérmico, refluxo de calor e ablação a laser, como mostrado na Tabela 1. Os CDs preparados mostraram fluorescência linear dependente de temperatura nas faixas fisiológicas (mostrada na Tabela 1). A intensidade de fluorescência dos CDs diminuiu com aumento de temperatura. Além disso, a reversibilidade e restaurabilidade da intensidade de fluorescência foram estudadas em todos os artigos. A Figura 6 mostra algumas propriedades comuns de CDs estudadas em vários artigos.

a Fotografias digitais de CDs N,S sob luz UV (365 nm) excitação a diferentes temperaturas durante aquecimento (superior) e processos de resfriamento (inferior). (Reproduzido da referência [96]). b Espectros de emissão de fluorescência de CDs co-dopados N,S medidos na faixa de 5–75 °C (topo para base) quando excitados a 340 nm, inseto: regressão linear correspondente de temperatura versus Ln (F/F₀). (Reproduzido da referência [97]). c Gráficos FL/FL₀-temperatura de CDs MnOx durante processos de resfriamento e aquecimento. (Reproduzido da referência [103]). d Dependência de temperatura reversível do PL da solução de CDs. (Reproduzido da referência [102])

Nguyen et al. sintetizaram pontos de carbono (CDs) usando ablação a laser de femtossegundo de pó de grafite em etilenodiamina. Grupos funcionais abundantes foram formados na superfície, formando múltiplos estados de superfície no sítio de superfície e resultando em multi-emissão dos CDs. Eles investigaram a sensibilidade de temperatura dependente de fluorescência dos CDs usando espectros de fluorescência em estado estacionário. Os espectros de emissão dependentes de temperatura dos CDs a excitação 320 nm são mostrados na Fig. 7a. Ambas as intensidades de fluorescência dos picos 400 e 465 nm diminuem gradualmente com aumento de temperatura devido à ativação térmica de vias de decaimento não-radiativas. As intensidades dos picos mudam linearmente com temperatura variando de 5 a 85 °C (Fig. 7b). CDs sensíveis à temperatura mostraram mudança de intensidades de fluorescência de 3,3 e 2,1% por °C para picos 400 e 465 nm, respectivamente. Isso indica que os CDs podem ser usados como sensor de temperatura convencional baseado em intensidade com alta sensibilidade.

a Espectros de emissão de CDs registrados de 5 a 85 °C, excitados a 320 nm. b Intensidades de fluorescência dos picos 400 e 465 nm versus temperatura. c Razão do pico 400 nm sobre 465 nm como função de temperatura. d Estudo de reversibilidade de temperatura de CDs entre 20 e 50 °C. (Reproduzido da referência [14])

Notavelmente, a propriedade única de multi-emissão torna os CDs fluoróforos promissores para sensores de temperatura fluorescentes ratiométricos. A razão das duas intensidades de fluorescência a 400 e 465 nm (excitação 320 nm) versus temperatura é mostrada na Fig. 7c. Há uma relação linear muito boa entre a razão de intensidade dos picos e temperatura em ampla faixa de temperatura de 5 a 85 °C (R² = 0,998). Linearidade térmica é vantajosa pois torna a correlação entre razão de intensidade dos picos e temperatura direta e simultaneamente fornece sensibilidade térmica constante ao longo de toda a faixa dinâmica. A sensibilidade de temperatura dos CDs é determinada como 1,48% °C⁻¹, comparável à de outros materiais. Deve-se notar que a faixa de resposta de temperatura dos CDs é muito mais ampla que as de outros relatos sobre sensores de temperatura de dupla emissão e cobre tanto a temperatura fisiológica para estudos biológicos quanto a temperatura de trabalho para muitos dispositivos eletrônicos. Além de excitação 320 nm, os CDs também funcionam em outros comprimentos de onda de excitação, como 340 e 365 nm, com a mesma sensibilidade. Assim, os CDs podem ser utilizados para detecção de temperatura em muitas aplicações práticas selecionando diferentes comprimentos de onda de trabalho.

