Imagem Hiperspectral Avançada para Detecção Multiplexada de Nanossondas de Infravermelho de Onda Curta em Sistemas Biológicos

Resumo

A bioimagem óptica com luminóforos exógenos que emitem na região espectral do infravermelho de onda curta (SWIR, ~1000–1700 nm) é um campo em rápido desenvolvimento, e o desenvolvimento de múltiplas nanossondas fotoluminescentes no SWIR tem sido relatado recentemente. Nesse contexto, a imagem hiperspectral (HSI), combinada com algoritmos de desmistura, é uma ferramenta promissora que pode permitir a multiplexação eficiente de nanoagentes emissores no SWIR por seus perfis espectrais de fotoluminescência (FL). A técnica de HSI no SWIR relatada aqui foi desenvolvida para multiplexar dois tipos de nanossondas: nanopartículas poliméricas dopadas com corante orgânico (PNPs) e nanopartículas de fluoreto dopadas com terras raras (RENPs). Ambos os tipos de nanossondas exibem FL na mesma faixa espectral (~900–1200 nm), o que dificulta a separação espectral da FL com filtros ópticos e limita as possibilidades de sua imagem multiplexada em tecidos biológicos. Ao aplicar HSI no SWIR, exploramos diferenças nos perfis espectrais de FL e alcançamos a imagem seletiva e sensível do sinal de FL de cada tipo de nanopartícula. A desmistura dos dados adquiridos permitiu a multiplexação das nanossondas com espectros sobrepostos por seu perfil de FL. Obtivemos a distribuição quantitativa e espacial de cada tipo de nanopartícula a partir de suas suspensões mistas. Finalmente, a técnica de HSI no SWIR com protocolo de desmistura foi aplicada à imagem in vivo de camundongos injetados subcutaneamente com PNPs e RENPs. A aplicabilidade das técnicas hiperspectrais para multiplexar nanossondas na imagem in vivo foi demonstrada com sucesso.

Introdução

As tecnologias de imagem biomédica vêm se desenvolvendo rapidamente nas últimas décadas, permitindo a detecção precoce e a avaliação de diversas doenças e patologias. Entre as diferentes modalidades de imagem, a imagem óptica ocupa uma posição única devido à sua alta resolução espacial e temporal e custo relativamente baixo. Múltiplas abordagens de imagem óptica baseadas em fotoluminescência (ou, mais especificamente, fluorescência) estão em desenvolvimento e sendo traduzidas clinicamente. Por exemplo, a imagem do sistema linfático e a cirurgia guiada por imagem de fluorescência intraoperatória mostraram resultados promissores para avançar os cuidados de saúde [1, 2]. Por outro lado, sondas fotoluminescentes exógenas direcionadas a regiões de interesse específicas (ex.: tumor) são ativamente desenvolvidas para imagem in vivo e ex vivo. Além dos requisitos usuais para sondas de FL (ou seja, alta absorbância, rendimento quântico de emissão e fotestabilidade), a posição e a forma espectral da emissão de FL também são parâmetros vitais a serem considerados. Como a atenuação da luz por tecidos biológicos é conhecida por ser menor na faixa do infravermelho próximo (NIR, ~700–950 nm) do que no visível, a existência de uma janela de transparência no NIR para tecidos biológicos (~700–950 nm) foi introduzida e muitos esforços são dedicados ao desenvolvimento e aplicações de sondas emissoras no NIR [3,4,5,6]. Além disso, avanços recentes levaram à introdução das segundas e terceiras janelas do NIR (NIR-II e NIR-III) na faixa espectral de ~1000–1700 nm, frequentemente denominada infravermelho de onda curta (SWIR), especialmente pelos fabricantes no campo em rápido desenvolvimento da imagem no infravermelho [7,8,9]. Apesar da maior absorção de água na faixa do SWIR em comparação com a janela NIR convencional, a menor autofluorescência e espalhamento dos tecidos biológicos permitem resolução de imagem superior e maior profundidade de imagem na bioimagem por FL no SWIR [10,11,12]. Por exemplo, na imagem por FL no SWIR de vasos linfáticos e cerebrais, usando o novo corante fluorescente SWIR CH1055-PEG, a resolução e a relação sinal-ruído foram mostradas como superiores em comparação com a imagem por FL no NIR convencional com corante NIR-I, verde de indocianina [13]. Além disso, o uso de nanossondas emissoras no SWIR (nanotubos de carbono de parede única) e câmera de imagem no SWIR permitiu ao grupo de Dai visualizar vasos sub-10 μm a profundidade de >2 mm em imagem não invasiva (sem craniotomia) da cerebrovasculatura de camundongos, o que é inacessível para imagem por FL no visível ou NIR-I [8].

