Resposta de osteoblasto a revestimentos microporosos dopados com cobre em titânio para integração óssea aprimorada

Resumo

Devido às suas excelentes propriedades mecânicas e boa biocompatibilidade, as ligas de titânio se tornaram um tópico de pesquisa popular no campo de implantes metálicos médicos. No entanto, a superfície da liga de titânio não exibe atividade biológica, o que pode causar má integração entre a interface do implante de titânio e a interface do tecido ósseo e, subsequentemente, pode causar a queda do implante. Portanto, a inércia biológica da superfície é um dos problemas que as ligas de titânio devem superar para se tornar um material de implante ortopédico ideal. A modificação da superfície pode melhorar as propriedades biológicas do titânio, aumentando assim seu efeito de osseointegração. O cobre é um oligoelemento essencial para o corpo humano, pode promover a formação óssea e desempenha um papel importante na manutenção da estrutura fisiológica e função do osso e no crescimento e desenvolvimento ósseo. Neste estudo, um revestimento microporoso de cobre-dióxido de titânio foi preparado na superfície do titânio por oxidação de microarc. Com base na avaliação das características de sua superfície, foram observadas a adesão, proliferação e diferenciação das células MC3T3-E1. Uma haste de titânio foi implantada no côndilo femoral de coelho e a integração do revestimento e do tecido ósseo foi avaliada. Nossos resultados de pesquisa mostram que o revestimento microporoso de cobre-dióxido de titânio tem uma estrutura porosa quase tridimensional, e o cobre é incorporado ao revestimento sem alterar a estrutura do revestimento. Experimentos in vitro descobriram que o revestimento pode promover a adesão, proliferação e diferenciação de células MC3T3-E1. Experimentos in vivo confirmaram ainda que o revestimento microporoso de titânio cobre-dióxido de titânio pode promover a osseointegração de implantes de titânio. Em conclusão, revestimentos microporosos de cobre-dióxido de titânio podem ser preparados por oxidação de microarc, o que pode melhorar a atividade biológica e biocompatibilidade do titânio, promover a formação de osso novo e demonstrar boas propriedades osteoindutoras. Portanto, o uso desse revestimento em ortopedia tem potencial aplicação clínica.

Introdução

Um material de implante de tecido duro médico deve ter propriedades mecânicas adequadas, como resistência, módulo de elasticidade, resistência ao desgaste e resistência à fadiga, de modo que o implante possa suportar a carga fisiológica da área implantada por um longo tempo. Ao mesmo tempo, o material deve ter boa biocompatibilidade e até bioatividade para que o implante possa formar uma boa combinação com o tecido fisiológico da área de implantação sem causar reações adversas no corpo humano. Titânio puro e ligas de titânio têm boas propriedades mecânicas e biocompatibilidade e são atualmente os materiais de implante de metal mais amplamente usados.

Depois que o implante é implantado, uma série de reações bioquímicas ocorrem primeiro na superfície do material, e as características da superfície desempenham um papel vital na resposta do implante ao ambiente interno. A microestrutura e a composição química da superfície do implante podem alterar a adsorção de proteínas, e as proteínas regulam a adesão celular e, em última análise, determinam sua função [1]. Embora o titânio e as ligas de titânio sejam os materiais de implantes ortopédicos mais amplamente usados, o titânio não tem atividade biológica. Após a implantação no corpo, não consegue formar uma ligação química com o tecido ósseo da área de implantação. O titânio e as ligas de titânio dependem principalmente do intertravamento mecânico para alcançar a retenção [2] e não conduzem à função física de longo prazo no corpo.

O revestimento de superfície de implantes de titânio pode complementar as propriedades mecânicas do titânio e superar suas deficiências relacionadas à baixa atividade biológica; ou seja, o titânio como substrato pode fornecer propriedades mecânicas e elementos com boa estrutura de superfície e atividade biológica são usados ​​como revestimento. Essa camada fornece atividade biológica, e a pesquisa nessa área se tornou um ponto importante de pesquisa.

