F-actina Mediada a Diferenciação Osteogênica de Células-Tronco Mesenquimais em Nanotubos de TiO2 via MKL1 e YAP/TAZ

Resumo

O titânio e suas ligas são amplamente utilizados em implantes ortopédicos. A modificação da nanotopografia oferece uma nova estratégia para melhorar a osseointegração de substratos de titânio. A polimerização da F-actina (actina filamentosa), como estrutura de carga mecânica, é geralmente considerada envolvida na migração celular, endocitose, divisão celular e manutenção da forma celular. Se a F-actina participa e como funciona na diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (CTMs) induzida por nanotubos permanece a ser elucidado. Neste estudo, fabricamos nanotubos de TiO₂ na superfície de um substrato de titânio por oxidação anódica e caracterizamos suas propriedades por microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise de energia dispersiva de raios X (EDS) e microscopia de força atômica (AFM). Realizaram-se coloração de fosfatase alcalina (ALP), Western blotting, qRT-PCR e imunofluorescência para explorar o potencial osteogênico, o nível de F-actina e a expressão de MKL1 e YAP/TAZ. Nossos resultados mostraram que o diâmetro interno e a rugosidade dos nanotubos de TiO₂ aumentaram com o aumento da tensão de oxidação anódica de 30 a 70 V, enquanto sua altura manteve-se constante em 2 μm. Além disso, quanto maior o diâmetro do tubo, maior a capacidade dos nanotubos de TiO₂ de promover a diferenciação osteogênica de CTMs. A inibição da polimerização da F-actina pela Citocalasina D (Cyto D) inibiu a diferenciação osteogênica de CTMs, bem como a expressão de proteínas contidas em complexos de adesão focal, como vinculina (VCL) e quinase de adesão focal (FAK). Em contraste, após tratamento com Jasp, a polimerização da F-actina aumentou a expressão de RhoA e dos fatores de transcrição YAP/TAZ. Com base nesses dados, concluímos que os nanotubos de TiO₂ facilitaram a diferenciação osteogênica de CTMs, e essa capacidade foi aprimorada com o aumento do diâmetro dos nanotubos dentro de uma certa faixa (30–70 V). A F-actina mediou esse processo através de MKL1 e YAP/TAZ.

Introdução

O titânio e suas ligas, devido à sua excelente biocompatibilidade, resistência à corrosão e propriedades mecânicas, são amplamente utilizados em aplicações clínicas como substituições totais de articulações e implantes dentários [1,2,3]. No entanto, ainda existem muitos desafios a serem resolvidos, incluindo afrouxamento asséptico e infecção [4, 5]. Nos últimos anos, diversos estudos voltados a melhorar a osseointegração e propriedades antibacterianas foram realizados. Por exemplo, o revestimento MoS₂/PDA-RGD em implantes de titânio não só promove a integração do implante com o osso hospedeiro, mas também inibe o crescimento bacteriano com alta eficiência [6]. Além disso, a topografia de superfície tem atraído cada vez mais atenção, e a modificação topográfica difere das modificações químicas por alterar apenas a estrutura em micro e nanoescala. A estimulação de sinais químicos nas células é instável e citotóxica. Em comparação, sinais físicos seguros e controláveis podem evitar alguns efeitos colaterais causados por moléculas químicas. Portanto, a modificação topográfica da superfície de implantes e a regulação da osseointegração através da estrutura topográfica podem fornecer uma nova maneira de resolver o problema clínico de má osseointegração após a implantação de próteses.

No campo da engenharia de tecido ósseo e regeneração óssea, a interação célula-morfologia é considerada uma estratégia promissora para o controle preciso da função e diferenciação de células-semente. Ao mesmo tempo, o próprio osso possui uma hierarquia elegante dentro da faixa de nanômetros e mícrons [7]. Portanto, a morfologia de superfície pode fornecer um nicho semelhante, que pode imitar a estrutura óssea natural e promover a diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais na superfície do osso hospedeiro e do implante. As morfologias de superfície podem consistir em muitas estruturas diferentes, incluindo nanotubos, nanofios, nanoporos, entre outros. Em particular, arranjos de nanotubos têm atraído amplo interesse em muitos campos nos últimos anos devido às suas características únicas de superfície, como alta relação superfície/volume, plasticidade biológica e alta capacidade de adsorção. Por exemplo, um novo estudo mostra que nanotubos de nitreto de boro (BNNT) constituem um material sensível a gás que pode ser usado como sensor de gás para monitorar a operação de transformadores detectando a composição e o conteúdo de gases dissolvidos no óleo [8]. Na biomedicina, a topografia de superfície também é capaz de direcionar comportamentos celulares, incluindo migração, adesão, proliferação e diferenciação celular. Os estudos mais recentes revelam que a topografia em nanoescala pode direcionar células-tronco mesenquimais (CTMs) a se diferenciarem em osteoblastos, reforçando a osseointegração precoce [9,10,11,12]. Chega-se a relatar que a modificação combinada de superfície em micro e nanoescala pode fazer com que CTMs se diferenciem em células musculares lisas contráteis [13]. No entanto, os mecanismos moleculares de como a topografia de superfície direciona o destino celular ainda precisam ser elucidados, o que é importante para a avaliação de segurança de materiais e design de materiais.