Eles mostraram que o sensor de temperatura ratiométrico era reversível entre 20 e 50 °C, quatro ciclos e fotostável (quando a intensidade da fonte de potência mudava) como mostrado na Fig. 7d. Este resultado sugere que o sistema de detecção de CDs é estável e robusto com quaisquer mudanças em concentração da amostra, excitação ou eficiência de detecção.

O aumento de temperatura nem sempre é acompanhado por quenching de PL; porém, poderia mostrar realce de PL também. Macairan et al. mostraram o realce de PL de pontos de carbono de dupla fluorescência com aumento de temperatura. Eles prepararam CDs de dupla fluorescência biocompatíveis em reação assistida por micro-ondas em uma etapa usando formamida e glutationa. Eles descobriram que após excitação a 640 nm, a intensidade de fluorescência e área integrada de PL aumentam sobre a faixa de 5–60 °C por um fator de 3,5 observado sobre toda a faixa de análise e temperatura (Fig. 8a). Como mostrado na Fig. 8b, uma resposta linear (R² = 0,999) é observada sobre toda a faixa de análise e a sensibilidade de temperatura foi determinada como alta como 3,71% °C⁻¹.

a Excitação a 640 nm produz aumento de 3,5 vezes na intensidade de fluorescência e a área integrada correspondente é plotada em b mostrando resposta linear sobre a faixa de 5–60 °C. c Mudanças nos espectros de fluorescência dos CDs (λex = 405 nm) como função de temperatura sobre toda a faixa. Diminuição de 1,3 vezes notada para fluorescência azul em contraste ao aumento de 3 vezes para o equivalente vermelho. d Razão das áreas integradas da fluorescência vermelha e azul são plotadas como função de temperatura mostrando aumento linear sobre toda a faixa de temperatura. (Reproduzido da referência [29])

A fluorescência dependente de temperatura também foi estudada após excitação a 405 nm. Curiosamente, as bandas de fluorescência azul e vermelha não são igualmente sensíveis à mudança de temperatura. Com aumento de temperatura, a intensidade de fluorescência (e a área integrada correspondente sob a curva) do componente azul mostra diminuição muito leve em contraste ao componente vermelho, que aumenta significativamente (Fig. 8c). Estas observações são notadas sobre a faixa de 5–60 °C onde a emissão azul diminui por fator de 1,3 em contraste à emissão vermelha, que aumenta por fator de 3,0.

Como mostrado na Fig. 8d, a razão de fluorescência vermelha para azul aumenta com temperatura, e uma resposta altamente linear é triplicada em 3 amostras únicas e o gráfico linear reflete o observado com R² = 0,998. Estas análises foram repetidas em uma média destas medições, que têm pequenos desvios em cada temperatura. A sensibilidade térmica dos CDs, sobre toda a faixa de temperatura, variou de 1,33 a 4,81% °C⁻¹, o que é uma melhoria sobre sistemas de nanotermometria de pontos de carbono previamente relatados e outros nanomateriais de dupla emissão como pontos quânticos e compostos corante-estruturas metal-orgânicas. A resolução térmica dos CDs foi calculada como 0,048 K⁻¹ indicando que é de fato possível medir pequenas mudanças térmicas.

Zhang et al. sintetizaram CDs que têm características responsivas a temperatura na faixa de 25–95 °C, e eles têm excelente sensibilidade e notável reversibilidade/recuperabilidade (Fig. 9a). Compostos CD/epóxi foram preparados dopando uniformemente CDs em resina epóxi. Primeiro, 5 μg de CDs foram dissolvidos em 50 μL de trietilenotetramina (TETA). Então, 350 μL de resina epóxi foram adicionados à solução mista e totalmente misturados por agitação de alta velocidade. O composto resultante mostrou resposta de temperatura significativamente melhorada.