Atualmente, as tecnologias utilizadas para a preparação de revestimentos bioativos em superfícies de metal incluem principalmente pulverização de plasma, deposição assistida por feixe de íons, deposição eletroforética, deposição de vapor físico a laser pulsado, oxidação de microarc, deposição de magnetron sputtering, sol-gel, revestimento de laser direto e ablação a laser [3,4,5,6,7,8,9,10]. Entre eles, a tecnologia de pulverização de plasma tem aplicações comerciais; no entanto, a tecnologia de revestimento atual ainda não atende aos requisitos clínicos, principalmente devido aos seguintes problemas:a fase bioativa do revestimento tem baixa cristalinidade e baixa bioatividade; a força de ligação entre o revestimento e o substrato não é boa; o material interno do revestimento é facilmente dissolvido, o que afeta a estabilidade a longo prazo do revestimento no corpo; e o processo de preparação do revestimento é muito complicado, as condições do processo são rígidas, o custo é alto e a eficiência é baixa [11].

A oxidação de micro-arco, uma tecnologia de modificação de superfície eficaz que é atualmente amplamente utilizada na modificação de superfície de implantes de metal, usa o efeito de sinterização instantânea de plasma de alta temperatura e alta pressão; não apenas a superfície do material gera uma superfície áspera e porosa, mas também podem ser introduzidos no revestimento elementos biologicamente ativos. A superfície do material modificado pela tecnologia de oxidação de micro-arco pode melhorar significativamente a morfologia da superfície, rugosidade, hidrofobicidade e energia superficial do material da matriz e outras propriedades físicas e químicas, de modo que a atividade biológica e a biocompatibilidade do material sejam bastante melhoradas. A osseointegração entre o material importado e o tecido ósseo é de grande importância [12].

O cobre (Cu) é um oligoelemento essencial no corpo humano que possui uma variedade de funções, incluindo a promoção do crescimento de osteoblastos e a promoção da expressão do fator de crescimento endotelial vascular nos tecidos da íntima, o que é benéfico para a adesão e proliferação do endotélio vascular células. O Cu também aumenta a reação de peroxidação lipídica, inibe a síntese de DNA bacteriano ativo e enzimas relacionadas que interferem no metabolismo energético das bactérias e não levam facilmente à resistência aos medicamentos [13]; mais importante, os íons de cobre em uma certa faixa de concentração são reconhecidos como tendo alta atividade biológica e excelentes propriedades antibacterianas. Portanto, os íons de cobre têm demonstrado ter boa biocompatibilidade quando usados ​​no projeto de biomateriais [14].

A interação entre as células e o implante é um fator importante na indução da formação de uma interface de osseointegração. Essa interação depende principalmente das propriedades do material da superfície do implante, como a composição química da superfície, energia superficial, carga superficial e morfologia da superfície. Essa interação entre células e implantes pode afetar a adesão, proliferação e diferenciação celular. Foi comprovado que uma superfície porosa aumenta a adesão, proliferação e diferenciação celular, e os implantes dopados com íons inorgânicos (zinco, estrôncio, magnésio, etc.) também promovem a osseointegração [15, 16].

O processo do equipamento de oxidação de microarc é simples e as propriedades do revestimento preparado podem ser ajustadas. Os revestimentos dopados com íons diferentes podem ser preparados alterando a composição do eletrólito. O cobre desempenha um papel importante no organismo. A quantidade adequada de íons de cobre no revestimento pode promover a proliferação de osteoblastos e inibir a adesão de bactérias de superfície. Portanto, neste estudo, preparamos um Cu – TiO microporoso ₂ revestimento na superfície de titânio e experimentos de células in vitro e experimentos com animais usados ​​para observar e analisar o efeito do Cu – TiO microporoso ₂ revestimento sobre a atividade de superfície e biocompatibilidade do titânio. Também procuramos explorar a viabilidade do Cu – TiO microporoso ₂ revestimento como um novo tipo de material de revestimento de implante para aumentar a adesão, proliferação e diferenciação osteogênica de células MC3T3-E1 e promover a formação e osseointegração de novo osso na interface osso-implante para estabelecer uma base teórica e experimental para a aplicação clínica de Cu – TiO microporoso ₂ revestimento na superfície de implantes de titânio.

