Biocompatibilidade de Materiais Dentários Graduados Nano-vidro/Zircônia Após Envelhecimento

Resumo

Um sistema graduado nano-vidro/zircônia (G/Z) foi criado pela infiltração de nano-vidro em superfície de nano-zircônia, aumentando a resistência de união núcleo-revestimento. O envelhecimento é preocupação crítica para policristais de zircônia tetragonal estabilizada com ítrio (Y-TZP), sendo essencial avaliar como o envelhecimento afeta a biocompatibilidade de sistemas G/Z antes do uso clínico. Fibroblastos gengivais humanos (HGFs) foram semeados em espécimes G/Z e Y-TZP não envelhecidos e envelhecidos por 2–72 h. Testes incluíram irritação de mucosa oral, viabilidade celular, adesão e estresse oxidativo. Atividade metabólica diminuiu significativamente em G/Z e Y-TZP envelhecidos a 72 h (P < 0,00001). Nenhuma diferença significativa de viabilidade foi observada entre G/Z e Y-TZP em todos os pontos temporais, antes ou após envelhecimento. Produção de ROS aumentou a 72 h para ambos materiais envelhecidos, mas diferenças não foram significativas (P > 0,05). Taxas de adesão subiram após envelhecimento para ambos materiais, mas G/Z e Y-TZP mostraram adesão comparável (P > 0,05). Escores de irritação macroscópica e microscópica para G/Z envelhecido e não envelhecido foram 0, indicando ausência de irritação.

Conclusão: O sistema G/Z demonstra excelente biocompatibilidade e promessa para aplicações clínicas futuras.

Introdução

Cerâmicas dentárias de zircônia, particularmente policristais de zircônia tetragonal estabilizada com 3 mol% de ítrio (3Y-TZP), são valorizadas por sua alta resistência e tenacidade à fratura devido a mecanismos de endurecimento por transformação, sendo comuns em dispositivos protéticos. No entanto, porcelana de revestimento aplicada a núcleos de zircônia frequentemente falha por lascamento ou descolamento, principalmente devido a coeficientes de expansão térmica e módulos elásticos incompatíveis entre núcleo e revestimento. Para resolver isso, introduzimos anteriormente um sistema graduado nano-vidro/zircônia (G/Z) que infiltra nano-vidro de baixo módulo em superfície de nano-zircônia sinterizada, alcançando resistências de união três vezes maiores que sistemas convencionais.

O envelhecimento de Y-TZP — desencadeado por umidade, carga mecânica e baixa temperatura — induz rugosidade superficial, microfissuras e transformação de fase tetragonal-monoclínica (t-m), podendo comprometer propriedades mecânicas. Como química de superfície e rugosidade influenciam biocompatibilidade, é crucial avaliar como o envelhecimento afeta a interação do sistema G/Z com tecidos biológicos.

Trabalhos prévios de Zhang et al. demonstraram vantagens mecânicas de compósitos zircônia-vidro infiltrado, mas a biocompatibilidade desse compósito graduado, especialmente pós-envelhecimento, permanecia desconhecida. Este estudo preenche essa lacuna comparando G/Z ao Y-TZP clinicamente aceito, avaliando viabilidade celular, morfologia, adesão, estresse oxidativo e irritação mucosa antes e após envelhecimento.

Métodos

Preparação dos Espécimes

Espécimes de Y-TZP, aprovados para uso clínico, serviram como controle. Todas as amostras eram placas uniformes (1,5 × 1,5 × 0,2 cm) seguindo normas ISO 13356 para barras de flexão com superfícies polidas.

Preparação de Espécimes G/Z

Pós de vidro foram moídos a tamanho nanométrico usando moinho Emax. A composição do vidro infiltrante é detalhada na Tabela 1. Pós de zircônia-ítrio (5,18% em peso Y₂O₃, grau TZ-3Y-E, Tosoh) foram prensados uniassialmente a 150 MPa por 2 min, parcialmente sinterizados a 1350 °C por 2 h, e moídos a 200 mesh. Espécimes substrato foram pré-sinterizados a 1200 °C por 2 h para formar rede porosa. Pastas de vidro fundido foram aplicadas na superfície superior e infiltradas a 1350 °C por 2 h, alcançando simultaneamente infiltração e densificação.

