Nanopartículas de mPEG Carregadas com Icarina: Proteção Aumentada Contra Cardiotoxicidade Induzida por LPS em Células H9c2

Resumo

A icarina (ICA), um glicosídeo flavonol de Epimedium, exibe propriedades cardioprotetoras, antioxidantes e anti-inflamatórias, mas sofre de baixa solubilidade em água, depuração rápida e baixa biodisponibilidade oral. Sintetizamos um conjugado hidrofílico de polietileno glicol monometil éter (mPEG) (mPEG-ICA) via esterificação mediada por anidrido succínico, e subsequentemente encapsulamos ICA livre no polímero por diálise para formar nanopartículas (NPs) de ICA-carregadas mPEG-ICA. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e ressonância magnética nuclear de próton (¹H-NMR) confirmaram conjugação bem-sucedida. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) revelou diâmetro hidrodinâmico médio de 220 ± 13,7 nm com potencial ζ de +2,30 ± 1,33 mV, enquanto microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostrou morfologia esférica uniforme. Em tampão fosfato salino (PBS) a pH 7,4, as nanopartículas liberaram 52,8 ± 1,7% de ICA em 72 h; a pH 6,8, a liberação acelerou para 75,7 ± 0,2% dentro de 48 h. In vitro, as NPs preservaram viabilidade de células H9c2, reduziram vazamento de lactato desidrogenase (LDH) e inibiram apoptose induzida por lipopolissacarídeo (LPS). Além disso, níveis de mRNA das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 foram marcadamente suprimidos. Estes resultados demonstram que NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA oferecem plataforma promissora de nanomedicina para mitigar lesão miocárdica mediada por LPS.

Introdução

Remodelação cardíaca após lesão miocárdica é impulsionada principalmente por sinalização inflamatória sustentada, particularmente através de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-18. Essas citocinas desencadeiam estresse oxidativo, ativação de fibroblastos e apoptose de cardiomiócitos, comprometendo finalmente a função cardíaca. A icarina (C₃₃H₄₀O₁₅) tem sido extensivamente relatada por exercer efeitos imunomoduladores, antioxidantes e anti-apoptóticos em modelos pré-clínicos, ainda seu potencial terapêutico é limitado por hidrofobicidade, depuração sistêmica rápida e absorção oral pobre. Sistemas de nanocarreadores - como micelas, lipossomos e nanopartículas poliméricas - surgiram como estratégias eficazes para aumentar solubilidade de fármacos, estender tempo de circulação e alcançar entrega direcionada a tecido cardíaco inflamado, aproveitando o efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR).

Polietileno glicol monometil éter (mPEG) oferece hidrofilicidade superior, biocompatibilidade e imunogenicidade mínima comparado ao PEG linear. Ao anexar covalentemente ICA a mPEG-COOH através de ligação éster, criamos um anfifílico hidrofílico-hidrofóbico capaz de auto-montagem em nanopartículas. A ligação éster é lábil a ácido, permitindo liberação de ICA responsiva a pH no microambiente levemente ácido (pH ≈ 6,8) característico de miocárdio inflamado. Este estudo detalha a síntese de mPEG-ICA, encapsulamento de ICA em nanopartículas, caracterização físico-química, perfil de liberação in vitro e avaliação de eficácia cardioprotetora contra lesão induzida por LPS em células H9c2.

Materiais e Métodos

Instrumentos Experimentais

Instrumentos analíticos chave incluíram balança eletrônica JA302, evaporador rotativo RE52CS-1, agitador magnético 78HW-1, secador de ar 101-OA, espectrômetro FT-IR NEXUS670, espectrofotômetro UV-Vis, TEM Glacios, dispersor ultrassônico JP-010S, sistema qPCR em tempo real, analisador de fluorescência ligado a enzima, microscópio invertido Olympus, microscópio de fluorescência Leica, e incubadora de CO₂ Thermo.

Reagentes Experimentais

Reagentes de grau analítico foram obtidos de fornecedores comerciais: Icarina (95%, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 g, Sigma, MKBT7172), diclorometano (500 mL, Sinopharm), 4-dimetilaminopiridina (100 g, Aladdin), N-hidroxissuccinimida (100 g, Ruiyong), kit de síntese de cDNA FastKing (Tiangen), kit de apoptose Biyuntian, kit qPCR SYBR Green (QIAGEN), entre outros.

Síntese de mPEG-COOH

mPEG (5 g), anidrido succínico (0,40 g) e DMAP (0,50 g) reagiram em 50 mL diclorometano a 60 °C por 2 h sob refluxo. A mistura foi evaporada, e o sólido branco resultante foi purificado por diálise (MWCO 2 kDa) contra água por 48 h. Produto liofilizado rendeu mPEG-COOH.

Síntese do Polímero mPEG-ICA

mPEG-COOH (0,37 g) foi ativado com NHS (0,024 g) e DMAP (0,026 g) em 10 mL DMSO seco, então reagido com 100 mg ICA (dissolvido em 5 mL DMSO seco) sob nitrogênio à temperatura ambiente por 48 h. Após diálise extensiva contra água e liofilização, polímero mPEG-ICA foi obtido.