A F-actina (actina filamentosa), também chamada de microfilamento, é um dos três principais componentes do citoesqueleto em células eucarióticas. É composta por polímeros de actina globular (G-actina), modificada por numerosas outras proteínas. A F-actina possui polaridade estrutural devido ao fato de que todas as subunidades do microfilamento apontam para a mesma extremidade. A extremidade farpada é direcionada a um monômero adjacente diferente, enquanto a extremidade pontiaguda possui uma subunidade de actina com o sítio de ligação de ATP exposto. Ou seja, o ATP está envolvido no processo de transformação entre G-actina e F-actina. Esse processo está em equilíbrio dinâmico, com polimerização e despolimerização ocorrendo simultaneamente, também conhecido como "treadmilling", frequentemente observado em lamelipódios e filopódios [14]. Portanto, é óbvio que a dinâmica da actina desempenha um papel importante em funções celulares como migração celular, divisão celular e manutenção da forma celular. No entanto, a F-actina não atua apenas como uma estrutura física de suporte à carga mecânica, mas também participa de outros comportamentos biológicos, como transdução de sinal e expressão gênica. Evidências acumuladas demonstram que a F-actina pode converter sinais físicos em sinais químicos interagindo com outras proteínas [15,16,17,18]. Por exemplo, a reconstrução biomecânica e geométrica promove a apoptose de células tumorais impedindo a superposição da polimerização de monômeros de actina em F-actina [15]. Pulsos de ultrassom aumentam a osteogênese de células-tronco mesenquimais humanas inibindo a despolimerização da F-actina [16]. Nosso estudo anterior também mostrou que a tensão mecânica aumenta a estabilidade da F-actina [17]. Como a estrutura oca dos nanotubos fornece menos sítios de adesão para as células, a reorganização do citoesqueleto é inevitável para manter o equilíbrio biomecânico. Consequentemente, definitivamente temos razão para acreditar que a F-actina provavelmente medeia a diferenciação celular induzida por nanotopografia.

Neste estudo, fabricamos nanotubos de TiO₂, modificamos sua topografia por oxidação anódica e exploramos sua capacidade de promover a diferenciação osteogênica de CTMs. Em seguida, investigamos se a F-actina desempenha um papel crítico na mecanotransdução. A Citocalasina D (Cyto D), que se liga competitivamente à extremidade farpada da F-actina para impedir a incorporação de G-actina no filamento, foi usada para inibir a polimerização da F-actina, e a jasplakinolida (Jasp) foi usada para aumentar a estabilização da montagem de actina. Além disso, também quisemos elucidar como a F-actina funciona na transformação de pistas físicas em sinais bioquímicos. Com base nos resultados de nosso estudo anterior, hipotetizamos que a via MAPK pode estar envolvida nesse processo [17]. Fatores de transcrição como a proteína associada a Yes (YAP)/coativador transcripcional com motivo de ligação PDZ (TAZ) e MKL1, considerados mecanossensores e mecanotransdutores, também foram objeto de nosso estudo para rastrear como a F-actina influencia o destino das células-tronco, porque alguns estudos em outras áreas sugeriram que eles estavam relacionados à F-actina [19,20,21]. Em geral, esperamos esclarecer o papel da F-actina no processo de diferenciação de células-tronco induzida por nanotubos, de modo a guiar o design de materiais e a avaliação de biossegurança de implantes modificados por nanotubos.

Materiais e Métodos

Fabricação de Nanotubos de TiO₂

Fatias de titânio puro (pureza 99,9%, espessura 2 mm; Shengshida, Hebei, China), usadas como substrato, foram polidas com lixa de carbeto de silício de grão 400 e 1500. As amostras foram então lavadas sequencialmente com acetona, álcool anidro e água desionizada em uma máquina de limpeza ultrassônica, e finalmente secas à temperatura ambiente por 3 h. Para fabricar a nanotopografia, as amostras pré-tratadas foram fixadas como ânodo, enquanto se usava uma peça de platina como catodo contrário em uma solução aquosa de eletrólito de 0,15 M NH₄F e 90% glicol por 1 h. A tensão de anodização foi uma tensão constante de 30, 40, 50, 60 ou 70 V. Após a oxidação anódica, cada amostra foi enxaguada com água desionizada por 30 min e lavada com álcool anidro em uma máquina de limpeza ultrassônica por 15 min. Finalmente, todas as amostras foram esterilizadas em autoclave a 120 °C por 1 h e umedecidas com meio de cultura antes do uso.

O mecanismo de reação da fabricação de nanotubos não é claro, e a teoria atual predominante é a teoria da dissolução realçada por campo. A formação de arranjos de nanotubos é o resultado de equilíbrio dinâmico sob a ação de oxidação de campo, dissolução de campo e dissolução química (Fig. 1b). O processo de anodização pode ser descrito da seguinte forma: na primeira etapa, uma camada de barreira de óxido é formada na interface eletrólito-metal:

$$ {\mathrm{Ti}}^{4+}+2{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}\to {\mathrm{Ti}\mathrm{O}}_2+4{\mathrm{H}}^{+} $$ (1)

Então, rachaduras e fendas estreitas aparecem na superfície devido à dissolução realçada por campo da camada de óxido. A difusão de íons F⁻ nessas rachaduras e fendas aumenta a taxa de dissolução. As rachaduras aumentam e se conectam com rachaduras vizinhas. Finalmente, a taxa de formação e a taxa de dissolução da camada de óxido de titânio atingem um equilíbrio dinâmico, e os nanotubos não crescem mais:

$$ {\mathrm{TiO}}_2+6{\mathrm{F}}^{-}+4{\mathrm{H}}^{+}\to {\left[{\mathrm{TiF}}_6\right]}^{2-}+2{\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$ (2)

Caracterização de Superfície

Amostras fabricadas com diferentes tensões (30, 40, 50, 60 ou 70 V) foram enxaguadas com etanol e água desionizada por 15 min, depois secas à temperatura ambiente. Microscopia eletrônica de varredura (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foi usada para caracterizar a estrutura de superfície e medir o diâmetro interno e a altura dos nanotubos após revestir as amostras com uma fina camada de ouro. Simultaneamente, a análise de energia dispersiva de raios X (EDS) foi realizada para analisar a composição elementar dos nanotubos. Microscopia de força atômica (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Bélgica) foi usada para investigar a morfologia de superfície e a rugosidade das amostras. Três áreas diferentes foram selecionadas de cada amostra e as medições foram repetidas três vezes.