Preparação de Espécimes Y-TZP

Blocos de Y-TZP foram fresados e sinterizados a densidade total usando sistema CAD/CAM (Zenostar, Weiland Dental).

Cultura Celular

HGFs foram cultivadas em DMEM/F-12 suplementado com 10% soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina e 1% aminoácidos não essenciais a 37 °C, 5% CO₂. Meio renovado a cada 3 dias. Células destacadas com PBS e tripsina-EDTA, semeadas em cada substrato a 1 × 10⁵ células/mL para todos os ensaios.

Envelhecimento

Envelhecimento mecânico simulou condições de mastigação: espécimes em saliva artificial a 37 °C, submetidos a carga de flexão de três pontos de 80 N a 2 Hz por 10⁵ ciclos, seguindo protocolos estabelecidos.

Viabilidade Celular

Viabilidade avaliada a 2, 24, 48 e 72 h pelo ensaio alamarBlue® (10% em DMEM). Após incubação, 500 µL de corante adicionado, incubado por 4 h, fluorescência medida (excitação 530 nm, emissão 580 nm) em espectrofotômetro Synergy™ H4 (BioTek). Experimentos em triplicata em três rodadas. Viabilidade (%) = (absorbância poços tratados) / (absorbância poços controle).

Estresse Oxidativo

Níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) quantificados por quimioluminescência usando Kit de Ensaio ROS (Instituto de Bioengenharia Nanjing Jiancheng).

Adesão Celular

HGFs cultivadas por 2 h em superfícies dos espécimes pré e pós-envelhecimento. Após fixação, núcleos corados com DAPI (Yeasen), imagens capturadas com microscópio de fluorescência invertido Carl Zeiss LSM 510. Taxas de adesão calculadas como células aderidas / total semeadas em cinco campos aleatórios 450 µm × 450 µm a ×200.

Morfologia Celular

Após 2 h incubação, células em superfícies G/Z fixadas e coradas para F-actina com faloidina rodamina (1:100 em 3% BSA). Imagens com Zeiss LSM 510. Morfologia também examinada por MEV (Philips XL-30 ESEM). Amostras montadas em lamínulas e contra-coradas com DAPI.

Teste de Irritação de Mucosa Oral

Dez camundongos Wistar machos receberam G/Z envelhecido em uma bolsa jugal e G/Z não envelhecido no lado contralateral, seguindo normas YY/T 0127.13-2009. Após 2 semanas, bolsas inspecionadas macroscopicamente, e mucosa bucal examinada histologicamente via coloração H&E. Índices de irritação calculados subtraindo escores de controle dos de teste.

Análises Estatísticas

ANOVA unidirecional (SPSS 22.0) avaliou dados agrupados para viabilidade, estresse oxidativo e adesão. Significância em P < 0,05.

Resultados

Estrutura da Camada Graduada

Espessura média da camada graduada: 0,9–1,0 mm. Imagens MEV (Fig. 1a,b) revelam superfície composta por vidro residual, grãos de zircônia revestidos de vidro e vazios intergranulares — características que facilitam forte adesão núcleo-revestimento. Mapeamento EDS (Fig. 1c) mostra gradiente: concentração de Zr aumenta em profundidade, enquanto Si, Al e La diminuem, confirmando gradiente composicional intencional.

Viabilidade Celular

Atividade metabólica diminuiu significativamente em G/Z e Y-TZP envelhecidos a 72 h (P < 0,00001) (Fig. 2a). Nenhuma queda significativa observada a 2, 24 ou 48 h para nenhum material. Viabilidade de G/Z e Y-TZP não diferiu em nenhum ponto temporal, pré ou pós-envelhecimento (P > 0,05). Dados resumidos na Figura 2a.