Materiais e métodos

Preparação e caracterização da amostra

Por meio do corte com fio, o titânio foi processado em uma amostra com diâmetro de 12 mm e espessura de 1 mm. Os implantes foram confeccionados em hastes de titânio com diâmetro de 3 mm e comprimento de 8 mm. A lixa foi alisada e lavada com acetona e água desionizada para preparação do revestimento. Neste estudo, uma fonte de alimentação de oxidação de microarc de baixa potência caseira foi usada; a tensão de oxidação do micro-arco foi de 450 V, o modo foi de corrente constante, o tempo de oxidação do microarco foi de 5 min e a frequência foi de 1000 Hz.

O grupo de controle em branco foi marcado com Ti, e acetato de cálcio e glicerofosfato de cálcio foram usados ​​como soluções eletrolíticas básicas. As amostras de Ti após a oxidação do microarc na solução de eletrólito básico foram marcadas com TCP, e as amostras após a oxidação do microarc com diferentes teores de óxido de cobre na solução de eletrólito básico foram marcadas com TCP Cu I e TCP Cu II (Tabela 1).

Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM) foi usada para observar a morfologia da superfície das amostras, espectroscopia de energia dispersiva (EDS) foi usada para observar a distribuição do elemento na superfície do revestimento e perfilador de rugosidade da superfície foi usado para avaliar a rugosidade de amostras diferentes. Difração de raios-X (XRD) e espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) foram usados ​​para observar a composição elementar e microestrutura da fase de revestimento e estado químico.

Cultura de células

Células MC3T3-E1 (extraídas de células de crânio de camundongos) foram usadas para teste de células in vitro. As células foram incubadas em MEM com 10% de soro fetal bovino α a 37 ℃ em 5% de CO ₂ . Quando as células se fundiram e cresceram até 80% de densidade, foram digeridas e passadas com 0,25% de tripsina. A terceira passagem foi usada para experimentos com células.

Coloração viva / morta

A citotoxicidade de cada grupo foi avaliada por coloração de fluorescência viva / morta. A densidade de semeadura celular era 1,5 × 10 ⁴ células / cm ² . Após 3 dias de cultura, as amostras foram enxaguadas com PBS estéril e tratadas de acordo com o kit de viabilidade viva / morta / citotoxicidade. A citotoxicidade do material foi observada por microscopia de fluorescência.

Adesão e proliferação celular

As células foram inoculadas na superfície de cada grupo a uma densidade de 1,5 × 10 ⁴ células / cm ² . Após incubação por 1 h, 2 h e 6 h, as células foram enxaguadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min. Após o enxágue com PBS, 40 μL do agente de coloração DAPI foram derramados na superfície da amostra por 10 min para evitar a coloração de luz, e as amostras foram observadas e fotografadas com um microscópio confocal a laser.

A densidade de semeadura celular e o método de cultura foram os mesmos que os anteriores, e a atividade de proliferação das células foi medida com o kit CCK-8 1, 3 e 10 dias após a cultura celular.

Expressão de genes relacionados à diferenciação osteogênica

A densidade de inoculação de células e o método de cultura foram os mesmos que os anteriores. As células foram coletadas 1, 3 e 10 dias após a inoculação, e PCR quantitativo em tempo real foi usado para detectar os níveis de mRNA de genes relacionados à diferenciação osteogênica (incluindo BMP , COL-I, ALP e OCN ) Os níveis de expressão dos genes alvo foram normalizados para aqueles do gene housekeeping GAPDH . Os conjuntos de primer estão listados na Tabela 2.