a Dependência de temperatura da emissão de CD. b Compostos CD/epóxi. c Dependência de temperatura da emissão dos compostos CD/epóxi. (Reproduzido da referência [98])

Resina epóxi é uma resina termofixa comum e amplamente usada para encapsular chips LED. Figura 9b mostra micrografias ópticas de discos de composto CD/epóxi de aproximadamente 2 cm de diâmetro e 8–10 mm de espessura. Os compostos CD/epóxi curados são transparentes, e seus espectros de emissão de fluorescência são mostrados na Fig. 9c. O pico de emissão do composto CD/epóxi é deslocado para o azul em aproximadamente 10 nm comparado ao dos CDs em solução. Notavelmente, a resposta de temperatura do composto é significativamente melhorada. Na faixa de temperatura de 25–95 °C, a intensidade de fluorescência diminui 35% com aumento de temperatura, o que é mais que o dobro do estado de solução, e os resultados lineares são mais estáveis. A equação linear satisfaz I₀/I = 0,0074 [°C] + 0,80454 (R² = 0,99724), onde I₀ e I são a intensidade de fluorescência do composto CD/epóxi antes e depois do aumento de temperatura, e o comprimento de onda de excitação é 360 nm. O deslocamento para o azul do pico de emissão e o realce das características de resposta de temperatura podem ser devidos a mudanças na constante dielétrica do ambiente onde os CDs estão localizados. O composto tem ampla faixa de detecção de temperatura, e sua excelente sensibilidade e estabilidade o tornam adequado para uso como sensor de temperatura baseado em nanomaterial fluorescente em variedade de ambientes.

Mecanismo de Detecção Térmica

Até agora, não há mecanismo bem estabelecido para explicar o comportamento de detecção térmica de pontos de carbono. Alguns relatórios atribuem o mecanismo à ativação térmica de canais não-radiativos de estados de superfície (armadilha/defeito). A imagem geral é que os canais não-radiativos não eram ativados em baixas temperaturas, então os elétrons excitados podiam emitir fótons radiativamente. Por outro lado, à medida que a temperatura aumenta, mais canais não-radiativos tornam-se ativados, e elétrons excitados voltam ao estado fundamental por processos não-radiativos, levando à diminuição da intensidade de fluorescência. O mecanismo de emissão dos CDs com aquecimento/resfriamento é mostrado na Fig. 10.

Ilustração esquemática de CDs respondendo a mudanças de temperatura

Para melhor entender a termodinâmica dos processos de emissão de CD, Kalytchuk et al. correlacionaram as taxas de recombinação radiativa (τᵣ⁻¹) e não-radiativa (τₙᵣ⁻¹) de uma amostra de CD com seu rendimento quântico de PL. A taxa radiativa é determinada do rendimento quântico de PL (QY) e da taxa de recombinação medida τ⁻¹ como τᵣ⁻¹ = QY × τ⁻¹. A taxa de relaxamento não-radiativo τₙᵣ⁻¹ é expressa como τₙᵣ⁻¹ = τ⁻¹ - τᵣ⁻¹. O QY de PL dos CDs em várias temperaturas foi calculado de sua absorção dependente de temperatura e intensidade PL integrada junto com o QY de PL determinado à temperatura ambiente. Ambas as taxas de recombinação radiativa e não-radiativa derivadas de dados de medição de PL resolvida no tempo são plotadas como funções de temperatura na Fig. 11. A taxa de recombinação radiativa é maior que a taxa não-radiativa correspondente até 70 °C e não varia apreciavelmente a temperaturas entre 2 e 80 °C, permanecendo na faixa de (0,74–0,82) × 10⁶ s⁻¹. Em contraste, há um aumento monótono pronunciado (quase 7 vezes, de 0,16 × 10⁶ a 1,12 × 10⁶ s⁻¹) na taxa de recombinação não-radiativa ao aumentar a temperatura de 2 a 80 °C. Cruzamento dependente de temperatura das taxas radiativa e não-radiativa ocorre a 70 °C, temperatura na qual o QY de PL é 50%. Estes resultados sugerem que a ativação de temperatura do quenching de PL em seus CDs é causada principalmente pela ativação de canais de relaxamento não-radiativos.

