Deposição MAPLE Assistida por Laser de Nanopartículas de Conversão para Cima Funcionalizadas com Anticorpos Melhora Desempenho em Cultura Celular

Resumo

Um substrato de cultura celular de alto desempenho depende de uma superfície ideal que suporte a função e comunicação celular. Trabalhos recentes demonstram que revestimentos nanoestruturados podem melhorar a adesão celular, ainda métodos convencionais baseados em solução frequentemente introduzem contaminantes. Evaporação pulsada a laser assistida por matriz (MAPLE) oferece uma rota limpa e não destrutiva para depositar biopolímeros em uma variedade de substratos. Neste estudo, sintetizamos nanopartículas de conversão para cima (UCNPs) de NaGdF4:Yb³⁺,Er³⁺ e suas contrapartes funcionalizadas com imunoglobulina-G (IgG) via método de um pote. As UCNPs exibem diâmetro médio de 50 ± 8 nm, e imagens de TEM confirmam a presença de IgG em suas superfícies. Usando laser Nd:YAG de 532 nm (10 Hz), depositamos UCNPs — com e sem IgG — em pratos de cultura com fundo de vidro por MAPLE. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) foram então semeadas nestes substratos e comparadas com controles de vidro revestidos com gelatina. Ensaios de viabilidade celular revelaram nenhuma citotoxicidade, enquanto análise morfológica mostrou adesão e proliferação melhoradas em ambas as superfícies revestidas com UCNPs. Estes achados demonstram que UCNPs depositados por MAPLE e funcionalizados com anticorpos podem servir como revestimentos biocompatíveis de alto desempenho para aplicações de cultura celular.

Introdução

Células epiteliais revestem as superfícies internas e externas do corpo humano, desempenhando um duplo papel como barreira física e participante ativo em processos fisiológicos como função de barreira, sinalização e defesa imune. Na engenharia de tecidos, a interação entre células e superfícies de substrato é um determinante crítico de adesão celular, morfologia e função. Revestimentos proteicos tradicionais — colágeno, gelatina, fibronectina — têm sido empregados há muito tempo para melhorar a fixação celular em superfícies de vidro ou plástico. Avanços recentes mostram que revestimentos nanoestruturados podem modular o comportamento celular fornecendo pistas topográficas e aumentando a área superficial efetiva, melhorando assim adesão e proliferação.

Nanopartículas de conversão para cima (UCNPs) dopadas com íons lantânides, como NaGdF4:Yb³⁺,Er³⁺, exibem excitação eficiente no infravermelho próximo (NIR) e emissão visível ou NIR, oferecendo vantagens para imagem de tecido profundo e biossensoriamento devido a baixa fototoxicidade e alta fotostabilidade. Funcionalização de superfície de UCNPs com biomoléculas — avidina, DNA, anticorpos — permitiu imagem direcionada, sensoriamento e marcação celular. No entanto, trabalho limitado explorou UCNPs funcionalizados com anticorpos como revestimentos de superfície para cultura celular.

Técnicas convencionais de deposição (sol-gel, spin coating, dip coating) sofrem de espessura não controlada, resíduo de solvente e potencial desnaturação de biomoléculas. Evaporação pulsada a laser assistida por matriz (MAPLE) contorna esses problemas aprisionando o material alvo em uma matriz de solvente congelado; a energia do laser é absorvida pela matriz, levando à transferência suave do material para o substrato sem ablação direta da biomolécula. MAPLE tem sido aplicada em liberação de fármacos, eletrônica orgânica e revestimentos biomédicos, ainda seu impacto em substratos de cultura celular permanece pouco explorado.

Neste trabalho, relatamos a síntese de UCNPs de NaGdF4:Yb³⁺,Er³⁺ e seus análogos funcionalizados com IgG, seguidos de deposição MAPLE em pratos de cultura com fundo de vidro. Avaliamos então a biocompatibilidade e influência no comportamento de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), fornecendo base para futuras aplicações em engenharia de tecidos.