Animais e cirurgia

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais do Hospital Popular da Província de Guizhou. Dezesseis coelhos adultos, machos e fêmeas, pesando 3,6 kg (3,2–3,9 kg) foram adquiridos no Experimental Animal Center da Soochow University e foram divididos em um grupo experimental e um grupo de controle (8 coelhos cada). A anestesia intravenosa foi realizada com pentobarbital sódico a 3% (0,1 mL por quilograma de peso corporal). Após o preparo da pele, esta foi fixada e desinfetada rotineiramente. Uma incisão longitudinal foi feita no côndilo femoral lateral para expor o côndilo lateral. Com a ajuda de uma broca elétrica cirúrgica, foi feito um orifício com diâmetro de 2,7 mm e profundidade de 6 mm em superfície plana. Dois conjuntos de hastes de titânio foram implantados no defeito ósseo (o esquerdo no grupo experimental e o direito no grupo controle) e a penicilina foi administrada por 3 dias consecutivos após a operação para prevenir infecção.

Ensaio Micro-CT

Após a operação, os coelhos foram mantidos em gaiolas separadas e ficaram livres para comer e beber água. Às 4 e 8 semanas de pós-operatório, 8 coelhos foram sacrificados por embolização aérea. Os côndilos femorais dos coelhos contendo hastes de titânio do grupo experimental e do grupo controle foram removidos, o tamanho da amostra foi aparado, as amostras foram fixadas com formalina e a micro-TC foi usada para reconstrução tridimensional. A região de interesse (ROI) foi definida usando o software Micro-CT, e a fração de volume ósseo da região de interesse (volume ósseo / volume total, VB / VC%) foi medida.

Avaliação histológica por coloração com azul de toluidina e fucsina-azul de metileno

As amostras foram desidratadas com álcool gradiente (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 100%). As amostras desidratadas foram incluídas em metacrilato de metila. Após a incorporação bem-sucedida, as amostras foram cortadas e aparadas, fixadas em um fatiador com adesivo para corte e, finalmente, polido com lixa para uma espessura de corte de aproximadamente 20-30 μm. (1) Coloração com azul de toluidina:o corante azul de toluidina foi adicionado à superfície da fatia e a fatia foi tingida em banho-maria. O corante de superfície foi seco com papel de filtro, enxaguado e seco naturalmente ao ar. O filme foi selado e observado ao microscópio óptico. (2) Coloração com fucsina-azul de metileno:o método foi o mesmo da coloração com azul de toluidina. Primeiro, a solução de coloração com azul de metileno foi adicionada à superfície das fatias para tingimento, secas ao ar e enxaguadas. Em seguida, as fatias foram embebidas em solução de coloração de fucsina para tingimento, secas naturalmente ao ar, seladas e observadas.

Análise estatística

Os dados são expressos como médias ± desvio padrão determinados pelo software SPSS 16.0. ANOVA unilateral e o teste SNK foram usados ​​para comparar as diferenças entre os grupos. P <0,05 indica uma diferença significativa.

Resultados

Morfologia da superfície, fase e composição do elemento químico da amostra

A Figura 1 mostra as morfologias da superfície SEM de diferentes amostras. As morfologias do grupo Ti e de outros grupos são significativamente diferentes. O grupo Ti não tem orifícios na superfície e a superfície é relativamente plana, deixando apenas alguns arranhões. O grupo TCP tem uma morfologia de superfície de oxidação de microarco típica, e a superfície é coberta com microporos de tamanhos diferentes. Esses microporos se cruzam e têm uma "estrutura tridimensional" aproximada. Poros grandes e pequenos estão aninhados uns com os outros, e os poros não têm regras fixas. A forma é irregular. Além disso, existem marcas de queimadura nas lacunas entre os orifícios. Semelhante à morfologia da superfície do grupo TCP, as superfícies dos grupos TCP Cu I e TCP Cu II também são cobertas por microporos de formato irregular, e não há diferença óbvia na morfologia da superfície entre os grupos. A dopagem do cobre não afeta a estrutura e morfologia dos microporos.

Morfologias de superfície de Ti, TCP, CP Cu I e TCP Cu II

A Figura 2 mostra o mapeamento e o diagrama EDS do Cu – TiO microporoso ₂ revestimento Como visto no diagrama EDS, o microporoso Cu – TiO ₂ O revestimento é composto de Cu, Ti, Ca, P e O. A solução contendo Cu, Ca e P foi totalmente incorporada ao revestimento. Mais importante, não encontramos outros elementos tóxicos e prejudiciais. Os resultados do mapeamento do Cu – TiO microporoso ₂ revestimento mostra que cobre, cálcio e fósforo são uniformemente distribuídos no revestimento.