Preparação de Nanopartículas (NPs) de ICA-carregadas mPEG-ICA

mPEG-ICA (5 mg) foi dissolvido em 2 mL DMSO e misturado com 5 mg ICA em DMSO, seguido pela adição de 5 mL água destilada. Após 15 min agitação à temperatura ambiente, a mistura foi dialisada (MWCO 3500 Da) por 24 h com trocas frequentes de água, então filtrada para render NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA.

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

Amostras foram misturadas com KBr, prensadas em pelotas, e escaneadas de 4000 a 4400 cm⁻¹ para confirmar transformações de grupos funcionais.

Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Próton

Amostras foram dissolvidas em DMSO-d₆ e analisadas em espectrômetro NMR de 500 MHz para confirmar deslocamentos químicos consistentes com esterificação.

Espectro UV-Vis

Curva de calibração de ICA a 270 nm foi gerada; concentrações de polímero e nanopartículas foram quantificadas usando esta curva.

Caracterização de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA

Detecção por Espalhamento Dinâmico de Luz

Distribuição de tamanho de partícula e potencial ζ foram medidos com Zetasizer 3000hs após liofilização e redispersão em água; cada amostra foi analisada em triplicata.

Observação da Morfologia por TEM

Suspensão de NP 1,0 mg/mL foi aplicada em grades de cobre revestidas de carbono, corada com 2% ácido fosfotungstico, e imageada a 80 kV.

Medição da Estabilidade

NPs foram liofilizadas com 5% manitol, redispersas em água, e tamanho/PDI monitorados para avaliar estabilidade de armazenamento.

Determinação de Carga de Fármaco e Eficiência de Encapsulamento

Carga de fármaco (LC%) e eficiência de encapsulamento (EE%) foram calculados da absorbância UV-Vis usando as fórmulas: EE = massa de fármaco nas NPs / massa total das NPs × 100%; LC = massa de fármaco nas NPs / massa inicial de fármaco × 100%.

Liberação de Fármaco In Vitro

NPs foram colocadas em 25 mL PBS (pH 7,4 ou 6,8) a 37 °C com agitação 100 rpm. Amostras (2 mL) foram retiradas em intervalos definidos, substituídas com meio fresco, e analisadas por UV-Vis a 270 nm. Liberação cumulativa (%) foi calculada usando equação padrão.

Experimento de Teste Celular

Células H9c2 de cardiomioblastos de rato foram cultivadas em DMEM + 10% FBS a 37 °C/5% CO₂. Células foram semeadas em placas de 96 poços (10⁴ células/poço) para viabilidade, LDH, apoptose e ensaios qPCR.

Tratamento Celular com LPS ou Nanopartículas de ICA

Células foram divididas em cinco grupos: (1) controle (sem tratamento), (2) LPS (10 µg/mL) por 24 h, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) polímero mPEG-ICA (20 µM) + LPS, (5) NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA (20 µM) + LPS.

MTT

Após 24 h tratamento, 0,5 mg/mL MTT foi adicionado por 4 h. Formazan foi dissolvido em DMSO e absorbância medida a 570 nm.

Liberação de Lactato Desidrogenase (LDH)

Atividade LDH em sobrenadantes de cultura foi quantificada usando kit comercial; absorbância lida a 490 nm.

Coloração Hoechst 33342

Morfologia nuclear foi examinada após 15 min coloração com Hoechst 33342 (1 µg/mL) e imageada sob microscópio de fluorescência. Índice de apoptose = núcleos apoptóticos/núcleos totais × 100%.

Ensaio TUNEL

Fragmentação de DNA foi detectada usando kit TUNEL; núcleos apoptóticos contados como fluorescência verde relativa a núcleos totais corados com DAPI.

Citometria de Fluxo para Detectar Apoptose

Dupla coloração Annexin V-FITC/PI foi realizada; populações apoptóticas precoces e tardias quantificadas por citometria de fluxo.

Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa de Transcrição Reversa (RT-qPCR)

RNA foi extraído com TRIzol, retrotranscrito, e amplificado em sistema Bio-Rad CFX96 usando SYBR Green. Expressão gênica de TNF-α, IL-1β, IL-6 e actina (housekeeping) foi normalizada à actina. Sequências de primers estão listadas no manuscrito original.

Resultados e Discussão

Espectros FTIR e ¹H NMR

Espectros FT-IR exibiram absorções características de carbonila de éster a 1700 e 1740 cm⁻¹, confirmando conjugação bem-sucedida. ¹H-NMR revelou sinais de hidroxila fenólica a 12,6 ppm, prótons aromáticos a 7,5 ppm, e prótons metileno da cadeia PEG a 3,5 ppm, confirmando presença de ambos os grupamentos ICA e mPEG.