Métodos/Experimental

Materiais

Todos os reagentes eram grau analítico: Gd(NO₃)₃·6H₂O (99,9%), Yb(NO₃)₃·5H₂O (99,9%), Er(NO₃)₃·5H₂O (99,9%), NaF (≥ 99%), polietilenimina ramificada (PEI, Mw ≈ 800), anti-IgG humano (Fab-específico, marcado com FITC), DAPI, Phalloidin-TRITC e solventes (glicol etileno, isopropanol). Os materiais foram comprados da Sigma-Aldrich, Fisher Scientific e Caledon.

Síntese de UCNPs Com e Sem IgG por Processo de Um Pote

UCNPs (NaGdF4:Yb³⁺,Er³⁺) foram sintetizados via rota hidrotérmica modificada. Em resumo, 720 mg Gd(NO₃)₃·6H₂O, 170 mg Er(NO₃)₃·5H₂O, 160 mg Yb(NO₃)₃·5H₂O e 20 mL glicol etileno foram misturados em um balão de três gargalos. 0,7 g PEI foi adicionado, seguido por adição gota a gota de 336 mg NaF dissolvido em 10 mL glicol etileno. A mistura foi aquecida a 200 °C sob nitrogênio e refluxada por 6 h. O produto foi coletado por centrifugação, lavado com etanol e água, e seco a 60 °C.

Para funcionalização com IgG, 15 mg de pó UCNP foi disperso em 15 mL água destilada, então 5 mL tampão borato-salino (pH 8) e 20 µg IgG foram adicionados. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 h, então lavada e pelletizada por centrifugação. O conjugado, UCNPs-IgG, foi armazenado em tampão aquoso.

Deposição de UCNPs Com/Sem IgG por MAPLE

Deposição MAPLE foi realizada usando sistema MAPLE 2000 (PVD Products, Inc.) com laser Nd:YAG de 532 nm. A solução de nanopartículas (1% em peso em isopropanol) foi congelada em um suporte de alvo resfriado a nitrogênio líquido. Parâmetros do laser: 10 Hz, largura de pulso 200 µs, fluência 150 mJ cm⁻², área do spot 0,63 cm². Substratos de vidro, pré-revestidos com 2% em peso de gelatina, foram posicionados a 4,5 cm do alvo e mantidos a 25 °C sob 1 × 10⁻⁶ Torr. Os suportes de alvo e substrato rotacionaram a 10 rpm e 25 rpm, respectivamente, durante deposição de 2 h. Os filmes resultantes foram caracterizados por EDX, FTIR e espectroscopia de fotoluminescência (PL).

Caracterização dos Materiais

UCNPs e UCNPs-IgG pré-deposição foram examinados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Philips CM-10, 80 kV). Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram registrados em um Bruker Vector 22 (600–4500 cm⁻¹, resolução 4 cm⁻¹, 64 varreduras). Espectros PL foram medidos com espectrofluorômetro QuantaMaster 40 (Horiba). Filmes pós-deposição foram inspecionados por EDX (Hitachi S-3400 N com INCA PentaFET-x3) e microscopia confocal (Zeiss LSM 5 Duo). Citocompatibilidade foi avaliada via ensaio MTT em HUVECs cultivados por 24 h.

Estudo do Comportamento Celular

HUVECs (ATCC) foram semeadas a ~1 × 10⁵ células por prato em substratos de vidro (controle gelatina, UCNPs, UCNPs-IgG). Após 24 h de incubação a 37 °C, as células foram fixadas com 4% formalina, coradas com Phalloidin-TRITC (actina) e DAPI (núcleos), e imageadas por microscopia confocal. Área celular, comprimento de conexão, comprimento celular e contagem celular foram quantificados usando ImageJ.

Ensaio de Citotoxicidade

MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio brometo) foi adicionado ao meio de cultura após 24 h, incubado por 3 h, e absorbância medida a 490 nm usando leitor Bio-Tek EL340I. Experimentos foram realizados em triplicata.

Resultados e Discussão

Caracterização de UCNPs e UCNPs-IgG Antes da Deposição MAPLE

Imagens de TEM confirmam a morfologia cúbica das UCNPs com diâmetro médio de 50 ± 8 nm. TEM de alta resolução revela espaçamento de rede de 0,312 nm, correspondente ao plano (111) de NaGdF4 cúbico (JCPDS 27-0697). Após conjugação com IgG, o tamanho da partícula aumenta para 54 ± 8 nm, e a camada de anticorpo (~10 ± 5 nm) é visível como um halo periférico (Fig. 3b).