Corantes orgânicos e complexos de corantes com intensa absorção na primeira janela NIR e fluorescência na janela NIR-II podem ser considerados sondas NIR-SWIR promissoras; eles foram mostrados como agentes de contraste excepcionais para imagem de vasculatura e linfonodos, delimitação de tumores e cirurgia guiada por imagem [13,14,15,16]. Vale notar que o corante orgânico verde de indocianina (ICG) é o único agente de contraste de fluorescência no NIR atualmente aprovado pela Food and Drugs Administration dos EUA para uso em humanos [17]. Ao mesmo tempo, sondas de imagem molecular (ou seja, corantes ou complexos de corantes) têm limitações associadas à necessidade de modificar sua estrutura molecular para alterar suas características de biossonda (ex.: solubilidade em água, permeabilidade celular, etc.) ou equipá-las com outras modalidades de imagem ou direcionamento. Em contraste, nanopartículas (NPs) compreendendo centros de FL podem ter sua superfície modificada covalentemente com diferentes grupos para melhorar a dispersibilidade e estabilidade em água, carga de superfície controlada ou fins de direcionamento. Além disso, a introdução de nanoplataformas de FL NIR-SWIR permite a combinação de imagem por FL com outras modalidades de imagem, diagnóstico ou terapêuticas. Estudos recentes relatam imagem de corpo inteiro, de tumores ou transcraniana em tecido profundo com nanoformulações emissoras no SWIR usadas para monitorar vários processos in vivo [14, 18,19,20,21]. Entre as várias nanossondas emissoras NIR-SWIR relatadas para imagem in vivo, dois tipos podem ser distinguidos: com fluorescência NIR-SWIR proveniente de grupos orgânicos (ou seja, polímero conjugado) ou nanocristais cerâmicos (ex.: fluoreto) dopados com íons de terras raras. Nanopartículas baseadas em polímero (PNPs) estão entre as nanomedicinas mais bem-sucedidas em traduções clínicas, devido à relativa facilidade de síntese e funcionalização química, bem como biocompatibilidade e biodegradabilidade superiores [22]. Quando carregadas com fluoróforos NIR-SWIR, as PNPs podem servir como sondas de imagem promissoras ou veículos de entrega de fármacos guiados por imagem [23, 24]. Por outro lado, nanopartículas dopadas com íons de terras raras (RENPs) são uma classe bem conhecida de nanossondas, que possuem propriedades de fotoluminescência únicas acessíveis tanto por upconversão (deslocamento anti-Stokes) quanto por down-conversão (deslocamento Stokes) [25,26,27,28,29,30]. Recentemente, as RENPs foram traduzidas para uso em imagem NIR-SWIR. Em contraste com sondas NIR-SWIR baseadas em grupos orgânicos, elas possuem alto rendimento quântico, fotestabilidade excepcional e bandas de emissão estreitas em toda a região espectral NIR-SWIR, que podem ser ajustadas através de dopagem com vários íons [20, 31, 32]. RENPs foram aplicadas a imagem de vasculatura e órgãos de pequenos animais, detecção de tumores, imagem multiplexada e multiespectral [3, 19, 20, 33,34,35].

