Biocompatibilidade aprimorada em TaO anódico x arranjos de nanotubos
Resumo
Este estudo primeiro investiga a biocompatibilidade do TaO auto-organizado x arranjos de nanotubos com diferentes diâmetros de nanotubos fabricados por anodização eletroquímica. TaO totalmente anodizado x nanotubos foram identificados como uma fase amorfa. A transição na molhabilidade da superfície com TaO x os diâmetros dos nanotubos podem ser explicados com base no modelo de Wenzel em termos de rugosidade geométrica. A avaliação da biocompatibilidade in vitro indica ainda que as células de fibroblastos exibem um comportamento dependente da molhabilidade óbvio no TaO x nanotubos. O TaO de 35 nm de diâmetro x arranjos de nanotubos revelam a maior biocompatibilidade entre todas as amostras. Este aprimoramento pode ser atribuído a pontos focais altamente densos fornecidos por TaO x nanotubos devido à maior hidrofilia de superfície. Este trabalho demonstra que a biocompatibilidade em Ta pode ser melhorada formando TaO x arranjos de nanotubos na superfície com diâmetro de nanotubo apropriado e rugosidade geométrica.
Histórico
O tântalo (Ta) é um metal raro, duro, altamente resistente à corrosão e bioinerte [1,2,3]. A oxidação do material de tântalo, pela formação de uma película de óxido muito fina e impenetrável em sua superfície, contribui para sua biocompatibilidade. A alta flexibilidade e biocompatibilidade do tântalo tornam suas aplicações clínicas, como implantes dentários, implantes ortopédicos e reconstrução óssea [4,5,6]. Recentemente, descobriu-se que o tântalo tem melhor biocompatibilidade do que o titânio, como a formação de matriz extracelular mais abundante, excelente aderência e crescimento celular e uma densidade de células vivas muito maior na superfície [7,8,9]. Por outro lado, vários estudos têm demonstrado que a propriedade físico-química distinta da geometria da superfície nanoestruturada é o principal fator que influencia o comportamento celular [10,11,12]. A superfície ideal do biomaterial deve ser capaz de fornecer o ambiente ideal para o crescimento interno das células. Ruckh et al. demonstraram que os nanotubos de Ta anodizados fornecem um substrato para uma osseointegração aprimorada quando comparados à superfície plana [13]. Um material poroso de tântalo recentemente desenvolvido, mimetizando as propriedades do osso, permite o crescimento do tecido mole e do osso, o que proporciona uma boa fixação biológica [14,15,16,17]. A alta estabilidade e potencial de cura do tântalo poroso ajudam a fundir as lacunas entre as estruturas ósseas durante a cirurgia reconstrutiva. O tântalo poroso, portanto, recuperou muito interesse no campo do biomaterial devido às suas várias vantagens em comparação com outros enxertos, como nenhuma morbidade da área doadora, alta estabilidade, excelentes propriedades osseointegrativas e prevenção de risco potencial de transmissão de doenças infecciosas [18,19,20 , 21]. Uma revisão clínica recente mostrou que os pacientes que receberam copos acetabulares de tântalo poroso tinham um maior grau de fixação do implante em comparação com aqueles com copos de titânio (Ti) revestidos com hidroxiapatita [22,23,24,25].
Recentemente, desenvolvemos TiO 2 auto-organizado nanotubos com diâmetros diferentes, utilizando um método de anodização eletroquímica [26, 27]. Descobrimos que as células de fibroblastos humanos mostram um comportamento específico de diâmetro mais óbvio no CO supercrítico 2 (ScCO 2 ) -tratados nanotubos do que os anodizados [27]. Além disso, fabricamos TiO decorado com Ag 2 nanotubos pelo método de evaporação de feixe de elétrons e encontraram o menor diâmetro (25 nm de diâmetro) nanotubos decorados com Ag exibiram a atividade biológica mais óbvia na promoção da adesão e proliferação de fibroblastos humanos e também células epiteliais nasais humanas [26]. Neste estudo, nós fabricamos TaO x nanotubos com diâmetros diferentes pelo método de anodização eletroquímica similar. O comportamento celular, incluindo adesão e proliferação celular, em resposta ao diâmetro de TaO x nanotubos foram investigados. O objetivo desta pesquisa é estudar a biocompatibilidade de TaO auto-organizado x arranjos de nanotubos com diferentes diâmetros de nanotubos fabricados por anodização eletroquímica.