Espectros FTIR de mPEG-ICA (A), ICA (B), e mPEG-COOH (C). Espectros ¹H-NMR para mPEG-COOH e mPEG-ICA.

Tamanho de Partícula, Potencial Zeta e TEM

NPs do polímero núcleo mediram em média 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277), enquanto NPs carregadas com ICA expandiram para 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119). Potenciais zeta mudaram de +0,44 ± 0,26 mV para +2,30 ± 1,33 mV após carregamento, indicando estabilidade coloidal melhorada. Imagens TEM confirmaram morfologia esférica uniforme (Fig. 2).

Tamanho de partícula, potencial zeta e TEM de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA.

Carga de Fármaco e Eficiências de Encapsulamento

Análise UV-Vis rendeu carga de fármaco de 21,9 ± 0,013% e eficiência de encapsulamento de 54,9 ± 0,032% para NPs carregadas com ICA, superando NPs de apenas polímero (carga = 16,5%; EE = 41,3%). Estes valores são consistentes com a carga terapêutica desejada.

Determinação da Estabilidade

Pós liofilização com 5% manitol, NPs redispersas exibiram aumento moderado de tamanho para 255 nm (PDI = 0,326) ainda mantiveram uniformidade aceitável, confirmando estabilidade de armazenamento (Fig. 3).

Estabilidade de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA.

Liberação de Fármaco mPEG-ICA-ICA In Vitro

Em PBS pH 7,4, ICA livre liberou 77,2% dentro de 12 h, enquanto NPs de mPEG-ICA liberaram 44,1% em 72 h. NPs carregadas com ICA liberaram 52,8% em 72 h a pH neutro e 75,7% dentro de 48 h a pH 6,8, refletindo liberação acelerada responsiva a pH (Fig. 4).

A Liberação de ICA de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA em PBS a pH 7,4. B Liberação a pH 7,4 vs pH 6,8.

Viabilidade de Células H9C2 e Liberação de Lactato Desidrogenase

Ensaios MTT revelaram nenhuma citotoxicidade de ICA, mPEG-ICA ou NPs carregadas com ICA a 20 µM. Após exposição a LPS, viabilidade caiu para 50,0% (controle = 100%). Tratamento com ICA, mPEG-ICA e NPs carregadas com ICA restaurou viabilidade para 55,9%, 61,0% e 65,4% respectivamente (p < 0,05) (Fig. 5, 6).

Avaliação da citotoxicidade de nanopartículas de ICA em células H9c2.

Efeito de nanopartículas de ICA na lesão de células H9c2 induzida por LPS.

Ensaios LDH mostraram aumento significativo no vazamento enzimático após tratamento com LPS; ICA, mPEG-ICA e NPs carregadas com ICA reduziram marcadamente a liberação de LDH, com efeito mais pronunciado observado para NPs carregadas com ICA (Fig. 7).

Efeito de nanopartículas de ICA no nível de LDH induzido por LPS em células H9c2.

Apoptose Celular Induzida por LPS

Coloração Hoechst 33342 revelou condensação e fragmentação de cromatina em células tratadas com LPS; NPs carregadas com ICA atenuaram significativamente morfologia apoptótica (Fig. 8). Ensaio TUNEL quantificou taxas de apoptose: LPS induziu 47,6% apoptose, reduzida para 35,5% (ICA), 26,5% (mPEG-ICA) e 17,9% (NPs carregadas com ICA). Citometria de fluxo corroborou estes achados, mostrando apoptose total de 35,9% em LPS versus 16,7% (NPs carregadas com ICA) e 19,2% (mPEG-ICA) (Fig. 9-10).

Detecção de apoptose por coloração Hoechst 33342.

Detecção de apoptose por TUNEL.

Taxa apoptótica detectada por citometria de fluxo.

mRNA de Citocinas Inflamatórias em Células H9c2 Induzidas por LPS

RT-qPCR demonstrou que LPS elevou marcadamente transcritos de TNF-α, IL-1β e IL-6. Tratamento com ICA, mPEG-ICA e NPs carregadas com ICA suprimiram estas citocinas, com NPs carregadas com ICA alcançando a regulação negativa mais substancial (Fig. 11).

Efeitos de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA na expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6.

Estes achados confirmam que NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA fornecem cardioproteção aprimorada entregando ICA diretamente ao miocárdio inflamado, reduzindo estresse oxidativo, apoptose e produção de citocinas inflamatórias.

Conclusão

Fabricamos com sucesso nanopartículas de ICA-carregadas mPEG-ICA via abordagem híbrida químico-física que melhora marcadamente solubilidade de ICA, capacidade de carga e liberação sustentada responsiva a pH. Em células H9c2 desafiadas por LPS, estas NPs restauraram viabilidade celular, atenuaram vazamento de LDH, inibiram apoptose e suprimiram expressão de citocinas pró-inflamatórias mais eficazmente que ICA livre ou polímero sozinho. Os dados suportam o potencial de NPs de ICA-carregadas mPEG-ICA como nanomedicina direcionada para tratar lesão cardíaca inflamatória.