Com o desenvolvimento emergente da bioimagem por FL, a capacidade de rastrear simultaneamente vários grupos de FL in vivo pode ser necessária para diferentes propósitos (ex.: imagem direcionada de células ou órgãos selecionados junto com entrega de fármacos guiada por imagem). Para enfrentar esse desafio, métodos de imagem multiplexada foram desenvolvidos. A imagem multiplexada refere-se à complementaridade de informações anatômicas e funcionais no sistema biológico imageado; sua aplicação pode permitir a combinação de biomarcadores, contrastes e modalidades de imagem para aumentar a utilidade da imagem em aplicações de pesquisa e clínicas [36]. A imagem multiplexada por FL pode melhorar a dimensão teranóstica da nanomedicina, oferecendo a capacidade de introduzir vários contrastes de imagem por FL junto com modalidade terapêutica. Os métodos de imagem multiplexada mais comumente usados distinguem sondas de FL pela posição espectral de sua emissão de FL, usando filtros ópticos apropriados [37,38,39]. No entanto, a multiplexação adequada nessa abordagem requer a utilização de nanossondas com espectros de FL estreitos e não sobrepostos. A esse respeito, a imagem hiperspectral (HSI) combinada com algoritmos de análise de mistura espectral é uma ferramenta promissora para multiplexação por FL. No entanto, as aplicações biomédicas de HSI por FL são principalmente limitadas à microscopia de fluorescência, para multiplexar diferentes tipos de nanossondas e eliminar fundo e autofluorescência [40, 41]. Em relação à HSI in vivo, ela é mais frequentemente usada no modo de imagem por reflexão através da aquisição e análise sequencial dos espectros de reflexão do tecido [42], embora a imagem HSI in vivo (também chamada de imagem multiespectral) também tenha sido relatada para FL no visível e NIR [3, 5]. No entanto, nenhum relato sobre HSI de nanossondas emissoras no SWIR pôde ser encontrado na literatura.

Recentemente, relatamos o desenvolvimento de um sistema HSI sequencial em banda combinado com software de desmistura espectral para imagem por FL no SWIR [43]. O procedimento de HSI sequencial em banda baseou-se na aquisição consecutiva de imagens 2D através de um elemento com transmitância espectral variada (ou seja, filtro sintonizável de cristal líquido, LCTF). Os dados de FL no SWIR obtidos de suspensões de RENPs foram apresentados como um cubo de dados espectral tridimensional (hipercubo) compreendendo duas dimensões espaciais e uma espectral. A aplicação adicional do procedimento de desmistura espectral a cada pixel espacial do hipercubo adquirido permitiu o cálculo de abundâncias em um componente de mistura de FL. Neste trabalho, aplicamos HSI para abordar a multiplexação de nanossondas para bioimagem por FL no SWIR in vivo. Usamos dois tipos de nanopartículas emissoras no SWIR com emissões que se sobrepõem espectralmente e não podem ser facilmente distinguidas em uma imagem por FL convencional com filtros ópticos, apesar de seu diferente perfil espectral. A Figura 1 ilustra o problema da mistura espectral de FL dessas nanopartículas e a forma de superá-lo usando desmistura sequencial em banda com HSI.

A HSI foi aplicada para adquirir a imagem seletiva e sensível por FL para ambos os tipos de nanopartículas. Para desmisturar os perfis espectrais de FL no SWIR, o protocolo de desmistura foi desenvolvido, permitindo-nos obter mapeamento quantitativo e espacial dos componentes na mistura, com determinação de distribuições de intensidade além das abundâncias. As técnicas de HSI no SWIR e o protocolo de desmistura desenvolvido foram posteriormente aplicados à imagem in vivo de camundongos injetados subcutaneamente com nanopartículas para demonstrar a aplicabilidade da HSI para multiplexar nanossondas de FL no SWIR na imagem in vivo.