Taxas de recombinação radiativa (símbolos sólidos, cor azul) e não-radiativa (símbolos ocos, cor vermelha) para CDs plotadas contra a temperatura para temperaturas de 2–80 °C. (Reproduzido da informação suplementar da referência [89])

Guo et al. atribuíram o quenching térmico de seus pontos de carbono preparados não apenas à ativação do processo de decaimento não-radiativo, mas também à ocorrência de aprisionamento não-radiativo com aumento de temperatura. Eles mediram os tempos de vida de decaimento dependentes de temperatura dos CDs e mostrados na Fig. 12a. Os dados foram coletados monitorando o máximo de emissão como função da temperatura sob excitação a laser 320 nm. O resultado mostra que o tempo de vida PL cai de 15,03 a 11,70 ns com temperatura aumentando de 283 a 343 K, o que poderia ser atribuído à ocorrência de processos de decaimento não-radiativos. Além disso, a dinâmica de relaxamento PL dos CDs revela decaimento multi-exponencial com aumento de temperatura, sugerindo que portadores fotoexcitados seguem processos de relaxamento complicados. A ocorrência de aprisionamento não-radiativo aumentará com temperatura crescente, e isso pode ser analisado quantitativamente pelo gráfico de Arrhenius das intensidades PL integradas como:

I = I₀ / [1 + a exp(-Eₐ/kT)]

Curvas de decaimento dependentes de temperatura da solução de CDs (a, λex = 350 nm, λem = 450 nm); dependência de ln[(I₀/I_T)-1] em 1/kT solução de CDs (b). (Reproduzido da referência [102])

onde Eₐ é a energia de ativação, k é a constante de Boltzmann, e a é uma constante. Figura 12a exibe o gráfico da intensidade de emissão em relação a 1/T, onde o valor de energia de ativação (Eₐ) é calculado como 0,329 ± 0,02 eV. Para sondar a razão do quenching térmico do processo de emissão de CDs, as taxas de recombinação radiativa (Vᵣ) e não-radiativa (Vₙᵣ) dos CDs foram determinadas do tempo de vida (τ*) e rendimento quântico (QY) como:

τ* = 1/(Vᵣ + Vₙᵣ); QY = Vᵣ/(Vᵣ + Vₙᵣ)

O QY dos CDs em várias temperaturas foi calculado de sua absorção dependente de temperatura e intensidade PL integrada com o QY determinado à temperatura ambiente. Eles notaram que as taxas radiativas têm leve declínio quando a temperatura sobe de 283 a 343 K; ao mesmo tempo, as taxas de recombinação não-radiativa aumentaram gradualmente cerca de 2 vezes. Estes resultados indicam ainda que o quenching de PL ativado por temperatura em CDs é principalmente devido à ativação de canais de relaxamento não-radiativos.

Outros grupos usaram técnicas microscópicas e espectroscópicas para entender o mecanismo de detecção térmica de pontos de carbono.

Wang et al. usaram TEM e espectros UV-Vis para estudar o comportamento de PL responsivo a temperatura de CDs preparados. Como mostrado na Fig. 13a, os CDs não exibem mudança nos espectros UV-Vis ao aumentar a temperatura de 20 a 80 °C. No entanto, verificou-se que o diâmetro médio dos CDs aumentou de 2,6 ± 0,2 nm à temperatura ambiente para 4,4 ± 0,2 nm a 80 °C (Fig. 13b). Assim, aumentando a temperatura, ocorreu agregação dos CDs preparados, o que causou quenching de fluorescência óbvio.