XRD de pó mostra picos característicos a 32°, 37°, 54° e 65° (111, 200, 220, 311), confirmando a fase cúbica (Fig. 4).

Espectros de FTIR revelam picos de amina (1515 cm⁻¹, 1511 cm⁻¹) de PEI e IgG, estiramentos –CH₂–/C-C (2987, 2900, 1400 cm⁻¹) e bandas de carboxila e amida (1249, 1650 cm⁻¹) confirmando a fixação de IgG (Fig. 5).

Caracterização de UCNPs Após Deposição MAPLE

Mapeamento EDX de substratos de vidro revestidos com UCNPs e UCNPs-IgG confirma a presença de Gd, Er, Yb e F (Fig. 6a,b). Medidas de PL mostram emissão verde (540 nm) e vermelha (650 nm) retidas sob excitação de 980 nm, com apenas variações menores de intensidade atribuíveis a defeitos de superfície ou erro de medição.

FTIR das superfícies revestidas confirma ainda a preservação de grupos funcionais: a banda –OH a 3648 cm⁻¹ (IgG) aparece apenas em UCNPs-IgG (Fig. 7a), enquanto a banda de amina a 1575 cm⁻¹ é evidente em UCNPs (Fig. 7b). A ausência dessas bandas em vidro nu (Fig. 7c) ressalta a deposição bem-sucedida das camadas de nanopartículas.

Comportamentos Celulares nos Diferentes Revestimentos

Imagens confocais após 24 h de cultura revelam números celulares comparáveis em todas as superfícies, mas superfícies de UCNPs-IgG exibem maior espalhamento celular, extensões citoplasmáticas mais longas e maior conectividade intercelular (Fig. 8). Análise quantitativa mostra aumentos de 11,2% e 22,2% na área celular para UCNPs e UCNPs-IgG, respectivamente, relativos a controles de gelatina; comprimentos de conexão aumentam 12,5% e 17,5%; comprimentos celulares crescem 8,2% e 17,3%; e contagens celulares aumentam ~8% em superfícies revestidas com nanopartículas (Fig. 9). Estas métricas confirmam que tanto UCNPs quanto UCNPs-IgG melhoram adesão e espalhamento endotelial sem induzir citotoxicidade.

Efeito do Revestimento na Viabilidade Celular

Ensaios MTT demonstram >99% viabilidade relativa em vidro nu, UCNPs e UCNPs-IgG, excedendo o benchmark de >85% para materiais biocompatíveis. O leve aumento na viabilidade (105% para UCNPs, 104% para UCNPs-IgG) sugere um efeito estimulatório suave dos revestimentos de nanopartículas, provavelmente devido a rugosidade superficial aumentada e adsorção de proteínas.

Conclusões

Demonstramos que UCNPs de NaGdF4:Yb³⁺,Er³⁺ e suas contrapartes funcionalizadas com IgG podem ser sintetizadas em um processo hidrotérmico de um pote e depositadas em pratos de cultura de vidro por MAPLE sem comprometer sua integridade estrutural ou fotoluminescente. TEM, FTIR, XRD e EDX confirmam síntese, conjugação e deposição bem-sucedidas. Ensaios de biocompatibilidade revelam nenhuma citotoxicidade, enquanto microscopia confocal mostra adesão, espalhamento e rede intercelular aprimorados de HUVECs em superfícies revestidas com nanopartículas. Estes achados posicionam UCNPs depositados por MAPLE e funcionalizados com anticorpos como revestimentos promissores de baixa contaminação para plataformas avançadas de engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Abreviações

DAPI:

4′,6-Diamidino-2′-fenilindol diidrocloreto

EG:

Glicol etileno

HUVEC:

Células endoteliais de veia umbilical humana

IgG:

Imunoglobulina G

MAPLE:

Evaporação pulsada a laser assistida por matriz

PEI:

Polietilenimina

Phalloidin-TRITC:

Phalloidina-Tetrametilrodamina B isotiocianato

UCNPs:

Nanopartículas de conversão para cima