Diagrama de mapeamento e EDS do Cu – TiO ₂ revestimento (TCP Cu II)

A Figura 3 mostra os padrões de XRD de Ti, TCP, TCP Cu I e TCP Cu II. Todos os revestimentos são principalmente Ti, rutilo e anatásio. Mais importante ainda, o CuO apareceu no microporoso Cu – TiO ₂ revestimento, que indicava que o cobre existia na forma de CuO.

Padrões de XRD de Ti, TCP, TCP CuI e TCP CuII

A Figura 4 é a imagem XPS do microporoso Cu – TiO ₂ Revestimento. A Figura 3a mostra o espectro completo do microporoso Cu – TiO ₂ revestimento determinado por espectroscopia de fotoelétrons de raios-X, que é semelhante ao resultado de EDS, exceto para titânio, oxigênio, cálcio e fósforo. Além dos picos característicos do cobre, há também picos característicos do cobre. O pico no Ti2 p espectro corresponde a TiO ₂ , e o pico de Cu2 p em 932,7 eV é considerado indicativo de CuO [17, 18].

Imagem XPS do microporoso Cu-TiO ₂ Revestimento. a Espectro XPS, b Ti2 p , c Cu2 p , d Ca2 p , e P2 p e f O1 s espectro

A Figura 5 mostra a morfologia do perfilômetro de diferentes amostras. Exceto para as amostras de Ti, a morfologia da superfície do perfilômetro de cada grupo é semelhante, o que mostra uma estrutura de cavidade de poros de múltiplos estágios semelhante a vulcânica. Uma análise mais aprofundada da rugosidade Ra de cada grupo mostrou que a rugosidade do TCP, TCP CuI e TCP CuII era maior do que a do Ti. A rugosidade do TCP, TCP CuI e TCP CuII é semelhante, e a diferença não é significativa, o que indica que a oxidação do microarc aumenta a rugosidade do Ti, mas a dopagem com cobre não afeta a rugosidade das amostras.

Morfologia do perfilômetro de diferentes amostras

Adesão e proliferação celular

A Figura 6a mostra imagens de células aderentes em 1, 2 e 6 h após a coloração com DAPI. A Figura 6b mostra o número de células MC3T3-E1 aderidas às superfícies de diferentes amostras em momentos diferentes. Os números de células aderentes em diferentes grupos de amostras em diferentes pontos de tempo são organizados na seguinte ordem:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. Em comparação com os grupos Ti e TCP, o número de células aderentes nos grupos TCP Cu I e TCP Cu II aumentou significativamente. Portanto, o Cu – TiO microporoso ₂ o revestimento pode promover significativamente a adesão celular.

Adesão e proliferação de células MC3T3-E1 nas superfícies de diferentes amostras. a Imagens de células aderentes em 1, 2 e 6 h após a coloração com DAPI, b gráfico de barras de células aderentes e c gráfico de barras de proliferação celular (os dados são apresentados como média ± DP, n =5. ** p <0,01 em comparação com o grupo TCP)

A Figura 6c mostra a proliferação de células MC3T3-E1 na superfície de diferentes amostras em momentos diferentes. Semelhante à tendência de adesão das células acima, a proliferação celular dos grupos TCP Cu I e TCP Cu II foi significativamente maior do que a dos grupos Ti e TCP. A morfologia da superfície do Cu – TiO microporoso ₂ revestimento e íons de cobre juntos promoveram a proliferação celular.

A Figura 7 mostra os resultados da coloração EdU. A proporção de núcleos EdU-positivos seguiu esta ordem:TCP CuII> TCP CuI> TCP> Ti. Em comparação com o grupo Ti, a proliferação de células no grupo TCP CuII diferiu significativamente.