Métodos

Preparação e Caracterização de Nanoformulações

Síntese de Nanopartículas Poliméricas Core-Shell Carregadas com Corante Fluorescente Orgânico NIR-SWIR

Nanopartículas core-shell de poliestireno (PS)-poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) foram sintetizadas por polimerização em microemulsão, com modificação do método descrito anteriormente [44, 45]. Primeiro, nanopartículas núcleo de PS-co-PNIPAM (10% em peso de PNIPAM) foram preparadas da seguinte forma. NIPAM (0,1 g), dodecil sulfato de sódio SDS (0,1 g) e 0,005 g de NaH₂PO₄ × H₂O foram dissolvidos em 45 ml de H₂O. Estireno (1 g) foi adicionado gota a gota sob agitação vigorosa quando a temperatura foi aumentada para 60 °C. Na etapa seguinte, Ar foi borbulhado na mistura por 30 min, a temperatura foi elevada para 70 °C, e 0,08 g de K₂S₂O₈ dissolvido em 1 ml de H₂O foi injetado para iniciar a polimerização. Segundo, a camada de PNIPAM foi depositada sobre o núcleo de PS-co-PNIPAM. Para este propósito, foi adicionada ao reator solução aquosa de monômero NIPAM (1,8 g) e agente de reticulação N,N'-metilenobisacrilamida (BIS) (0,18 g) em 4 ml H₂O usando uma seringa. A reação foi permitida continuar por 4 h a 70 °C. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e dialisada durante 74 h usando membrana de celulose com PMCO 3500 Da. Como resultado, a suspensão de nanopartículas PS-PNIPAM foi fabricada; uma estrutura core-shell das nanopartículas é claramente revelada pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Fig. 3a). A fim de obter PNPs fluorescentes NIR-SWIR, 2-butil-6-[5-(2-butil-1,3-dimetilciclo-hepta[c]pirrol-6(2H)-ilideno)penta-1,3-dien-1-il]-1,3-dimetilciclohepta[c]pirrólio tetra-fluoroborato (rotulado como JB9-08) corante fluorescente [46] foi pós-carregado [47] nas nanopartículas PS-PNIPAM. Oito microlitros de solução 1 mM do corante JB9-08 em DMF foi adicionado a 2 mL de suspensão aquosa 0,25% em peso de PNPs e mantido por 24 h antes do uso.

Síntese de RENPs Core-Shell

RENPs foram sintetizadas seguindo protocolo modificado relatado em outro lugar [48]. Primeiro, as nanopartículas núcleo α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺ foram preparadas via decomposição do trifluoroacetato de metal a alta temperatura. Em um procedimento típico, 0,05 mmol Yb₂O₃, 0,15 mmol Nd₂O₃, e 0,25 mmol Y₂O₃ foram carregados em um balão de 250 ml contendo 5 ml de água desionizada e 5 ml TFA e aquecidos a 90 °C por 1 h para obter uma solução clara. A solução clara resultante foi evaporada a esta temperatura sob purga de argônio para obter pó lodoso de RE(TFA)₃. Subsequentemente, 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE, e 2 mmol NaTFA foram adicionados ao balão. A solução foi aquecida a 120 °C e mantida a essa temperatura por 30 min, seguida de aquecimento até 300 °C por 30 min antes de resfriar naturalmente até a temperatura ambiente. Um ambiente de argônio foi aplicado durante todo o processo de síntese. As nanopartículas resultantes foram precipitadas pela adição de 20 mL etanol ao balão de reação resfriado. Após lavagem centrífuga com etanol por três vezes, o pó branco coletado foi finalmente disperso em 10 ml hexano para usos posteriores.