a Espectros de absorção UV-Vis de CDs em solução aquosa sob 20 e 80 °C. b imagem TEM de CDs em solução aquosa (a) à temperatura ambiente, tamanho médio 2,6 ± 0,2 nm (b) a 80 °C, tamanho aumentou até 4,4 ± 0,2 nm. (Reproduzido da referência [1])

He et al. relataram que o tamanho de partícula hidratado de seus CDs emerge como maior com aumento de temperatura (Fig. 14a), indicando que o aumento de temperatura dá origem à agregação dos CDs, eventualmente resultando em quenching de fluorescência. No entanto, com o declínio da temperatura, o tamanho de partícula hidratado dos CDs começa a declinar (Fig. 14b), indicando que o resfriamento tem potencial de causar despolimerização dos CDs.

Mudança do tamanho de partícula hidratado de pontos de carbono durante aquecimento (a) e resfriamento (b). (Reproduzido da referência [101])

Outro grupo como Cui et al. também atribuiu o quenching de fluorescência à agregação de CDs. Eles também tentaram aplicar CDs não-dopados sintetizados usando apenas ácido acrílico como precursor em sensores de temperatura. Infelizmente, CDs não-dopados possuíam efeitos de quenching mais fracos sob a mesma elevação de temperatura que CDs dopados.

Yang et al. em seu trabalho propuseram dois fatores-chave concernentes à propriedade de PL dependente de temperatura dos N-CDs, incluindo (i) grupos funcionais de superfície e (ii) interação de ligação de hidrogênio. Para examinar o efeito do primeiro fator, os grupos superficiais contendo O, outro experimento controle foi conduzido tratando N-CDs (4,0 mL) com forte agente redutor NaBH₄ (1,0 mL, 0,1 mol L⁻¹) para remover espécies C=O na superfície dos pontos de carbono. Os N-CDs reduzidos obtidos são denotados como r-N-CDs para brevidade. Comparados com N-CDs, os r-N-CDs exibem intensidade de fluorescência mais fraca (Fig. 15a). Além disso, a intensidade de fluorescência de r-N-CDs diminui apenas 13% com temperatura aumentando de 20 a 80 °C (inseto na Fig. 15a) que dá sensibilidade de temperatura muito menor, atribuída aos grupos contendo O diminuídos.

a Espectros PL (comprimento de onda de excitação, 400 nm) de N-CDs (traço preto) e r-N-CDs (traço vermelho). O inseto mostra I/I₀−T de N-CDs reduzidos. b Espectros PL (comprimento de onda de excitação, 400 nm) de N-CDs dispersos em C₂H₅OH a várias temperaturas. c Mecanismo esquemático para intensidade de fluorescência dependente de temperatura de N-CDs. (Reproduzido da referência [94])

O segundo fator, o efeito de ligação de hidrogênio com o solvente no comportamento fluorescente de N-CDs foi explorado. Solução de N-CDs (1,0 mL) foi gotejada em papel de filtro e deixada secar no ar para obter amostra sólida, que ainda emite fluorescência brilhante. No entanto, nenhuma mudança óbvia de intensidade de fluorescência dos N-CDs sólidos com aumento de temperatura foi observada. Eles também mediram a fluorescência de N-CDs dispersos em etanol. A intensidade de fluorescência de N-CDs em C₂H₅OH é menor que em água e pouca variação da intensidade PL é observada com temperatura aumentando de 20 a 80 °C (Fig. 15b). Portanto, as fortes ligações de hidrogênio desempenham papel chave na propriedade de PL dependente de temperatura dos N-CDs. Figura 15c é mecanismo esquemático para intensidade de fluorescência dependente de temperatura de N-CDs.