Coloração EdU medida após 3 dias de cultura (os dados são apresentados como média ± DP, n =5. ** p <0,01 em comparação com o grupo TCP)

Coloração viva / morta

A citocompatibilidade é o requisito básico dos materiais de implante. A coloração fluorescente viva / morta pode avaliar a citotoxicidade e biocompatibilidade dos materiais. A Figura 8 mostra os resultados da coloração de células vivas / mortas após as células serem cultivadas na superfície de diferentes amostras durante 3 dias. Havia apenas algumas células mortas (vermelhas) na superfície de cada grupo de amostras, indicando nenhuma citotoxicidade óbvia. Dopagem de cobre no microporoso Cu – TiO ₂ o revestimento não aumenta obviamente a citotoxicidade e tem boa compatibilidade celular.

Coloração de células vivas / mortas nas superfícies de diferentes amostras (os dados são apresentados como média ± DP, n =5. ** p <0,01 em comparação com o grupo TCP)

Expressão de genes de diferenciação osteogênica

A Figura 9 mostra os níveis de expressão de mRNA de genes de diferenciação osteogênica ( BMP , OCN , ALP e COL-I ) nas células da superfície de cada grupo de amostras em diferentes momentos. Com o tempo, a expressão dos genes de diferenciação osteogênica na superfície de cada grupo de amostras aumentou gradativamente. Ao mesmo tempo, a expressão de cada grupo de genes apresentou a seguinte tendência:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. Em comparação com os grupos Ti e TCP, a expressão de genes de diferenciação relacionados ao osso compostos de TCP Cu I e TCP Cu II foi significativamente aumentada, indicando que o microporoso Cu – TiO ₂ o revestimento pode promover a diferenciação osteogênica.

A expressão de mRNA de BMP , OCN , ALP e COL-I após 1, 3 e 10 dias de incubação (os dados são apresentados como média ± DP, n =5. * p <0,05 em comparação com TCP de grupo, ** p <0,01 em comparação com o grupo TCP)

Observação Bruta e Análise Micro-CT

A Figura 10 mostra os resultados da observação macroscópica e da reconstrução por micro-TC do côndilo femoral. A observação macroscópica mostrou que os implantes nos dois grupos estavam no meio do côndilo femoral em 4 e 8 semanas com bom posicionamento, sem infecção óbvia e sem afrouxamento do implante. A reconstrução tridimensional da micro-TC mostra que, ao longo do tempo, o novo tecido ósseo na superfície dos dois grupos de amostras em 8 semanas foi maior do que em 4 semanas e, em diferentes pontos de tempo, novo tecido ósseo foi formado na superfície do Cu – TiO microporoso ₂ -implante revestido de titânio, e a quantidade era maior que a do grupo controle. Ao comparar a fração de volume ósseo dos dois grupos, a fração de volume ósseo (BV / TV) de Cu – TiO microporoso ₂ O titânio revestido foi significativamente maior do que o do grupo de controle em branco. Cu – TiO microporoso ₂ O titânio revestido pode promover a osseointegração de implantes de titânio.

Observação macroscópica e reconstrução por micro-TC do côndilo femoral foram observadas 4 e 8 semanas após a implantação

Avaliação Histológica

A Figura 11 mostra os resultados da coloração com azul de toluidina e fucsina-azul de metileno. Nenhum envelope de fibra foi visto na interface osso-implante, indicando que o implante de titânio não apresentou reação inflamatória na interface com o osso. Lacunas brancas podem ser vistas nas lacunas da interface osso-implante de titânio nos dois grupos. A largura das lacunas brancas no grupo de controle era maior do que a do Cu – TiO microporoso ₂ titânio revestido. Quanto maior a lacuna, mais fraca é a indução de novo tecido ósseo pelos implantes. A coloração com azul de toluidina mostra a faixa azul na lacuna da interface implante-osso, que é o novo osso. Cu – TiO microporoso ₂ o titânio revestido tinha mais tecido ósseo do que o grupo de controle, indicando que o Cu – TiO microporoso ₂ o revestimento pode promover melhor a osteogênese e tem um melhor efeito de osseointegração. A matriz óssea em torno do Cu – TiO microporoso ₂ o titânio revestido era mais espesso e contínuo, e o tecido ósseo estava significativamente aumentado. Em contraste, o grupo de controle tinha menos osso. Este resultado mostra que Cu – TiO microporoso ₂ O titânio revestido pode promover melhor a osteogênese e tem um melhor efeito de osseointegração.