Segundo, as RENPs core-shell α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ foram preparadas via processo de crescimento epitaxial mediado por semente, envolvendo o uso de nanopartículas núcleo α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ como semente e o crescimento correspondente na solução precursora da camada. Para preparar o precursor da camada, primeiramente, 2 mmol CaO com 5 ml água desionizada e 5 ml TFA foram adicionados a um balão de 250 ml e aquecidos a 90 °C por 1 h para produzir uma solução clara. Esta solução foi então evaporada a esta temperatura para obter o precursor da camada de trifluoroacetato de cálcio (Ca(TFA)₂). Em seguida, 0,5 mmol nanopartículas núcleo NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺, 7 ml OA, e 7 ml ODE foram todos adicionados ao balão. A solução foi então aquecida a 120 °C por 30 min, seguida de aquecimento até 300 °C por 60 min antes de resfriar naturalmente. Todo o processo foi realizado sob ambiente de argônio. As nanopartículas core-shell resultantes foram precipitadas pela adição de 20 mL etanol ao balão de reação resfriado. Após lavagem centrífuga com etanol por três vezes, as NPs core-shell coletadas foram finalmente dispersas em 10 ml hexano para usos posteriores. Para preparação da dispersão aquosa, as RENPs core-shell α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ preparadas (5 mL dispersão em hexano) foram primeiramente misturadas com 5 mL solução de N,N-Dimetilformamida (DMF) de tetra-fluoroborato de nitrosonio (NOBF₄) (0,1 M) à temperatura ambiente. Uma agitação suave foi aplicada à mistura até a observação de precipitação de RENP. Subsequentemente, tolueno e hexano (1:1, volume) foram adicionados à mistura, que foi então centrifugada a 10000 rpm por 10 min. O precipitado foi coletado e disperso em 5 mL DMF. Em segundo lugar, 250 mg de poli(ácido acrílico) (PAA, PM = 18.000) foi adicionado à solução de 5 mL DMF de RENPs tratadas com NOBF₄, que foi aquecida a 80 °C e mantida a esta temperatura por 30 min sob agitação vigorosa. Após isso, as NPs foram precipitadas pela adição de acetona, lavadas com etanol, e finalmente dispersas em água destilada.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

A morfologia das PNPs e RENPs foi avaliada usando microscopia eletrônica de transmissão (MET). Para serem imageadas com MET, 10 μL de suspensão de nanopartículas foi depositada sobre filmes de suporte de carbono estabilizados com formvar. A fim de visualizar a estrutura core-shell das PNPs, elas foram coradas negativamente com solução aquosa 1% de ácido fosfotúngstico antes de serem depositadas sobre os filmes de suporte. Os filmes de suporte de carbono foram secos ao ar e lavados com 5 μL de água pura. As imagens foram obtidas operando a uma tensão de aceleração de 100 kV no MET (JEM-1230, JEOL).

Espectroscopia de Fotoluminescência

Os espectros de FL para ambos os tipos de nanopartículas foram medidos nas faixas NIR e SWIR usando um espectrofluorômetro Fluorolog-3 equipado com espectrômetro iHR320 para faixa NIR-SWIR (Horiba); um diodo a laser acoplado a fibra emitindo a 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) foi usado para excitar a FL de PNPs e RENPs.

Sistema de Imagem Hiperspectral

O sistema HSI SWIR caseiro explora o método de aquisição sequencial em banda (Fig. 2) e inclui câmera NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Bélgica), óptica de foco (TEC-M55MPW, Computar, EUA), e filtro sintonizável de cristal líquido (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, EUA) como elemento dispersivo. O sistema tem resolução de 340 × 258 pixels e opera na faixa espectral de 900–1700 nm. As fontes de iluminação no sistema incluem lâmpada incandescente (para alinhamento de imagem, foco e imagem de campo claro) e diodo a laser acoplado a fibra de 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, EUA), alimentado com fonte de energia a laser (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, EUA), para excitação de FL em imagem por FL. A aquisição do cubo de dados espectral foi realizada por sintonização sequencial da transmitância do LCTF de largura espectral de 20 nm na faixa de 900 a 1200 nm com passo de 10 nm e captura das imagens correspondentes. O tempo de exposição da câmera NIR durante a aquisição HSI foi definido para 200 ms. A densidade de potência do laser na amostra foi fixada em ~100 mW/cm². Para aquisição de imagens de FL em toda a faixa NIR-SWIR, o LCTF foi substituído por filtro de passagem longa de 850 nm (Edmund Optics, EUA).