No entanto, nosso grupo usou a mesma estratégia experimental do grupo Yang; em ambos os casos, as emissões de r-CDs e e-CDs foram quenchadas linearmente com aumento de temperatura, da mesma forma que os resultados originais de seus CDs (Fig. 16). Assim, nossos resultados descartaram os efeitos sinérgicos de abundantes grupos funcionais contendo oxigênio e ligações de hidrogênio.

a, b Espectros de fluorescência de CDs reduzidos (r-CDs) e CDs em etanol (e-CDs) a temperaturas (20 a 60 °C). c, d Correlação linear entre intensidade de fluorescência e temperatura (°C) para r-CDs e e-CDs respectivamente. (Reproduzido da informação suplementar da referência [77])

Bioimagem em Células Vivas (Imagem Térmica)

Na literatura, apenas alguns artigos exploraram as propriedades fluorescentes responsivas a temperatura de CDs em imagem biológica. Antes de tais experimentações, análise de citotoxicidade in vitro é crucial para CDs porque eles permitem estimar a toxicidade dos CDs em sujeitos vivos. Análise de citotoxicidade in vitro avalia o efeito ou influência do nanomaterial em células cultivadas.

Yang et al. verificaram que os CDs poderiam ser usados como termômetro eficaz em células vivas; células HeLa foram lavadas com PBS após tratamento com CDs por 6 h. Fluorescência azul brilhante dos CDs em células HeLa é observada quando a temperatura é 25 °C como mostrado na Fig. 17a. Com temperatura aumentando a 37 °C, a fluorescência azul torna-se mais fraca (Fig. 17b), a fluorescência de N-CDs é recuperada quando a temperatura diminuiu a 25 °C (Fig. 17c). Como termometria in vivo, as imagens fluorescentes de camundongos foram coletadas imediatamente após injeção com N-CDs a diferentes temperaturas. Definindo a intensidade de fluorescência a 28 °C como referência (I₀), I/I₀ da área onde CDs foram injetados varia de 1,0 a 0,87 com aumento de temperatura de 28 a 34 °C (Fig. 17d, e). Com temperatura aumentando mais a 43 °C, I/I₀ declina a 0,52 e a fluorescência torna-se quase indetectável (Fig. 17f). E I/I₀ pode ser reversivelmente realçado de volta de 0,66 a 1,0 com temperatura diminuindo de 39 a 28 °C (Fig. 17g–i). Todos estes resultados indicaram que N-CD poderia ser usado como nanotermômetro eficaz in vitro e in vivo.

a–c Imagens fluorescentes de uma única célula Hela a 25, 37 e 25 °C após tratamento com N-CDs, respectivamente. d–f Fotografias fluorescentes de camundongo injetado com N-CDs a temperaturas crescentes. g–i Fotografias fluorescentes de camundongo injetado com N-CDs a temperaturas decrescentes. (Reproduzido da referência [94])

Em experimento exploratório, Kalytchuk et al. testaram a capacidade de CDs para monitoramento de temperatura intracelular em células de câncer cervical humano HeLa. Figura 18 mostra as temperaturas intracelulares medidas de células HeLa incubadas com CDs (500 μg/mL). As curvas de decaimento PL dos CDs em cada temperatura foram altamente reprodutíveis e puderam ser ajustadas com função monoexponencial em todas as temperaturas registradas. Na Fig. 18a, as curvas de decaimento PL registradas para temperaturas entre 25 e 50 °C (com passo de 5 °C) são indicadas por símbolos, enquanto os ajustes monoexponenciais correspondentes são representados por linhas sólidas. Eles puderam confirmar que o sinal PL nestas medições de tempo de vida PL foi derivado exclusivamente dos CDs para concentração de CD ≥ 100 μg/mL. A temperatura intracelular em cada medição foi determinada da curva de calibração entre tempos de vida PL à medida que a temperatura aumenta de 2 a 80 °C. As temperaturas determinadas desta forma (T_meas) são plotadas como funções do tempo de vida PL na Fig. 18b. Independentemente, a temperatura da solução celular foi determinada usando termômetro de referência calibrado (mostrado na Fig. 18b como T_set). As temperaturas relatadas pela sonda luminescente de CD e detector de referência estão em bom acordo. Estes resultados mostram que o tempo de vida PL de nanossondas baseadas em CDs pode ser confiavelmente usado para medir temperaturas intracelulares.