Cultura Celular

Ratos Sprague-Dawley (SD) machos de quatro semanas foram adquiridos do centro de animais experimentais do Hospital Nove de Shanghai (Shanghai, China). Células-tronco mesenquimais da medula óssea de rato (BMSCs) foram assépticamente isoladas de fêmures e tívias. As BMSCs foram purificadas e expandidas em meio α-mínimo essencial (α-MEM; Hyclone, Logan, UT, EUA) contendo 10% (v/v) soro fetal bovino (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 100 mg/mL estreptomicina (Gibco) e 100 U/mL penicilina (Gibco), e incubadas a 37 °C em atmosfera umidificada consistindo de 95% ar e 5% CO₂. O meio de cultura foi renovado a cada 2 dias, e as células foram tripsinizadas e subcutivadas a 80% de confluência. Todas as células usadas neste estudo estavam entre as passagens 3 e 5. O meio de indução osteogênica foi composto por meio de crescimento suplementado com 100 nM dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato e 50 mM ácido ascórbico (Sigma–Aldrich, St Louis, MO, EUA).

Ensaio de Proliferação Celular

As fatias de titânio modificadas com nanotubos de TiO₂ foram cortadas em formatos circulares e colocadas em poços de uma placa de cultura celular de 24 poços. BMSCs entre passagens 3–5 foram cultivadas em nanotubos de TiO₂ a uma densidade de 3 × 10⁴ células/disco em meio de crescimento ou meio osteogênico. Após 2 dias de cultura celular, a citocalasina D (Cyto D, Sigma–Aldrich) e a jasplakinolida (Jasp, Sigma–Aldrich), usadas para interromper a polimerização da F-actina, foram adicionadas ao meio diariamente por 3 dias. A concentração final e o tempo de trabalho de Cyto D e Jasp foram 5 μM, 1 h e 2 μM, 3 h, respectivamente. O meio de cultura foi renovado após incubação com os reagentes. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas usando o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japão) 12 h após o tratamento com Cyto D ou Jasp. As células foram incubadas com 10% (v/v) solução CCK8 por 2 h em uma incubadora celular a 37 °C sob 5% CO₂. Em seguida, transferimos 100 μL da mistura de reação para poços de uma placa de 96 poços e a absorbância (OD) do produto de corante formazan na cultura foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro UV-visível Multiscan (Safire2; TECAN, Mannedorf, Suíça). Além disso, também contamos números aproximados de células usando um contador celular automatizado (AMQAX1000, Life Technologies). Antes da contagem celular, as BMSCs foram enzimaticamente desprendidas dos nanotubos de TiO₂ e coradas com azul de tripano (Sigma–Aldrich).

Coloração de Fosfatase Alcalina e Análise de Atividade ALP

BMSCs foram semeadas em cinco diferentes fatias de titânio modificadas com nanotubos de TiO₂ (30, 40, 50, 60 ou 70 V) a uma densidade de 3 × 10⁴ por poço e cultivadas em meio osteogênico. Os reagentes foram adicionados conforme descrito acima. Após 7 dias de incubação, as BMSCs cultivadas em nanotubos de TiO₂ foram lavadas três vezes com PBS, fixadas com 4% paraformaldeído e incubadas em solução de trabalho de fosfatase alcalina (ALP) de um kit ALP de acordo com as instruções do fabricante (Hongqiao, Shanghai, China). Os resultados foram observados sob um microscópio estereoscópico após lavagem com PBS.

Para análise de atividade ALP, as células foram primeiro lisadas com tampão RIPA sem inibidores de protease e fosfatase, e então os lisados centrifugados foram analisados usando um Kit de Ensaio ALP (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China) seguindo o protocolo fornecido. A atividade foi finalmente normalizada à concentração de proteína do lisado correspondente.

Imunocitoquímica

Após 3 dias de tratamento com Cyto D e Jasp, as BMSCs foram fixadas com 4% paraformaldeído por 20 min à temperatura ambiente e então lavadas três vezes com PBS. As células foram permeabilizadas com 0,3% Triton-X 100 por 30 min, lavadas três vezes com PBS e coradas com faloidina conjugada à rodamina por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, as células foram enxaguadas com PBS e contra-coradas com DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology) por 10 min à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais com PBS, as amostras foram fixadas em lâmina de vidro e observadas por microscopia confocal.