Coloração com azul de toluidina e fucsina-azul de metileno da formação de osso novo em 4 e 8 semanas após a implantação

Discussão

O titânio metálico e suas ligas são amplamente utilizados na odontologia, cirurgia plástica e outros campos devido às suas excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade; no entanto, o titânio como um implante só pode se combinar passivamente com o tecido ósseo. Essa combinação geralmente é uma combinação mecânica, que está sujeita a afrouxamento e afundamento do implante, levando à falha do implante. Atualmente, o método de modificação da superfície do implante é usado principalmente para melhorar sua capacidade de osseointegração [19]. A superfície do implante ideal deve ter osteocondutividade e osteoindutividade, boa biocompatibilidade e promover a formação de osseointegração entre o implante e o tecido ósseo [20]. Neste estudo, preparamos um inovador Cu – TiO microporoso ₂ revestimento na superfície de titânio, na esperança de melhorar a atividade biológica e biocompatibilidade do titânio e superar as deficiências dos implantes de titânio nas aplicações clínicas atuais.

Foi demonstrado que o íon cobre e o dióxido de titânio têm boa atividade biológica [21]. Neste estudo, o microporoso Cu – TiO ₂ revestimentos preparados por oxidação de microarc na superfície de titânio apresentaram a maior vantagem de ligação firme entre o revestimento e o substrato de titânio, o que foi confirmado na literatura [22]. A boa força de ligação do revestimento de oxidação do microarc está intimamente relacionada ao processo de formação. No processo de oxidação de microarc, oxidação química, oxidação eletroquímica e oxidação de plasma coexistem. Sob a ação da alta temperatura instantânea e da alta pressão gerada pela descarga do arco, a superfície do titânio cresce na superfície do substrato de forma “crescimento”, principalmente o óxido do substrato. O revestimento cerâmico, o revestimento e o substrato dos dentes caninos são escalonados e possuem uma boa força de adesão [23].

As características da superfície dos materiais biológicos afetam diretamente as características biológicas dos materiais. O revestimento de oxidação de microarc apresenta uma morfologia de superfície rugosa e porosa ao microscópio eletrônico. A morfologia é composta principalmente por microporos de diferentes tamanhos que se interpenetram. Esses pequenos poros são formados no processo de oxidação do microarc, a superfície do metal é quebrada sob alta tensão e a sinterização instantânea de alta temperatura na zona do microarc oxida diretamente e sinteriza a matriz de titânio em um filme cerâmico com uma estrutura de fase cerâmica cristalina , onde ocorre falha elétrica. Os microporos observados ao microscópio eletrônico são formados. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO₂ coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang et al. [25] prepared a Si–TiO₂ coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO₂ coating was significantly higher than that on a Si-free TiO₂ coating and pure Ti.

The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO₂ coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO₂ coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO₂ nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO₂ NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.

Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO₂ coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO₂ coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.

Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO₂ coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO₂ coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].

In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO₂ coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.

Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].

An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.

Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO₂ coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO₂ coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.

Conclusion

In summary, we prepared a microporous Cu–TiO₂ coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO₂ coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.

Disponibilidade de dados e materiais

Não aplicável.

Abreviações

MAO:

micro-arc oxidation

Cu:

cobre

Zn:

zinco

Cu–TiO₂ coating:

copper–titanium dioxide coating

ROI:

região de interesse

ALP:

fosfatase alcalina

Efeitos da co-adsorção na transferência de carga interfacial em um composto quantum dot @ dye Emissão multicolor da estrutura ultravioleta de nanopiramida quasicristal fotônica baseada em GaN com InxGa1 semipolar − xN / GaN vários poços quânticos