Detecção térmica intracelular de tempo de vida PL in vitro usando CDs. a Decaimentos de emissão PL de células HeLa incubadas com CDs (500 μg/mL) a diferentes temperaturas (T_set). b Temperaturas determinadas usando calibração (T_meas) e temperaturas definidas (T_set) plotadas contra tempo de vida PL. c–f Aplicabilidade de CDs para monitoramento remoto de temperatura intracelular de longo prazo. c Tempos de vida PL extraídos de transientes PL registrados a cada 15 min por 24 h de células HeLa incubadas com CDs (500 μg/mL). d Temperaturas determinadas usando curva de calibração. e Temperaturas medidas com termômetro de referência (T_ref). f Histograma mostrando distribuição de diferenças de temperatura entre obtidas e de referência; linha sólida é curva de distribuição. (Reproduzido da referência [89])

Para avaliar ainda mais o potencial de nanossondas luminescentes baseadas em CD para monitoramento de temperatura em tempo real de longo prazo, perfis de decaimento PL de células HeLa incubadas com CDs (500 μg/mL) a cada 15 min por 24 h foram registrados. Os tempos de vida PL extraídos dos valores de decaimento PL medidos durante este período foram então plotados como funções do tempo, como mostrado na Fig. 18c. Usando estes resultados, a variação de temperatura ao longo do tempo foi calculada usando a curva de calibração, como mostrado na Fig. 18d. Além disso, a temperatura da amostra em cada ponto de medição foi determinada usando termômetro de referência com reprodutibilidade de temperatura de 60 mK. A temperatura determinada com termômetro de referência é plotada na Fig. 18e, mostrando excelente acordo entre temperaturas medidas e de referência. A alta precisão das medições de temperatura baseadas em PL é ainda demonstrada por análise estatística das diferenças entre temperaturas medidas e reais (referência) (Fig. 18f). Usando estes dados, a precisão média absoluta de detecção de temperatura pelo método apresentado foi calculada como 0,27 °C. Este experimento confirma o potencial de sondas térmicas baseadas em CD em sistemas biológicos.

Macairan et al. mostraram que os CDs preparados podem ser usados para detecção térmica dentro de células usando abordagens de intensidade e ratiométricas. Células HeLa tratadas com CDs foram permitidas equilibrar a 32, 37 e 42 °C (Fig. 19). Excitação a 640 nm foi usada para monitorar seletivamente a fluorescência vermelha dos CDs nas células. As mudanças térmicas poderiam ser devidas a mudanças na concentração intracelular ou não correlacionar com mudança de intensidade (λex + 640 nm). Isso poderia ser devido a mudanças na concentração intracelular ou localização dos CDs a temperaturas mais altas. Assim, confiar simplesmente em mudanças de intensidade de fluorescência leva a detecção térmica intracelular precisa.

Imagens de microscopia de fluorescência de células HeLa tratadas com CDs. Sinais de fluorescência dos CDs (λex = 640 nm; esquerda e 405 nm; direita) razões de fluorescência são 1,8 a 32 °C, 2,0 a 37 °C e 2,3 a 42 °C. Controle mostra células HeLa não tratadas a 42 °C sem sinal de fluorescência como esperado. (Reproduzido da referência [29])

Em contraste, estas limitações são excluídas usando abordagem ratiométrica. Os CDs mantêm fluorescência azul e vermelha dual em células após excitação a 405 nm, como previamente observado para dispersões coloidais (Fig. 19). A razão vermelho-azul aumenta com aumento de temperatura, com valores de 1,8 a 32 °C, 2,0 a 37 °C e 2,3 a 42 °C. A relação ratiométrica da fluorescência vermelho-azul dos CDs destaca a vantagem da detecção de temperatura ratiométrica no desenvolvimento de sondas nano-termométricas fluorescentes. A razão de emissão vermelho-azul relativa permanece inalterada, independentemente da quantidade de CDs absorvidos pelas células, que pode ser afetada por vários fatores como confluência e não é dependente de concentração. Por fim, os CDs mostraram reversibilidade de fluorescência em relação a mudanças de temperatura intracelular. Após incubação em células HeLa, foram submetidos a ciclo de aquecimento/resfriamento de 32/42/32 °C. Isso enfatiza a robustez do nanotermômetro de CD proposto e estes achados demonstram ainda a reversibilidade de fluorescência.