Software de Desmistura Espectral

Para análise do cubo de dados espectral obtido, desenvolvemos algoritmo de desmistura espectral usando o ambiente MATLAB. O espectro de cada pixel é considerado como uma mistura linear de endmembers conhecidos: F(λ) = Σ aᵢGᵢ(λ), onde F(λ) — espectro do pixel, Gᵢ — espectros dos endmembers, e aᵢ são as abundâncias dos endmembers. O propósito do software de desmistura é estimar as abundâncias dos endmembers conhecidos resolvendo o problema de análise de mistura espectral linear (LSMA) em cada pixel do cubo de dados espectral adquirido. Suponha que L é o número de bandas espectrais, e p é o número de endmembers presentes em uma mistura. Então, o problema LSMA pode ser enunciado como F = Ga + n, onde F é vetor L × 1 de intensidades do pixel, G é matriz L × p contendo todos os vetores de endmembers, a é vetor p × 1 de abundâncias desconhecidas, e n é vetor L × 1 de erro. O método baseado em erro de quadrados mínimos (LSE) para resolver o problema LSMA pode ser formado como a seguinte tarefa de otimização: minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, e a solução clássica é a(r) = (GᵀG)⁻¹GᵀF. No entanto, tal solução pode conter valores negativos para abundâncias, que não têm significado físico. Para resolver este obstáculo, a tarefa de otimização LSE deve ser modificada: minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, sujeito a a ≥ 0. Para resolver esta tarefa, utilizamos algoritmo iterativo, baseado em análise de mistura espectral linear com restrição de não-negatividade (NC-LSMA) que é descrito em detalhes em [49, 50]. Após o cálculo das abundâncias para cada componente, elas são mapeadas como gráficos de mapa de cores 2D. Finalmente, o software de desmistura produz imagens de intensidade dos componentes correspondentes, baseadas nas abundâncias obtidas: Iᵢ(x,y) = aᵢ(x,y) Σ Gᵢ(λ), onde Iᵢ(x,y) — intensidade integral do i-ésimo endmember no pixel, e aᵢ(x,y) — i-ésima abundância.

Experimentos com Animais

Camundongos BALB/c nude (Fonte: The Jackson Laboratory, EUA) foram criados em condições escuras e assépticas em uma instalação de pequenos animais. Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com os critérios do Regulamento Nacional da China para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Antes da imagem, camundongos nude machos (6 semanas de idade, 20 ± 2 g) foram anestesiados com 5% de hidrato de cloral (0,06 ml por grama de peso do camundongo) por injeção intraperitoneal. Para imagem por FL no SWIR in vivo, as nanopartículas foram suspensas em tampão fosfato salino 10x (PBS) e 100 μL de cada suspensão em PBS de PNPs, RENPs, ou sua mistura foram injetados subcutaneamente nos camundongos.

Resultados e Discussão

Dois tipos de NPs fotoluminescentes no SWIR foram preparados para uso em HSI: (1) PNPs pós-carregadas com corante JB9-08, que é virtualmente não fluorescente em soluções aquosas [46] mas, como mostrado por nós [51], restaura sua fluorescência em água através do pós-carregamento na matriz polimérica das PNPs (Fig. 3a e b) e (2) nanopartículas de terras raras dopadas com íons, core-shell NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂ revestidas com PAA (RENPs, Fig. 3c e d). Íons Nd³⁺ no núcleo das RENPs podem ser excitados com luz ~808 nm (transição ⁴I₉/₂ → ⁴F₅/₂) e transferir energia para íons Yb³⁺, que emitem na faixa de 950–1100 nm com pico em ~975 nm (transição ²F₅/₂ → ²F₇/₂). O núcleo das RENPs foi revestido com camada inerte de CaF₂ para reduzir perdas não radiativas através de defeitos de superfície e interação com o ambiente circundante [48]. Ambas as nanoformulações exibem fotoluminescência na faixa de 900–1200 nm sob excitação a 808 nm (Fig. 3e).