Métodos
Preparação do TaO x Nanotubos
As folhas de Ta foram adquiridas na ECHO Chemical (espessura de 0,127 mm, pureza de 99,7%, CAS No. 7440-25-7). Antes do processo de anodização, as folhas de Ta foram limpas por ultrassom em acetona, isopropanol, etanol e água. Todos os experimentos de anodização foram realizados a 20 ° C em solução de ácido sulfúrico contendo 4,9% em peso de HF, que foi preparada a partir de produtos químicos de grau reagente e água desionizada. Uma célula eletroquímica de dois eletrodos com Ta como ânodo e Pt como contra-eletrodo foi empregada. As tensões foram ajustadas de 10 a 40 V para resultar em TaO x diâmetros de nanotubos variando de 20 a 90 nm. Irradiação de luz UV de baixa intensidade (cerca de 2 mW / cm 2 ) com lâmpadas fluorescentes em TaO x amostras de nanotubos por 8 h foram feitas antes dos testes de biocompatibilidade.
Caracterização do material
A morfologia da superfície, diâmetro interno e externo, espessura da parede e comprimento de TaO x nanotubos foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Difração de raios-X (XRD) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) equipada com um espectrômetro de dispersão de energia (EDS) foram empregados para examinar a estrutura cristalina do TaO x arranjos de nanotubos. As medições do ângulo de contato foram realizadas para avaliar a molhabilidade da superfície do TaO x amostras de nanotubos pelo método de extensão usando um microscópio horizontal com ocular transferidor. Água e meio de cultura foram usados como líquidos de teste para as medições.
Cultura de fibroblastos humanos
Fibroblastos humanos MRC-5 (BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwan, BCRC No. 60023) foram semeados em placa de cultura de tecidos de 10 cm e cultivados com meio essencial mínimo de Eagle (Gibco) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS ), 2 mM de l-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sódio, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 1,0 mM de piruvato de sódio e em 5% de CO 2 a 37 ° C. As células foram então semeadas no TaO autoclavado x folhas colocadas no fundo da placa de cultura de 12 poços (Falcon) para um estudo mais aprofundado.
Ensaio de adesão celular
As células foram semeadas em cada TaO x folha com densidade de 2,5 × 10 3 células / cm 2 e incubado em 5% de CO 2 a 37 ° C durante 3 dias e enxaguado duas vezes com PBS. As células aderentes no substrato foram fixadas por 1 h em paraformaldeído 4% em temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e permeabilização com 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) em PBS por 15 min em 4 ° C. Após lavagem com PBS, o filamento de actina foi marcado por incubação com rodamina-faloidina (Life Technologies) em temperatura ambiente por 15 min. Em seguida, os núcleos das células foram corados por incubação com diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo FisherScientific) durante 5 min. As células foram analisadas sob um microscópio fluorescente (AX80, Olympus) para examinar a morfologia de adesão celular e o arranjo do citoesqueleto. Para observação de SEM, as células foram fixadas com solução de glutaraldeído a 2,5% (Merck) por 1 h em temperatura ambiente, em seguida, enxaguadas em solução de PBS duas vezes, desidratadas em uma série de etanol (40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 %) e secagem de ponto crítico com secador de ponto crítico (CPD 030, Leica). Um filme fino de platina foi revestido nas amostras antes da observação SEM.
Ensaio de proliferação celular
As células foram semeadas em cada TO x substratos com densidade de 1 × 10 4 células / cm 2 e cultivadas por 1 semana. Após 1 semana, as amostras foram lavadas com PBS duas vezes e a proliferação celular foi estimada usando o kit de reagente WST-1 (Roche, Penzberg, Alemanha). O meio contendo 10% de reagente de proliferação de células WST-1 foi adicionado a cada amostra e incubado em atmosfera umidificada de 5% de CO 2 a 37 ° C durante 2 h. A solução de cada poço foi transferida para uma placa de 96 poços. A absorbância da solução foi medida a 450 nm usando o espectrofotômetro (Spectral Max250).
Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e pelo menos três experimentos independentes foram realizados. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) e analisados por análise de variâncias (ANOVA) usando o software SPSS 12.0 (SPSS Inc.). A p valor de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados e discussão
A Figura 1a-e mostra as imagens SEM da folha plana de Ta e TaO anodizado x arranjos de nanotubos com um diâmetro médio de nanotubos de 20, 35, 65 e 90 nm, respectivamente. TaO totalmente anodizado x os nanotubos exibem uma estrutura nanotubular bem definida e os diâmetros dos nanotubos são quase proporcionais às tensões aplicadas. Entre essas amostras, os nanotubos de 20 nm de diâmetro mostram uma superfície nanotubular relativamente obscura, como mostrado na área ampliada retirada da Fig. 1b. Esta observação pode ser atribuída à força de campo mais fraca sob operação de baixa tensão no processo de anodização. A Figura 2 mostra ainda a sessão cruzada de todos os TaO x nanotubos e seus comprimentos nanotubulares correspondentes. As análises de XRD e TEM foram empregadas para identificar melhor o TaO x cristalinidade de nanotubos. Como mostrado nos espectros de XRD da Fig. 3a, apenas picos relacionados à folha de Ta são observados (Cartão JCPDS nº 04–0788), sugerindo que TaO anodizado x nanotubos são possivelmente fase amorfa. A Figura 3b mostra uma imagem TEM representativa tirada de um TaO x de 90 nm de diâmetro nanotubo descascado da amostra anodizada, revelando uma estrutura nanotubular bem definida. O padrão de difração sem manchas na inserção confirma que o TaO x os nanotubos são não cristalinos.
Imagens SEM mostrando o a Superfície de folha de Ta e TaO auto-organizado x nanotubos com diâmetros de b 20, c 35, d 65, e e 90 nm, respectivamente
Imagens SEM mostrando as seções transversais de TaO x nanotubos com diâmetros de a 20, b 35, c 65 e d 90 nm, respectivamente
a Espectros de XRD de TaO anodizado x nanotubos de diferentes diâmetros e b Imagem TEM obtida de um TaO anodizado x nanotubo com diâmetro de 90 nm. A inserção também mostra o padrão de difração correspondente
O estudo anterior relatou que a fixação celular, propagação e organização do citoesqueleto são significativamente melhores em superfícies hidrofílicas em relação às superfícies hidrofóbicas [28]. Das et al. indicou ainda que um baixo ângulo de contato implica em alta energia de superfície, que também é um fator crucial que contribui para uma melhor fixação da célula [29]. Portanto, é essencial entender a influência do TaO x topografia de nanotubos na molhabilidade da superfície. Conforme mostrado na Fig. 4, todo TaO anodizado x os nanotubos são altamente hidrofílicos, pois seus ângulos de contato são muito menores do que 90 °. Além disso, descobriu-se que seus ângulos de contato diminuem monotonicamente com a diminuição do diâmetro do nanotubo para 35 nm e, em seguida, aumentam inversamente conforme o diâmetro diminui para 20 nm. Também descobrimos que o TaO x as amostras de nanotubos mostram tendência semelhante ao usar água ou meio de cultura como líquidos de teste. Tentamos explicar o comportamento de molhabilidade observado com base na lei de Wenzel, que descreve o pequeno ângulo de contato em materiais hidrofílicos [30]. No modelo de Wenzel, um aumento da rugosidade da superfície no material hidrofílico resultará em um ângulo de contato menor e a água preencherá as ranhuras abaixo da gota. Aqui, usamos o fator de rugosidade, ou seja, a área de superfície física dos nanotubos por unidade de área projetada, para avaliar a rugosidade geométrica de TaO x amostras de nanotubos [31]. Conforme mostrado na Fig. 5, com diâmetro interno D , espessura da parede W e comprimento do nanotubo L , o fator de rugosidade puramente geométrico G pode ser calculado como [4π L { D + W } / {√3 (D + 2 W) 2 }] + 1 . Este cálculo assume que todas as superfícies dos nanotubos são perfeitamente lisas. Os fatores de rugosidade calculados para todas as amostras de nanotubos estão resumidos na tabela da Fig. 5. Exceto a amostra de 20 nm de diâmetro, os nanotubos de menor diâmetro têm a maior rugosidade geométrica e, portanto, são pensados para exibir melhor hidrofilicidade de acordo com o modelo de Wenzel. Esta inferência é consistente com nosso resultado de que o ângulo de contato diminui com a diminuição do diâmetro do nanotubo para 35 nm. Também explica bem que os nanotubos de 20 nm de diâmetro que exibem uma superfície nanotubular relativamente obscura apresentam menor rugosidade geométrica e hidrofilicidade mais pobre do que outros.
a - j Imagens ópticas mostrando gotas de água e meio de cultura no a , f Superfície de folha de Ta e TaO auto-organizado x nanotubos com diâmetros de b , g 20, c , h 35, d, i 65, e e , j 90 nm, respectivamente. Os ângulos de contato são indicados nas imagens
Diagrama esquemático de uma estrutura nanotubular idealizada com diâmetro interno D , espessura da parede W e comprimento do nanotubo L . Os fatores de rugosidade calculados para todas as amostras de nanotubos neste estudo estão resumidos na tabela
O comportamento das células de fibroblastos humanos em resposta à folha plana de Ta e TaO x arranjos de nanotubos foram estudados posteriormente. Para avaliar a fixação de células de fibroblastos no TaO x nanotubos, a actina do citoesqueleto foi corada com rodamina faloidina para expressar fluorescência vermelha e os núcleos corados com DAPI para expressar fluorescência azul. A imunomarcação com actina mostra morfologia de contato material-célula distinguível para a folha plana de Ta e TaO x nanotubos de diâmetros diferentes (ver Fig. 6). É bem conhecido que as células têm que aderir primeiro à superfície do material e depois se espalhar para posterior divisão celular. Uma melhor adesão celular pode causar mais ativação de cascatas de sinalização intracelular através da integrina acoplada ao citoesqueleto de actina [32,33,34]. FE-SEM foi usado para a observação detalhada da adesão celular (ver Fig. 7). Os fibroblastos no diâmetro de 35 nm revelam excelente adesão celular com uma morfologia achatada alongada. Por outro lado, os fibroblastos na folha de Ta e TaO de 90 nm de diâmetro x nanotubos mostram menos células aderidas e falta de propagação celular até certo ponto. A área de cobertura das células nos nanotubos foi posteriormente estimada usando o software ImageJ e observada nessas imagens SEM. Semelhante à tendência dos ângulos de contato, constatou-se que a área de cobertura diminui monotonicamente com a diminuição do diâmetro do nanotubo para 35 nm e, em seguida, aumenta inversamente conforme o diâmetro diminui para 20 nm. O TaO de 35 nm de diâmetro x nanotubo de fato mostra a maior área de cobertura celular. Sabe-se que as células reconhecem características de superfície quando um local adequado para adesão foi detectado. Supõe-se que as células podem estabilizar seus contatos no TaO x nanotubos formando aderências focais e fibras de actina maduras, seguido pelo recrutamento de microtúbulos de tubulina [35]. O citoesqueleto de actina está ligado às integrinas que estão localizadas dentro das aderências. Nossas descobertas sugerem que o citoesqueleto nos nanotubos de diâmetro de 35 nm poderia ser formado melhor do que aqueles na folha plana de Ta ou outro TaO x arranjos de nanotubos.
Imagens de microscopia de fluorescência da fixação de células de fibroblastos no a Folha de Ta e TaO auto-organizado x nanotubos com diâmetros de b 20, c 35, d 65, e e 90 nm, respectivamente. A fluorescência vermelha indica filamento de actina da proteína do citoesqueleto, e a fluorescência azul indica núcleos
a - e Imagens SEM mostrando a adesão celular e proliferação de células de fibroblastos humanos no a Superfície de folha de Ta e TaO auto-organizado x nanotubos com diâmetros de b 20, c 35, d 65, e e 90 nm, respectivamente. As áreas de cobertura das células nas amostras estimadas pelo software ImageJ são indicadas nas imagens
O ensaio WST-1 foi empregado para avaliar ainda mais a proliferação de células de fibroblastos no TaO x nanotubos com diâmetros diferentes. A Figura 8 mostra a comparação das densidades ópticas medidas a partir dos resultados do ensaio WST-1. Descobrimos que a proliferação celular é maior para TaO de 35 nm de diâmetro x amostra de nanotubo. No entanto, não há diferença significativa entre o grupo Ta e TaO x arranjos de nanotubos. Além disso, a proliferação celular e a molhabilidade da superfície exibem uma tendência quase semelhante com o TaO x diâmetros de nanotubos. Esta observação sugere que não apenas o diâmetro do nanotubo, mas também a molhabilidade da superfície influencia fortemente a adesão celular e o espalhamento seguinte. Em outras palavras, em comparação com os nanotubos de 35 nm de diâmetro, os de 20 nm de diâmetro podem fornecer mais pontos focais para células de fibroblastos, mas sua hidrofilicidade mais pobre elimina alguns contatos focais eficazes e, portanto, impede a adesão celular. Eventualmente, o TaO de 35 nm de diâmetro x nanotubos revelam a maior biocompatibilidade entre todas as amostras.
Densidades ópticas (QD) medidas após a cultura de células de fibroblastos humanos na folha de Ta e TaO auto-organizado x nanotubos de diferentes diâmetros. Os valores de OD com seus desvios padrão são listados como uma tabela anexa
Conclusões
Em conclusão, este trabalho estuda a biocompatibilidade do TaO anodizado x nanotubos com diferentes diâmetros de nanotubos. Todo TaO anodizado x nanotubos foram identificados como sendo principalmente de fase amorfa. Discutimos a transição na molhabilidade da superfície com TaO x diâmetros de nanotubos com base no modelo de Wenzel. A avaliação da biocompatibilidade in vitro indica ainda que as células de fibroblastos exibem um comportamento dependente da molhabilidade óbvio no TaO x arranjos de nanotubos. O TaO de 35 nm de diâmetro x arranjos de nanotubos revelam a melhor biocompatibilidade entre todas as amostras de nanotubos. Este aprimoramento pode ser atribuído a pontos focais altamente densos fornecidos por TaO x nanotubos devido à maior hidrofilia de superfície. Este estudo demonstra que a biocompatibilidade em Ta pode ser melhorada formando TaO x arranjos de nanotubos com diâmetro de nanotubo apropriado e rugosidade geométrica.
Filme WS2 de área grande com grandes domínios únicos cultivados por deposição de vapor químico
Efeito do eletrodo ITO pulverizado em ângulo oblíquo nas estruturas de células solares de MAPbI3 perovskita
Nanomateriais