Microscopia confocal a laser foi usada para imagem térmica de célula de câncer de cólon HT-29 usando CDs dopados N, S e I, como mostrado na Fig. 20. Os pontos fluorescentes eram dependentes de temperatura como mostrado na Fig. 20g–i, sendo o mais intenso a 15 °C, enquanto o ponto mais fraco foi a 35 °C. Curiosamente, os pontos fluorescentes eram reversíveis, e os pontos eram muito fotostáveis após 20 min de excitação contínua. Shin et al. também usaram microscopia confocal a laser para células Hela, mostrado na Fig. 20e–g.

a–d São imagens de microscopia confocal de CDs N,S,I-célula de câncer de cólon HT-29 com campo de fluorescência correspondente a 15, 25, 35 e 15 °C, respectivamente. (Reproduzido da referência [100]). e–g Imagens de microscopia confocal de células coradas com CDs N,S com campo de fluorescência correspondente a 25, 35 e 25 °C, respectivamente. (Reproduzido da referência [96])

Li et al. prepararam um nanocompósito composto de CDs MnOx para ser usado como fluoróforo nano termo-responsivo para ambientes biológicos. Células HepG2 foram incubadas com CDs MnOx a diferentes temperaturas de cultura. Como ilustrado por microscopia confocal a laser (excitado a 405 nm), a luminescência azul dos CDs MnOx nas células HepG2 é fraca quando a temperatura ambiental era 40 °C (Fig. 21a), e a luminescência azul dos CDs MnOx nas células HepG2 realça à medida que a temperatura diminuiu a 30 °C (Fig. 21b) até 20 °C (Fig. 21c). Devido às propriedades termo-responsivas, os CDs MnOx sintetizados podem ser prontamente aplicados em campos biomédicos como bioimagem e terapia fototérmica no tratamento de câncer.

Imagens de microscopia confocal a laser (excitado a 405 nm) de CDs MnOx em células HepG2 a 40 °C (a), a 30 °C (b) e 20 °C (c). (Reproduzido da referência [103])

Conclusões e Perspectivas Futuras

Pontos nanométricos de carbono exibem propriedades únicas para serem exploradas para nanotermometria, como sensibilidade térmica, baixo custo e fotostabilidade. Modificação de superfície flexível e preparação fácil pavimentarão o caminho para estabelecer um enorme número de nanomateriais termosensíveis para variedade de aplicações. As tendências gerais em nanomateriais de detecção térmica visam aumentar fotostabilidade e resolução térmica usando materiais de baixo custo e seguros. CDs podem ser classificados como nova geração de termômetro que pode atender estes requisitos e ser usado para aplicações de termometria biomédica, como monitoramento de temperatura durante tratamento de hipertermia. Protocolos de preparação fáceis, biocompatibilidade e fácil funcionalização de CDs são critérios promissores que tornam os CDs materiais alternativos de nanotermômetro de próxima geração. Mais esforços são necessários para promover pesquisa básica neste campo. Limitações devem ser superadas para produzir nanotermômetros baseados em pontos de carbono compreendendo aumento de sensibilidade térmica e funcionamento em faixa mais ampla de temperatura. Melhor compreensão do mecanismo de detecção térmica de fluorescência é outra questão chave para poder projetar e manipular a estrutura de CDs e aumentar resolução térmica. Mais experimentos e modelagem teórica são necessários para entender a correlação entre métodos de fabricação de CDs com seu comportamento térmico.