Western Blotting

Para avaliar a expressão proteica, as BMSCs cultivadas em nanotubos de TiO₂ foram colhidas com tripsina (Gibco). As células foram lavadas três vezes com PBS e lisadas com tampão RIPA suplementado com um coquetel inibidor de protease e fosfatase por 30 min no gelo. O lisado foi coletado por centrifugação a 12.000×g por 15 min a 4 °C. A concentração de proteínas totais no sobrenadante foi medida usando um kit de ensaio de proteína ácido bicinchônico (BCA) (Beyotime) de acordo com as instruções do fabricante. Tampão de carregamento foi adicionado às amostras de proteína como acima, que foram então fervidas a 95 °C por 15 min. Para análise de Western blotting, 10 μL da preparação de proteína foram carregados em um gel SDS-PAGE a 12,5% (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, EUA) e submetidos a eletroforese a 120 V por 1 h, então eletrotransferidos para uma membrana de polivinilidenodifluoreto (PVDF) a 250 mA por 2 h. As membranas foram então bloqueadas com 5–10% leite desnatado seco em TBST por 1 h em um agitador à temperatura ambiente e incubadas com anticorpo primário diluído em tampão de diluição (Beyotime) a 4 °C durante a noite. Em seguida, anticorpo secundário conjugado a fluorescente diluído em tampão de diluição foi adicionado às membranas após lavagem três vezes com TBST por 5 min, e as membranas foram então incubadas à temperatura ambiente por 1 h no escuro. As bandas de proteína foram detectadas por um sistema de imagem de fluorescência infravermelha de duas cores (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, EUA). Em particular, se as bandas da proteína de referência interna fossem unificadas, a membrana foi desprovada e reprobada com outro anticorpo primário, seguido pelo mesmo processo. Usamos anticorpo GAPDH como nossa proteína de referência interna para normalizar a expressão proteica, e os outros anticorpos primários usados neste estudo foram anti-vinculina (diluição 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-FAK (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), anti-Runx2 (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology), anti-RhoA (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology), anti-F-actina (diluição 1:500, Abcam), anti-Osx (diluição 1:500, Abcam) e anti-pYAP (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology). Anticorpos secundários foram anticorpo de cabra anti-camundongo IgG H&L (IRDye® 680RD, diluição 1:5000, Abcam) e anticorpo de cabra anti-coelho IgG H&L (IRDye® 680RD, diluição 1:5000, Abcam).

PCR Quantitativo em Tempo Real

O PCR quantitativo em tempo real foi realizado no dia 7 para avaliar a expressão gênica do fator de transcrição relacionado a runt 2 (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteocalcina (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculina (VCL), quinase de adesão focal (FAK) e leucemia megacarioblástica 1 (MKL1) em células cultivadas em meio osteogênico em nanotubos de TiO₂. RNA total foi extraído das células usando um Kit RNA Total (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, EUA). A concentração e pureza das amostras de RNA foram determinadas por densidade óptica em comprimento de onda de 260 e apenas amostras apresentando razões A260/280 e A260/230 superiores a 1,8 foram analisadas. As amostras de RNA foram retrotranscritas em cDNA usando um kit de síntese cDNA qScript (Takara, Shiga, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. O PCR quantitativo em tempo real foi realizado com SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) usando um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH, um gene de housekeeping, foi usado como referência interna. Os dados foram analisados usando o método Ct comparativo (2^-ΔΔCt) e expressos como mudanças de dobra em comparação ao controle. As sequências dos primers usados estão listadas na Tabela 1.

Análise Estatística

Todos os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes usando amostras em triplicata, a menos que indicado de outra forma. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Diferenças entre grupos foram avaliadas por análise de variância de um sentido seguida pelo teste post-hoc Student-Newman-Keuls ou teste t de Student. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Caracterização de Superfície

Para fabricar a nanotopografia, nanotubos de TiO₂ foram formados em um substrato de titânio puro usando equipamento de oxidação anódica em diferentes tensões constantes (30, 40, 50, 60 e 70 V) por 1 h (Fig. 1). Um arranjo uniformemente distribuído de nanotubos auto-montados foi observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Vistas lateral e superior dos nanotubos são mostradas na Fig. 2a, b. A altura dos nanotubos em todas as amostras neste estudo foi de aproximadamente 2 μm, enquanto os diâmetros internos dos nanotubos foram de aproximadamente 74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V) e 148 nm (70 V) (Fig. 2c). Isso indicou que a altura dos nanotubos estava relacionada ao tempo de oxidação anódica e o diâmetro interno estava relacionado à tensão de oxidação anódica. A análise de energia dispersiva de raios X (EDS) foi então realizada para analisar a composição elementar dos nanotubos. Isso mostrou que os nanotubos consistem apenas de dois elementos, O e Ti (Fig. 2d, e). A microscopia de força atômica (AFM) foi usada para detectar as estruturas nanotubulares e medir o desvio médio aritmético do perfil dos nanotubos como rugosidade de superfície (Ra) (Fig. 2f). Os dados mostraram que a rugosidade de superfície dos nanotubos aumentou à medida que o diâmetro (ou seja, a tensão de oxidação anódica) aumentou (Fig. 2g).

Nanotubos de TiO₂ Induziram Diferenciação Osteogênica de CTMs

Após 7 dias de osteoindução, a coloração ALP foi realizada primeiro para avaliar a diferenciação osteogênica de CTMs. Os resultados da coloração mostraram que CTMs cultivadas em nanotubos de TiO₂ tiveram maior atividade ALP do que células cultivadas em substrato de titânio liso (grupo controle) (Fig. 3a). A análise estatística da área de coloração demonstrou que a capacidade dos nanotubos de induzir diferenciação osteogênica foi significativamente aprimorada em comparação com o grupo controle. Enquanto isso, observamos uma tendência de que, dentro da faixa de diâmetro deste experimento, quanto maior o diâmetro dos nanotubos de TiO₂, maior a capacidade de induzir diferenciação osteogênica (Fig. 3b). Assim, o grupo 70 V foi usado em experimentos subsequentes para melhor exibir os resultados. Em seguida, analisamos a expressão gênica osteogênica nos dias 3 e 7. CTMs cultivadas em nanotubos de TiO₂ por 3 dias e 7 dias mostraram promoção significativa da expressão de genes osteogênicos (RUNX2, ALP, OCN e OSX) em comparação com o grupo controle (Fig. 3d–g). Resultados de Western blot confirmaram que a expressão proteica de RUNX2 e OSX também aumentou após 7 dias de osteoindução (Fig. 3c). Curiosamente, descobrimos que a F-actina foi upregulada no grupo de nanotubos de TiO₂. Portanto, era óbvio que os nanotubos de TiO₂ direcionaram as CTMs para diferenciação em osteoblastos, o que estava relacionado ao diâmetro dos nanotubos. Nossos resultados também sugeriram o envolvimento da F-actina nesse processo.