Deve-se notar que os espectros de emissão de FL das nanopartículas obtidos com espectrofluorômetro não podem ser usados como endmembers no software de desmistura espectral por dois motivos. Primeiro, a sensibilidade do sistema HSI não é corrigida espectralmente, ao contrário do espectrofluorômetro convencional, então o perfil espectral de emissão adquirido é diferente para os dois métodos de aquisição. Segundo, os frames HSI são coletados com passo de 10 nm, embora a largura de banda espectral do LCTF seja de 20 nm. Isso resulta em sobreposição de sinal em frames vizinhos, causando distorção do perfil espectral obtido em comparação com o medido com espectrofluorômetro. Para superar esses obstáculos, os endmembers (perfis espectrais das amostras de PNPs e RENPs) foram adquiridos com o sistema HSI. Com este objetivo, ambos os tipos de nanossondas foram suspensos em PBS e suas suspensões em PBS foram colocadas em tubos de microcentrífuga (Fig. 4a). É dificilmente possível diferenciar duas amostras com imagem por FL convencional, pois seus espectros de emissão de FL se sobrepõem (Figs. 4b e 3e). Usando o sistema HSI, 31 imagens de FL foram coletadas na faixa espectral de 900 a 1200 nm com passo de 10 nm (Fig. 4c). Perfis espectrais de PNPs, RENPs e fundo (BG) foram calculados através da dimensão espectral do cubo de dados espectral pela média do sinal em áreas marcadas por quadrados vermelho, azul e verde, respectivamente (Fig. 4b). Os perfis espectrais obtidos para PNPs e RENPs (Fig. 4d) foram encontrados como semelhantes aos medidos por espectrofluorômetro e foram posteriormente usados como endmembers para a desmistura espectral. A seguir, com perfis espectrais de PNPs, RENPs e BG como endmembers, as abundâncias dos componentes correspondentes são calculadas e mapeadas como gráficos de mapa de cores 2D (Fig. 4e). As abundâncias foram calculadas para cada pixel espacial do hipercubo e foram representadas como valor de 0 a 1, com 0 e 1 indicando ausência total e abundância total do componente, respectivamente. A soma das abundâncias de todos os componentes em cada pixel é igual a 1. Deve-se notar que o software de desmistura usou limiarização pela intensidade do sinal para eliminar erros causados por pixels de baixa intensidade. Se a intensidade máxima de um pixel ao longo da dimensão espectral fosse menor que 5% do máximo de todo o hipercubo, tal pixel era considerado totalmente abundante com componente de ruído. Além disso, imagens de intensidade integral de PNPs e RENPs foram calculadas considerando as abundâncias correspondentes e eliminando o componente de fundo (Fig. 4f). Como esperado, tanto o mapeamento de abundância quanto as imagens de intensidade integral demonstram abundância total de PNPs no tubo da direita e RENPs no da esquerda, com leve erro causado pelo espalhamento da emissão de FL e imperfeição do algoritmo de desmistura.

A desmistura espectral também é capaz de distinguir a mistura de PNPs e RENPs. Para demonstrar isso, três tubos de microcentrífuga foram preenchidos com soluções de PNPs, RENPs e sua mistura. Após a aquisição do hipercubo e procedimento de desmistura espectral, o mapeamento de abundância indica presença total de PNPs no primeiro tubo de microcentrífuga, RENPs no segundo, e uma mistura dos dois no terceiro (Fig. 5a). A reconstrução de imagens de intensidade foi realizada posteriormente para revelar a distribuição de intensidade dos sinais de FL de PNPs e RENPs no espécime (Fig. 5b).