Estresse Oxidativo

G/Z e Y-TZP envelhecidos mostraram aumento significativo de ROS a 72 h (P < 0,00001). Nenhuma diferença significativa em pontos anteriores (P > 0,05). G/Z e Y-TZP produziram níveis de ROS comparáveis durante todo o estudo, antes e após envelhecimento (P > 0,05).

Adesão Celular

Taxas de adesão aumentaram para ambos G/Z e Y-TZP após envelhecimento (Fig. 2c). Nenhuma diferença significativa entre os dois materiais pré ou pós-envelhecimento (P > 0,05). Imagens representativas de adesão em Y-TZP e G/Z antes e após envelhecimento na Figura 3.

Morfologia Celular

Imagem por fluorescência revelou células aderidas a G/Z envelhecido e não envelhecido, com espalhamento e achatamento aprimorados em superfícies envelhecidas (Fig. 4a-c). MEV confirmou células bem espalhadas, poligonais, com microvilos extensos em ambas superfícies (Fig. 5a,b).

Teste de Irritação de Mucosa Oral

Escores de irritação macroscópica e microscópica foram 0 para G/Z envelhecido e não envelhecido, indicando ausência de irritação. Histopatologia confirmou ausência de alterações mucosais (Fig. 6a,b).

Discussão

Ligas metalocerâmicas têm cedido lugar a alternativas livres de metal devido a preocupações com liberação de íons metálicos. Enquanto muita pesquisa foca em melhorias cerâmicas, o sistema G/Z oferece rota promissora para melhorar desempenho da zircônia sem adicionar componentes metálicos. Este estudo demonstra que G/Z mantém biocompatibilidade comparável a Y-TZP, mesmo após envelhecimento, que simula condições orais realistas.

Envelhecimento diminuiu proliferação celular a 72 h para ambos materiais, alinhando-se a literatura que relata biocompatibilidade reduzida pós-envelhecimento e contrastando com outras que notam melhora. Variações provavelmente decorrem de protocolos de envelhecimento diferentes. Nosso protocolo — carga 80 N, 2 Hz, 10⁵ ciclos em saliva artificial a 37 °C — espelha forças de mordida e temperatura clínicas, fornecendo avaliação realista dos efeitos do envelhecimento.

O declínio observado na viabilidade e aumento de ROS podem refletir difusão iônica e tensão local da transformação t-m, que podem comprometer integridade celular. Interessantemente, envelhecimento aumentou adesão para ambos G/Z e Y-TZP sem alterar taxas relativas. Superfícies rugosas e hidrofílicas pós-envelhecimento provavelmente aumentam adsorção de proteínas, favorecendo melhor fixação celular. A adesão comparável sugere que propriedades superficiais do G/Z permanecem favoráveis após envelhecimento.

Teste de irritação in vivo revelou nenhuma alteração histopatológica, apoiando segurança do G/Z para contato mucosal. A modesta quantidade de fase monoclínica introduzida durante infiltração provavelmente preserva integridade mecânica mantendo biocompatibilidade, como mostrado em trabalho prévio sobre Y-TZP infiltrado com Al₂O₃.

Outros compósitos vidro-zircônia mostraram boa biocompatibilidade e bioatividade in vitro e in vivo. Nossos achados estendem essa evidência ao sistema graduado nano-vidro/zircônia, oferecendo material que equilibra resistência mecânica, estética e segurança biológica.

Conclusões

Avaliações de biocompatibilidade — incluindo viabilidade celular, adesão, morfologia, estresse oxidativo e irritação mucosa — demonstram que G/Z performa em par com Y-TZP antes e após envelhecimento. Esses resultados posicionam G/Z como candidato promissor para próteses dentárias. Estudos abrangentes in vitro e in vivo adicionais são necessários para confirmar achados preliminares.

Abreviações

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-fenilindol diidrocloreto

F-actina:

Actina filamentosa

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

Nano-vidro/zircônia graduado

MEV:

Microscopia eletrônica de varredura

t-m:

Tetragonal para monoclínico

Y-TZP:

Policristal de zircônia tetragonal estabilizada com ítrio