F-actina Mediou a Diferenciação Osteoblástica de CTMs em Nanotubos de TiO₂

Para explorar ainda mais se a F-actina estava envolvida na diferenciação celular induzida por nanotopografia, usamos dois reagentes, jasplakinolida (Jasp) e citocalasina D (Cyto D), para regular a polimerização da F-actina de forma positiva e negativa, respectivamente. As fotomicrografias confocais de coloração com Rodamina-Faloidina mostraram que a F-actina no grupo de tratamento com Cyto D foi quase despolimerizada e estruturas fibrosas raramente foram vistas, enquanto Jasp estabilizou e polimerizou a F-actina, verificado por estruturas mais distintas e brilhantes do tipo feixe do que observado no grupo controle (Fig. 5a). Além disso, a análise de Western blot também confirmou que a expressão proteica da F-actina foi afetada, o que provou que Cyto D e Jasp atuaram como esperado (Fig. 5b). O ensaio de proliferação celular mostrou que Cyto D inibiu significativamente a proliferação celular, enquanto Jasp promoveu o crescimento celular (Fig. 4a). Os resultados de contagem celular foram consistentes com essa descoberta (Fig. 4b).

Em seguida, avaliamos a capacidade das CTMs de se diferenciarem em osteoblastos para investigar se a F-actina mediava esse processo. Primeiro, detectamos ALP como marcador precoce de osteogênese. Comparado com o grupo controle, o tratamento com Cyto D reduziu a expressão de ALP e sua atividade, enquanto a do grupo de tratamento com Jasp foi upregulada (Fig. 4c, d). Consistente com esse resultado, o tratamento com Jasp resultou em aumento nos níveis proteicos de RUNX2 e OSX, enquanto Cyto D teve o efeito oposto (Fig. 4c). De acordo com isso, os níveis de expressão de mRNA de genes osteo-específicos, incluindo RUNX2, ALP, OCN e OSX, mostraram a mesma tendência após o tratamento com fármacos (Fig. 4e–h). Acima de tudo, esses dados indicaram que a F-actina desempenhou um papel importante no processo de diferenciação osteogênica de CTMs induzida por nanotubos de TiO₂. Promover a despolimerização da F-actina inibiu a diferenciação osteoblástica induzida por nanotopografia, enquanto a estabilização e polimerização da F-actina aumentou a diferenciação osteoblástica.

F-actina Regulou a Diferenciação Osteoblástica de CTMs em Nanotubos de TiO₂ Através de MKL1 e YAP/TAZ

Para dissecar o mecanismo subjacente envolvendo a F-actina na regulação do destino das CTMs, investigamos proteínas/moléculas que interagem diretamente com a F-actina ou afetam a polimerização da F-actina. Primeiro, tentamos identificar como a nanotopografia afetou o equilíbrio entre F-actina e G-actina. Os nanotubos de TiO₂ como sinal físico diferem de sinais químicos permeáveis à membrana e, portanto, devem usar alguns componentes da membrana celular para transmitir estímulos para dentro das células. Evidências acumuladas indicam que o complexo de adesão focal, incluindo integrina, talina, quinase de adesão focal (FAK), vinculina (VCL), tensina e outras proteínas, funciona como um transportador de sinal, que informa as células sobre a condição da matriz extracelular (MEC) e, assim, afeta seu comportamento biológico [22, 23]. Mais importante, a F-actina se liga a integrinas através de tais complexos de adesão focal, formando assim ligações mecânicas entre feixes de actina intracelulares e a MEC [24]. Consequentemente, analisamos a seguir a expressão de componentes do complexo de adesão focal. Os resultados mostraram que a expressão proteica e de mRNA de VCL e FAK foram consistentes com a mudança da F-actina, indicando que o complexo de adesão focal estava envolvido no processo de diferenciação osteogênica de CTMs induzida por nanotubos de TiO₂ (Figs. 5b and 6a, b). Além disso, também descobrimos que RhoA, uma pequena proteína GTPase na família de GTPases Rho, foi upregulada no grupo de tratamento com Jasp e inibida por Cyto D (Figs. 5b and 6a, b). RhoA é uma importante molécula de transdução de sinal a montante na via MAPK e pode ser regulada por FAK [25, 26]. A função primária de RhoA é promover a polimerização e estabilidade de fibras de estresse (F-actina) e montagem do complexo de adesão focal [27]. Juntos, esses dados sugeriram que os nanotubos de TiO₂ poderiam influenciar a polimerização da F-actina através do complexo de adesão focal e RhoA.

Mas como a F-actina regula o destino celular? A maioria dos estudos demonstrou que a F-actina está envolvida na migração celular, divisão celular, endocitose e, especialmente, invasão de células tumorais [28,29,30]. Poucos estudos sugeriram que a F-actina também poderia regular a diferenciação celular, muito menos seu mecanismo molecular específico [31, 32]. Consequentemente, buscamos artigos que mencionassem mudanças na F-actina e descobrimos que YAP/TAZ, dois coativadores transcripcionais intimamente relacionados na via de sinalização Hippo, que se deslocam entre o citoplasma e o núcleo, podem servir como mecanotransdutores na regulação da diferenciação de CTMs [33,34,35]. Além disso, também descobrimos que MKL1, um regulador chave da diferenciação de células musculares lisas, que interage com o fator de transcrição fator de resposta sérica, pode se ligar à G-actina e também circular entre o citoplasma e o núcleo [21, 36]. Nossos resultados finalmente identificaram o envolvimento de YAP/TAZ e MKL1 na diferenciação osteoblástica induzida por nanotubos mediada pela F-actina (Figs. 5b and 6d–f). Curiosamente, a expressão proteica de YAP fosforilada mostrou a tendência oposta, indicando que não apenas a expressão de YAP foi alterada, mas a fosforilação de YAP também foi alterada por Cyto D e Jasp (Fig. 5b). Esse resultado foi consistente com o relato de que a fosforilação de YAP/TAZ pode ser sequestrada no citoplasma [35].

Em resumo, nossos resultados demonstraram preliminarmente que a F-actina regulou a diferenciação osteoblástica de CTMs em nanotubos de TiO₂ através de MKL1 e YAP/TAZ (Fig. 7).

Discussão

O titânio e suas ligas são os materiais metálicos mais amplamente utilizados em implantes clínicos ortopédicos devido às boas propriedades do titânio [3]. No entanto, o afrouxamento asséptico ainda é um problema urgente a ser resolvido e melhorado, e a chave provavelmente reside em melhorar a integração do implante e do osso hospedeiro. Estudos anteriores mostraram que revestimento e modificação de superfície ou imobilização de moléculas biofuncionais serão benéficos para a osseointegração [37]. Recentemente, a topografia de superfície de implantes atraiu a atenção de muitos pesquisadores graças a estudos sobre a resposta celular a pistas físicas [9,10,11, 13, 38]. Neste estudo, demonstramos a capacidade dos nanotubos de promover a diferenciação osteogênica de CTMs, e essa capacidade foi aprimorada com o aumento do diâmetro interno dos nanotubos (30–70 V). Isso ajudará a guiar o diâmetro dos nanotubos na superfície dos implantes.

Como estrutura topográfica, os nanotubos primeiro alteram as propriedades físicas do material, como capacidade de adsorção e condutividade elétrica e térmica. Essas propriedades físicas determinam sua aplicação no campo industrial. Por exemplo, a maioria dos transformadores de alta potência precisa ser preenchida com material isolante, que geralmente é óleo de transformador ou gás isolante. Quando o isolamento de um transformador falha devido a superaquecimento e descarga parcial, um acidente grave de descarga ocorrerá. Portanto, encontrar um método eficaz que detecte com precisão a concentração e tipos de gases dissolvidos ou componentes de decomposição de gás isolante em um transformador é necessário para monitorar o estado operacional do transformador [8, 39,40,41]. A abordagem tradicional é procurar materiais com boa adsorção de gás em elementos de transição, que são ricos em elétrons d, como Pd(1 1 1) [39]. Atualmente, nanotubos são amplamente estudados por suas boas propriedades de adsorção de gás. He et al. descobriram que CuO-BNNT era adequado para adsorção de C₂H₂, devido à sua adsorção mais forte em C₂H₂ [8]. Enquanto isso, o próprio TiO₂ pode ser um material sensor de gás. Gui et al. descobriram que TiO₂ dopado com Co aumentou ainda mais a capacidade de adsorção de gás e exibiu capacidade de adsorção superior e mudança de condutividade em relação a moléculas de C₂H₄ [40]. Consistente com este estudo, grafeno dopado com Mn também exibiu condutividade aprimorada e capacidade superior de detecção de C₂H₂ e CO do que grafeno puro [41]. A pesquisa acima indica que os nanotubos de TiO₂ preparados em nosso experimento têm uma aplicação potencial no campo de monitoramento do estado operacional de um transformador. No entanto, a capacidade de adsorção e condutividade elétrica dos nanotubos a gases precisam ser estudadas mais, especialmente se essas propriedades são aprimoradas após dopagem com elementos de transição (ex: Mn).

Além de alterar as propriedades físicas de uma superfície, a morfologia em nanoescala também afeta o comportamento biológico das células aderidas a ela. As células primeiro aderem à superfície do material e então migram, proliferam e se diferenciam. Comparado a uma superfície plana, a estrutura oca dos nanotubos fornece menos sítios de adesão para as células. Portanto, para que as células adiram à superfície do nanotubo de forma estável e mantenham o equilíbrio biomecânico dentro da célula, o complexo de adesão focal começa a se montar e amadurecer, e a F-actina torna-se forte e estável.

A F-actina, um microfilamento polimérico linear consistindo de monômeros de G-actina, é um dos três principais componentes do citoesqueleto. Como estrutura de carga mecânica, a F-actina é geralmente considerada envolvida na divisão celular, migração celular, endocitose e invasão de células tumorais [28,29,30], mas alguns estudos recentes mostraram que ela também pode afetar a diferenciação celular [31,32,33, 36]. Por exemplo, a despolimerização do citoesqueleto de actina por sinvastatina induz diferenciação de condrócitos [31], e a despolimerização de actina aumenta a diferenciação adipogênica em células estromais humanas [32]. Nossos resultados também revelaram que, em comparação com o grupo controle, CTMs cultivadas em nanotubos tiveram níveis mais altos de F-actina e uma estrutura fibrosa mais óbvia. Enquanto isso, a promoção da polimerização da F-actina por Jasp aumentou a diferenciação osteogênica, enquanto a despolimerização da F-actina inibiu a diferenciação osteogênica, sugerindo que a F-actina medeia a diferenciação osteoblástica de CTMs induzida por nanotubos de TiO₂.

A F-actina pode ser regulada por Rho GTPases, membros da superfamília Ras [23, 42], e Rho pode induzir reorganização de actina através de pelo menos dois efetores, ROCK e Dia. ROCK é ativado pela ligação a Rho-GTP e então a cadeia leve de miosina (MLC), o substrato de ROCK, desempenha um papel importante na montagem da F-actina. ROCK inibe a atividade de fosfatase de MLC, levando a um aumento na fosforilação de MLC, que estimula a atividade ATPase de miosina II e promove a montagem de F-actina. Além disso, ROCK também alvo quinase LIM (LIMK). LIMK fosforilado inativa cofilina por fosforilação, que pode desmontar F-actina em seu estado ativo. Outro efetor é Dia, um membro da família de proteínas de homologia de formina (FH) que contém dois domínios FH. Esses domínios contêm múltiplos motivos ricos em prolina que se ligam à proteína de ligação a G-actina, profilina. Essa interação contribui para a polimerização de actina e organização de F-actina [42]. Detectamos uma das Rho GTPases, RhoA, e descobrimos que a expressão de RhoA foi consistente com o nível de F-actina. No entanto, não conseguimos descrever claramente como os nanotubos regulam a expressão de RhoA, porque existem muitos outros reguladores, incluindo sinalização de integrina, outros receptores de adesão, receptores acoplados a proteína G (GPCRs), fatores solúveis como LPA, sinalização de receptor tirosina quinase, e assim por diante [43].

Sabendo que a F-actina pode ser regulada por RhoA, perguntamos a seguir qual o papel da adesão focal nesse processo, porque complexos de adesão focal, contendo integrinas, talina, vinculina, paxilina e quinase de adesão focal (FAK), são formados e amadurecem quando as células aderem à superfície de nanotubos. Integrinas são heterodímeros transmembrana que acoplam a MEC a outras proteínas de adesão focal para facilitar a adesão celular. Elas não atuam apenas como ganchos, mas também transmitem à célula sinais críticos sobre a natureza de seu entorno, que junto com outros sinais como EGFR, levam a célula a tomar decisões sobre seus comportamentos biológicos. Esses sinais são transmitidos ainda à F-actina, que está diretamente conectada aos complexos de adesão focal. Por um lado, a morfologia em nanoescala causa montagem e amadurecimento do complexo de adesão focal. Por outro lado, quinases como FAK e membros da família de quinase Src recrutarão moléculas como CRK para autorregular a montagem e amadurecimento dos complexos de adesão focal [44,45,46]. Nossos resultados demonstraram que a formação e amadurecimento dos complexos de adesão focal foram prejudicados pela despolimerização da F-actina, sugerindo que havia um feedback dos complexos de adesão focal para a montagem de actina, em linha com relatórios publicados.

No entanto, não se deve ignorar que essas proteínas contidas em complexos de adesão focal têm função de transdução de sinal [47]. Ou seja, os nanotubos podem regular diretamente a expressão gênica através de cascatas de sinal, e a F-actina pode apenas participar ou ser afetada por esse processo. Por exemplo, o complexo de quinase dual de FAK e Src pode regular Rho GTPases como RhoA. Isso mostra que os nanotubos podem regular RhoA através de integrinas e do complexo FAK/Src. Além disso, Src, uma proteína quinase tirosina não-receptora, pode ativar Ras (pequena GTPase) fosforilando FAK no resíduo de tirosina 925 [47, 48]. Então, Ras ativa numerosas vias bioquímicas, incluindo a bem estudada via MAPK e a via PI3K/AKT/mTOR. Na via MAPK, Ras ativa c-Raf, seguido por quinase de proteína ativada por mitógeno quinase (MAP2K) e então MAPK1/2, também conhecida como quinase regulada por sinal extracelular (ERK). ERK, por sua vez, ativa fatores de transcrição como fator de resposta sérica (SRF) e c-Myc que estão envolvidos na regulação de crescimento e diferenciação [49]. Além disso, Runx2, um fator de transcrição chave na diferenciação osteogênica, também pode ser regulado por ERK [50], e nosso estudo anterior confirmou que a tensão mecânica promoveu a diferenciação osteogênica de BMSCs através da via FAK-Erk1/2-Runx2 [17]. Portanto, não podemos descartar que ERK desempenhe um papel na diferenciação osteogênica induzida por nanotubos e mais estudos ainda são necessários.

Então, qual exatamente é o papel da F-actina na indução de diferenciação por nanotubos, porque sua mudança pode afetar a diferenciação celular? Uma possibilidade é que a mudança na montagem de F-actina possa regular inversamente o nível de FAK para induzir diferenciação osteogênica através da via FAK-Erk1/2-Runx2 descrita acima, porque em nossos resultados, complexos de adesão focal e polimerização de actina mostraram as mesmas tendências de mudança, indicando que eles atuam como um todo em resposta ao ambiente extracelular. No entanto, outras possibilidades também existem, e vários artigos mostraram que MKL1 e YAP/TAZ atuam a jusante do equilíbrio dinâmico de actina [20, 51,52,53,54]. Ambos se deslocam entre o citoplasma e o núcleo e podem ajudar a transduzir sinais do citoesqueleto para o núcleo.

MKL1, também denominado fator de transcrição relacionado a miocardina A, é sensível a mudanças nos níveis de G-actina citoplasmática. Quando os níveis de G-actina monomérica citoplasmática aumentam, a G-actina monomérica se liga a MKL1 e impede sua ligação a SRF e ativação da transcrição. Genes alvo de SRF incluem actinas como actina de músculo liso (SMA) e outras proteínas de ligação a actina, incluindo genes de resposta imediata como c-fos e egr1. Estudos recentes demonstraram que a mudança na atividade de SRF poderia regular adipogênese ativando o fator de transcrição adipogênico receptor ativado por proliferador de peroxissomo γ (PPARγ), e também regular a formação óssea via sinalização IGF-1 e Runx2 [55, 56].

YAP e TAZ são dois coativadores transcripcionais na via de sinalização Hippo, identificada como uma importante via regulatória que restringe a proliferação celular, controlando assim o tamanho e morfogênese do órgão [20]. Genes supressores de tumor grandes 1 e 2 (LATS1/2) os fosforilam, criando assim um sítio de ligação para proteínas 14-3-3, cuja ligação impede sua importação nuclear [53, 54]. Como consequência, formas fosforiladas de YAP/TAZ são sequestradas no citoplasma, impedindo a expressão de genes como Ctgf e Areg. Além disso, alguns estudos mostraram que YAP/TAZ podem interagir com T-box 5 (TBX5), RUNX2 e p73 para regular a expressão gênica [57,58,59]. Além disso, a adesão celular a proteínas de matriz celular demonstrou desencadear localização nuclear de YAP através de um eixo integrina/FAK/Src. Em nosso estudo, os resultados sugeriram que essa via estava possivelmente envolvida na diferenciação induzida por nanotubos. Mais estudos sobre os mediadores a jusante do eixo integrina/FAK/Src devem ser realizados para esclarecer o mecanismo específico.

Por outro lado, cada vez mais estudos ilustram que a F-actina interage com a sinalização Hippo, e de alguma forma inibe a fosforilação de YAP [54, 60], o que é consistente com nossos resultados experimentais de que promover a polimerização da F-actina reduz a expressão de YAP fosforilada. Hipotetizamos que o ATP envolvido no processo de transformação entre G-actina e F-actina também pode desempenhar um papel importante na fosforilação de YAP, o que ainda precisa ser estudado.

Após entender os possíveis mecanismos moleculares acima, podemos tentar explicar alguns dos fenômenos experimentais encontrados neste estudo. Nossos resultados revelaram que quanto maior o diâmetro dos nanotubos, maior a capacidade dos nanotubos de promover a diferenciação osteogênica. Isso é consistente com pesquisas anteriores [61, 62]. A razão para esse fenômeno é que quanto maior o diâmetro dos nanotubos, menos sítios de adesão eles podem fornecer às células, e maior a montagem e amadurecimento dos complexos de adesão focal. Junto com isso, fibras de estresse feitas de F-actina terão maior força e estabilidade. Essas estruturas aumentam a sinalização que promove a diferenciação osteogênica. Previsivelmente, no entanto, esse efeito é significativamente reduzido quando os nanotubos se tornam muito grandes em diâmetro, dificultando a adesão das células à superfície [12]. Da mesma forma, quando a altura dos nanotubos é inconsistente, as diferenças de altura podem resultar em mudança de sítio de adesão e reorganização do citoesqueleto, o que afetará ainda mais a diferenciação celular. Curiosamente, mesmo materiais de superfície plana sem modificação por nanotubos podem induzir mudanças na diferenciação celular. Vários estudos demonstraram que a formação de adesão focal e organização de fibras de estresse são reguladas pela rigidez do substrato [63,64,65], e YAP/TAZ também desempenha um papel importante nesse processo. Portanto, é óbvio que o eixo integrinas–Afs (adesões focais)–F-actina desempenha um papel na transdução de sinais físicos em sinais químicos intracelulares.

Em resumo, nossos resultados demonstraram que a F-actina regula a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais em nanotubos de TiO₂ através de MKL1 e YAP/TAZ, cujos genes alvo explicam parcialmente a proliferação e diferenciação de CTMs. Sabemos que não há mudança única na rede de sinais e qualquer mudança é regulada por numerosas moléculas e proteínas. Um tipo de comportamento biológico deve ser o resultado da regulação de uma série de vias de sinalização. Nanotubos induzem diferenciação celular desencadeando uma rede complexa de sinais, incluindo integrinas, proteínas contidas em complexos de adesão focal, FAK, Src, Rho GTPase, via MAPK, via Hippo e outras vias de sinalização relatadas. Pelo menos tão importante, existem muitos ciclos de sinal na rede de sinais e um sinal a jusante pode regular o sinal a montante via feedback. Neste estudo, descobrimos que vinculina e FAK podem ser reguladas retroativamente pela montagem de F-actina, aumentando a incerteza da função molecular. Portanto, mais detalhes do mecanismo molecular aguardam estudos futuros.

Conclusões

Nossos resultados mostraram que os nanotubos de TiO₂ promoveram a diferenciação osteogênica de CTMs, e essa capacidade foi aprimorada com o aumento do diâmetro dos nanotubos dentro de uma certa faixa (30–70 V). A F-actina mediou a diferenciação celular induzida por nanotubos através de MKL1 e YAP/TAZ, fornecendo uma nova visão para o estudo da diferenciação celular.