Demonstramos ainda a aplicabilidade de nosso método HSI para multiplexar as nanossondas com espectros sobrepostos na imagem por FL no SWIR in vivo. Camundongo nude foi anestesiado e injetado subcutaneamente com PNPs, RENPs e uma mistura dos dois. A imagem NIR com filtro de passagem longa de 850 nm mostra três manchas fotoluminescentes indistinguíveis (Fig. 6a). Após realizar HSI e análise, o mapeamento de abundâncias mostra abundâncias totais de PNPs e RENPs nos locais de injeção superior e inferior, respectivamente, enquanto a mistura de ambos foi identificada no local de injeção esquerdo (Fig. 6b). Além disso, para adquirir a distribuição de intensidade de FL, a reconstrução de intensidade foi realizada (Fig. 6c). Ao ajustar o valor de limiarização no software de desmistura para 15% (estimado empiricamente), tornou-se possível remover ruído em áreas adjacentes aos pontos de emissão (Fig. 6d). Tais resultados indicam que, ao contrário da modalidade de imagem por FL convencional, que emprega filtros ópticos de passagem longa ou banda, a HSI não só é capaz de mapear a distribuição de intensidade no espécime, mas também pode multiplexar os componentes presentes na mistura identificando o perfil espectral de intensidade em cada pixel da imagem.

Assim, a combinação de aquisição HSI e processamento de desmistura espectral foi aplicada neste trabalho para obter uma imagem multiplexada das nanossondas de FL no SWIR com espectros sobrepostos. Alguns pontos devem, no entanto, ser considerados em relação à aplicabilidade da modalidade HSI. Primeiro, devido à aquisição espectralmente estreita, cada frame HSI lida com intensidade de sinal relativamente baixa (especialmente no caso de emissão de FL espectralmente ampla de grupos orgânicos). Além disso, um aumento na potência do laser de excitação de FL em imagem biológica é limitado pelo perigo de dano tecidual (ou fototoxicidade). Isso resulta em requisitos mais altos para o brilho das sondas de FL e sua fotestabilidade, pois a HSI pode requerer ordem de magnitude maior tempo de aquisição em comparação com a imagem por FL convencional. Também deve-se notar que a análise de mistura linear e o algoritmo de desmistura espectral podem funcionar satisfatoriamente para imagem multiplexada por FL de tecidos biológicos na faixa espectral onde a transmitância do tecido não muda muito. Em contraste, se a transmitância do tecido tem características distintas na faixa espectral da HSI, o modelo de mistura espectral linear pode ser dificilmente aplicável (especialmente no caso de tecidos mais profundos) e modelos não lineares podem ser considerados.

Conclusões

Em conclusão, desenvolvemos uma técnica de bioimagem hiperspectral no SWIR e a aplicamos para multiplexação de nanopartículas emissoras na faixa espectral do SWIR. Dois tipos de nanopartículas com espectros de FL sobrepostos, que são indistinguíveis em imagem convencional, foram multiplexados com sucesso por seus perfis espectrais de FL usando aquisição hiperspectral junto com o algoritmo de análise de mistura espectral linear. O método desenvolvido foi empregado com sucesso para imagem multiplexada de nanopartículas de FL no SWIR tanto em suspensões de amostras quanto injetadas em pequenos animais. Com a bioimagem no SWIR tendo resolução superior em maior profundidade de imagem, a abordagem de HSI no SWIR tem grande potencial para uso em várias aplicações que requerem imagem multiplexada com nanossondas de FL NIR-SWIR. Além disso, como a bioimagem no SWIR está em estágio muito inicial, há muito espaço para o desenvolvimento de aplicações biomédicas de sondas de FL em combinação com HSI.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

BG:

Fundo

HSI:

Imagem hiperspectral

LCTF:

Filtro sintonizável de cristal líquido

NIR:

Infravermelho próximo

NPs:

Nanopartículas

FL:

Fotoluminescência

PNIPAM:

Poli-N-isopropilacrilamida

PNPs:

Nanopartículas poliméricas

PS:

Poliestireno

RENPs:

Nanopartículas de fluoreto dopadas com terras raras

SWIR:

Infravermelho de onda curta

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão