Imagem biológica hiperespectral multiplexada de nanossondas emitindo na região infravermelha de ondas curtas

Resumo

A bioimagem óptica com luminóforos exógenos emitindo na região espectral infravermelha de onda curta (SWIR, ~ 1000–1700 nm) é um campo de desenvolvimento rápido, e o desenvolvimento de múltiplas nanossondas fotoluminescentes SWIR foi relatado recentemente. Nesse sentido, a imagem hiperespectral (HSI), combinada com algoritmos de unmixing, é uma ferramenta promissora que pode permitir a multiplexação eficiente dos nanoagentes emissores de SWIR por seus perfis espectrais de fotoluminescência (PL). A técnica SWIR HSI relatada aqui é desenvolvida para multiplexar dois tipos de nanossondas:nanopartículas poliméricas dopadas com corante orgânico (PNPs) e nanopartículas de fluoreto dopadas com terras raras (RENPs). Ambos os tipos de nanossondas exibem PL na mesma faixa espectral (~ 900-1200 nm), o que impede a separação espectral de PL com filtros ópticos e limita as possibilidades de sua imagem multiplexada em tecidos biológicos. Ao aplicar SWIR HSI, exploramos as diferenças nos perfis espectrais de PL e alcançamos a imagem espectralmente seletiva e sensível do sinal de PL de cada tipo de nanopartículas. A desmistura dos dados adquiridos permitiu a multiplexação das nanossondas sobrepostas espectralmente por seu perfil PL. A distribuição quantitativa e espacial para cada tipo de nanopartículas foi obtida a partir de suas suspensões mistas. Finalmente, a técnica SWIR HSI com protocolo de unmixing foi aplicada à imagem in vivo de camundongos injetados por via subcutânea com PNPs e RENPs. A aplicabilidade de técnicas hiperespectrais para multiplexar nanossondas na imagem in vivo foi demonstrada com sucesso.

Introdução

As tecnologias de imagem biomédica estão se desenvolvendo rapidamente nas últimas décadas, permitindo a detecção e avaliação precoce de várias doenças e patologias. Entre as diferentes modalidades de imagem, a imagem óptica ocupa uma posição única devido à sua alta resolução espacial e temporal e custo relativamente baixo. Múltiplas abordagens de imagem óptica com base em fotoluminescência (ou, mais especificamente, fluorescência) estão em desenvolvimento e sendo clinicamente traduzidas. Por exemplo, a imagem do sistema linfático e a cirurgia guiada por imagem de fluorescência no intraoperatório têm mostrado resultados promissores para o avanço da saúde [1, 2]. Por outro lado, sondas fotoluminescentes exógenas direcionadas a regiões específicas de interesse (por exemplo, tumor) são ativamente desenvolvidas para imagens in vivo e ex vivo. Além dos requisitos usuais para sondas de fotoluminescência (PL) (ou seja, alta absorvância, rendimento quântico de emissão e fotoestabilidade), a posição espectral e a forma da emissão de PL também são parâmetros vitais a serem considerados. Como a atenuação da luz pelos tecidos biológicos é conhecida por ser menor na faixa espectral do infravermelho próximo (NIR) (~ 700-950 nm) do que no visível, uma existência da janela de transparência NIR para tecidos biológicos (~ 700- 950 nm) foi introduzido e muitos esforços são dedicados ao desenvolvimento e aplicações das sondas emissoras de NIR [3,4,5,6]. Além disso, os avanços recentes levaram à introdução da segunda e da terceira janela NIR (NIR-II e NIR-III) na faixa espectral de ~ 1000-1700 nm, que é frequentemente denominado como infravermelho de ondas curtas (SWIR), especialmente por fabricantes no campo de rápido desenvolvimento da imagem infravermelha [7,8,9]. Apesar da maior absorção de água na faixa SWIR em comparação com a janela NIR convencional, menor autofluorescência e dispersão de tecidos biológicos permitem resolução de imagem superior e maior profundidade de imagem na bioimagem SWIR PL [10,11,12]. Por exemplo, na imagem SWIR PL da vasculatura linfática e cerebral, usando o novo corante fluorescente SWIR CH1055-PEG, a resolução e a relação sinal / fundo mostraram-se superiores em comparação com a imagem NIR PL convencional com corante fluorescente NIR-I, verde indocianina [13]. Além disso, o uso de nanossondas emissoras de SWIR (nanotubos de carbono de parede única) e câmera de imagem SWIR permitiu ao grupo de Dai visualizar vasos sub-10 μm a uma profundidade de> 2 mm em imagens não invasivas (sem craniotomia) de cerebrovasculatura de camundongos, que é inacessível para imagens PL em faixas visíveis ou NIR-I [8].

Corantes orgânicos e complexos de corantes com absorção intensa na primeira janela NIR e fluorescência na janela NIR-II podem ser considerados sondas NIR-SWIR promissoras; eles mostraram servir como um agente de contraste excepcional para imagens de vasculatura e linfonodos, delineamento de tumor e cirurgia guiada por imagem [13,14,15,16]. É importante notar que o corante orgânico indocianina verde (ICG) é o único agente de contraste de fluorescência NIR atualmente aprovado pela Food and Drugs Administration dos EUA para uso em humanos [17]. Ao mesmo tempo, as sondas de imagem molecular (ou seja, corantes ou complexos de corantes) têm limitações associadas à necessidade de modificar sua estrutura molecular para alterar suas características de bioprobe (por exemplo, solubilidade em água, permeabilidade celular, etc.) ou fornecer-lhes outras imagens ou modalidades de segmentação. Em contraste, nanopartículas (NPs) compreendendo centros PL podem ter sua superfície modificada covalentemente com diferentes frações para melhor dispersibilidade e estabilidade em água, carga de superfície controlada ou objetivos de direcionamento. Além disso, a introdução de nanoplataformas NIR-SWIR PL permite a combinação de imagens PL com outras modalidades de imagem, diagnóstico ou terapêuticas. Estudos recentes relatam tecido profundo, corpo inteiro, tumor ou imagem transcraniana com nanoformulações emissoras de SWIR usadas para monitorar vários processos in vivo [14, 18,19,20,21]. Entre várias nanossondas emissoras de NIR-SWIR relatadas para imagem in vivo, dois tipos podem ser distinguidos:com fluorescência NIR-SWIR decorrente de frações orgânicas (isto é, polímero conjugado) ou nanocristais de cerâmica (por exemplo, fluoreto) dopados com íons de terras raras. Nanopartículas baseadas em polímeros (PNPs) estão entre os nanomedicamentos de maior sucesso em traduções clínicas, devido à relativa facilidade na síntese e funcionalização química, bem como biocompatibilidade e biodegradabilidade superiores [22]. Quando carregados com fluoróforos NIR-SWIR, PNPs podem servir como sondas de imagem promissoras ou veículos de entrega de drogas guiados por imagem [23, 24]. Por outro lado, nanopartículas dopadas com íons de terras raras (RENPs) são uma classe bem conhecida de nanossondas, que têm propriedades de fotoluminescência exclusivas acessíveis por meio de processos de conversão ascendente (anti-Stokes-shifted) e down-conversion (Stokes-shifted) [25,26,27,28,29,30]. Recentemente, os RENPs foram traduzidos para uso em imagens NIR-SWIR. Em contraste com as sondas NIR-SWIR baseadas em frações orgânicas, elas possuem alto rendimento quântico, fotoestabilidade excepcional e bandas de emissão estreitas em toda a região espectral NIR-SWIR, que pode ser ajustada por dopagem com vários íons [20, 31, 32]. RENPs foram aplicados a imagens de órgãos e vasculatura de pequenos animais, detecção de tumor, multiplexado e imagem multiespectral [3, 19, 20, 33,34,35].

Com o desenvolvimento emergente de bioimagem de PL, uma capacidade de rastrear simultaneamente várias frações de PL in vivo pode ser necessária para diferentes fins (por exemplo, imagem direcionada das células ou órgãos selecionados, juntamente com a entrega de droga guiada por imagem). Para enfrentar este desafio, foram desenvolvidos métodos de imagem multiplexados. Imagens multiplexadas referem-se à complementaridade de informações anatômicas e funcionais no sistema biológico de imagens; sua aplicação pode permitir a combinação de biomarcadores de imagem, contrastes e modalidades para aumentar a utilidade da imagem em pesquisas e aplicações clínicas [36]. A imagem PL multiplexada pode aumentar a dimensão teranóstica da nanomedicina, oferecendo a capacidade de introduzir vários contrastes de imagem PL junto com a modalidade terapêutica. Os métodos de imagem multiplexados mais comumente usados ​​distinguem as sondas PL pela posição espectral de sua emissão de PL, usando filtros ópticos apropriados [37,38,39]. No entanto, a multiplexação adequada em tal abordagem requer a utilização de nanossondas com espectros de PL espectralmente estreitos e não sobrepostos. Nesse sentido, a imagem hiperespectral (HSI) combinada com algoritmos de análise de mistura espectral é uma ferramenta promissora para multiplexação PL. No entanto, as aplicações biomédicas de PL HSI são principalmente limitadas à microscopia de fluorescência, para multiplexar diferentes tipos de nanossondas e eliminar fundo e autofluorescência [40, 41]. Em relação ao HSI in vivo, é mais frequentemente usado no modo de imagem de reflexão por meio de aquisição e análise sequencial dos espectros de reflexão do tecido [42], embora a imagem HSI in vivo (também chamada de imagem multiespectral) também tenha sido relatada para PL no visível e intervalos NIR [3, 5]. No entanto, nenhum relatório sobre HSI de nanossondas emissoras de SWIR foi encontrado na literatura.

Recentemente, relatamos o desenvolvimento de um sistema HSI de banda sequencial combinado com software de desmistura espectral para imagens SWIR PL [43]. O procedimento HSI sequencial de banda foi baseado na aquisição consecutiva de imagens 2D através de um elemento com transmitância espectralmente variada (isto é, filtro sintonizável de cristal líquido, LCTF). Os dados SWIR PL obtidos de suspensões de RENPs foram apresentados como um cubo de dados espectrais tridimensionais (hipercubo) compreendendo duas dimensões espaciais e uma espectral. A aplicação adicional do procedimento de unmixing espectral para cada pixel espacial do hipercubo adquirido permitiu o cálculo de abundâncias em um componente de mistura PL. Aqui, aplicamos HSI para abordar a multiplexação de nanossondas para a bioimagem SWIR PL in vivo. Usamos dois tipos de nanopartículas emissoras de SWIR com emissões que se sobrepõem espectralmente e não podem ser facilmente distinguidas em uma imagem PL convencional com filtros ópticos, apesar de seu perfil espectral diferente. A Figura 1 ilustra o problema da mistura espectral de PL a partir dessas nanopartículas e a maneira de superá-la usando a separação sequencial de banda com HSI.

Esquema que ilustra a aplicação de HSI para multiplexar nanossondas fotoluminescentes

O HSI foi aplicado para adquirir a imagem PL espectralmente seletiva e sensível para ambos os tipos de nanopartículas. Para unmixar os perfis espectrais SWIR PL, foi desenvolvido o protocolo de unmixing, que nos permite obter mapeamento quantitativo e espacial dos componentes da mistura, com determinação de distribuições de intensidade além de abundâncias. As técnicas SWIR HSI e o protocolo de unmixing desenvolvido foram posteriormente aplicados à imagem in vivo de camundongos injetados subcutaneamente com nanopartículas para demonstrar a aplicabilidade do HSI para multiplexar nanossondas SWIR PL na imagem in vivo.

Métodos

Preparação e caracterização da nanoformulação

Síntese de nanopartículas poliméricas de núcleo-casca carregadas com corante orgânico fluorescente NIR-SWIR

Poliestireno (PS) -poli- N As nanopartículas de núcleo-casca de -isopropilacrilamida (PNIPAM) foram sintetizadas por polimerização em microemulsão, com modificação do método descrito anteriormente [44, 45]. Em primeiro lugar, as nanopartículas de núcleo PS-co-PNIPAM (10% em peso de PNIPAM) foram preparadas como se segue. NIPAM (0,1 g), dodecil sulfato de sódio SDS (0,1 g) e 0,005 g de NaH ₂ PO ₄ × H ₂ O foram dissolvidos em 45 ml de H ₂ O. Estireno (1 g) foi adicionado gota a gota com agitação vigorosa quando a temperatura foi aumentada para 60 ° C. Como a próxima etapa Ar foi borbulhado na mistura por 30 min, a temperatura foi elevada para 70 ° C, e 0,08 g de K ₂ S ₂ O ₈ dissolvido em 1 ml de H ₂ O foi injetado para iniciar a polimerização. Em segundo lugar, o shell PNIPAM foi colocado em camadas no núcleo PS-co-PNIPAM. Para tanto, ao reator foi adicionada solução aquosa de monômero NIPAM (1,8 g) e reticulador N , N ′ -Metilenobisacrilamida (BIS) (0,18 g) em 4 ml de H ₂ O usando uma seringa. A reação foi deixada continuar durante 4 h a 70 ° C. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e dialisada durante 74 h usando membrana de celulose com MWCO 3500 Da. Como resultado, a suspensão das nanopartículas de PS-PNIPAM foi fabricada; uma estrutura de núcleo-casca das nanopartículas é claramente revelada pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Fig. 3a). A fim de obter PNPs fluorescentes NIR-SWIR, 2-butil-6- [5- (2-butil-1,3-dimetilciclo-hepta [c] pirrol-6 (2H) -ilideno) penta-1,3-dien -1-il] -1,3-dimetilciclohepta [c] pirrólio tetra-fluoroborato (rotulado como JB9-08) corante fluorescente [46] foi pós-carregado [47] em nanopartículas de PS-PNIPAM. Oito microlitros de solução de corante JB9-08 1 mM em DMF foram adicionados a 2 mL de suspensão aquosa de PNPs a 0,25% em peso e mantidos por 24 horas antes do uso.

Síntese de RENPs Core-Shell

RENPs foram sintetizados seguindo o protocolo modificado relatado em outro lugar [48]. Primeiro, o α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ nanopartículas de núcleo foram preparadas através da decomposição do trifluoroacetato de metal em alta temperatura. Em um procedimento típico, 0,05 mmol Yb ₂ O ₃ , 0,15 mmol Nd ₂ O _3, e 0,25 mmol Y ₂ O ₃ foram carregados em um frasco de 250 ml contendo 5 ml de água desionizada e 5 ml de TFA e aquecidos a 90 ° C durante 1 h para produzir uma solução límpida. A solução clara resultante foi evaporada a esta temperatura sob purga de argônio para obter RE em pó lamacento (TFA) ₃ . Subsequentemente, 8 ml de OA, 8 ml de OM, 12 ml de ODE e 2 mmol de NaTFA foram adicionados ao frasco. A solução foi aquecida a 120 ° C e mantida a essa temperatura por 30 min, seguida de aquecimento a 300 ° C por 30 min antes de resfriar naturalmente até a temperatura ambiente. Um ambiente de argônio foi aplicado durante todo o processo de síntese. As nanopartículas resultantes foram precipitadas pela adição de 20 mL de etanol ao frasco de reação resfriado. Após lavagem centrífuga com etanol por três vezes, o pó branco coletado foi finalmente disperso em 10 ml de hexano para usos posteriores.

Em segundo lugar, o α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ RENPs de núcleo-casca foram preparados por meio de um processo de crescimento epitaxial mediado por sementes, envolvendo o uso de α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ núcleo como a semente e o crescimento correspondente na solução do precursor da casca. Para preparar o precursor de casca, em primeiro lugar, 2 mmol de CaO com 5 ml de água desionizada e 5 ml de TFA foram adicionados a um frasco de 250 ml e aquecidos a 90 ° C durante 1 h para produzir uma solução límpida. Esta solução foi então evaporada a esta temperatura para produzir o precursor de casca de trifluoroacetato de cálcio (Ca (TFA) ₂ ) Em seguida, 0,5 mmol NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ nanopartículas de núcleo, 7 ml de OA e 7 ml de ODE foram todos adicionados ao frasco. A solução foi então aquecida a 120 ° C por 30 min, seguido por aquecimento a 300 ° C por 60 min antes de resfriar naturalmente. Todo o processo foi realizado em ambiente de argônio. As nanopartículas de núcleo-casca resultantes foram precipitadas pela adição de 20 mL de etanol ao frasco de reação resfriado. Após lavagem centrífuga com etanol por três vezes, os NPs núcleo-casca coletados foram finalmente dispersos em 10 ml de hexano para usos posteriores. Para a preparação da dispersão aquosa, o α-NaYF ₄ preparado :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ RENPs de núcleo-casca (5 mL de dispersão de hexano) foram primeiramente misturados com 5 mL de N , N Solução -Dimetilformamida (DMF) de tetra-fluoroborato de nitrosônio (NOBF ₄ ) (0,1 M) à temperatura ambiente. Uma agitação suave foi aplicada à mistura até a observação da precipitação do RENP. Posteriormente, tolueno e hexano (1:1, volume) foram adicionados à mistura, que foi então centrifugada a 10.000 rpm por 10 min. O precipitado foi recolhido e disperso em 5 mL de DMF. Em segundo lugar, 250 mg de poli (ácido acrílico) (PAA, MW =18.000) foram adicionados à solução DMF de 5 mL de NOBF ₄ -RENPs tratados, que foram aquecidos a 80 ° C e mantidos a esta temperatura por 30 min sob agitação vigorosa. Em seguida, os NPs foram precipitados pela adição de acetona, lavados com etanol e finalmente dispersos em água destilada.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

As morfologias de PNPs e RENPs foram avaliadas usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Para obter a imagem com TEM, 10 μL de suspensão de nanopartículas foram jogados sobre os filmes de suporte de carbono estabilizados com formvar. A fim de visualizar a estrutura do núcleo-casca dos PNPs, eles foram corados negativamente com solução aquosa a 1% de ácido fosfotúngstico antes de cair sobre os filmes de suporte. Os filmes de suporte de carbono foram secos ao ar e lavados com 5 μL de água pura. As imagens foram obtidas operando em uma tensão de aceleração de 100 kV no TEM (JEM-1230, JEOL).

Espectroscopia de fotoluminescência

Os espectros de PL para ambos os tipos de nanopartículas foram medidos nas faixas NIR e SWIR usando um espectrofluorômetro Fluorolog-3 equipado com espectrômetro iHR320 para a faixa NIR-SWIR (Horiba); um diodo de laser acoplado a fibra emitindo a 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) foi usado para excitar PL de PNPs e RENPs.

Sistema de imagem hiperespectral

O sistema SWIR HSI caseiro explora o método de aquisição sequencial de banda (Fig. 2) e inclui câmera NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Bélgica), óptica de foco (TEC-M55MPW, Computar, EUA) e filtro ajustável de cristal líquido (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, EUA) como um elemento dispersivo. O sistema tem resolução de 340 × 258 pixels e opera na faixa espectral de 900–1700 nm. As fontes de iluminação no sistema incluem lâmpada incandescente (para alinhamento de imagem, foco e imageamento de campo claro) e diodo de laser acoplado a fibra de 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, EUA), alimentado por fonte de energia de laser (fonte de laser 4308 , Arroyo Instruments, EUA), para excitação de PL em imagens de PL. A aquisição do cubo de dados espectrais foi realizada por ajuste sequencial de transmitância LCTF de largura espectral de 20 nm na faixa de 900 a 1200 nm com passo de 10 nm e captura de imagens correspondentes. O tempo de exposição da câmera NIR durante a aquisição HSI foi definido como 200 ms. A densidade de potência do laser na amostra foi fixada em ~ 100 mW / cm ² . Para aquisição de imagens PL em toda a faixa NIR-SWIR, o LCTF foi substituído por filtro passa-comprimento de 850 nm (Edmund Optics, EUA).

Diagrama esquemático do sistema de imagem hiperespectral NIR-SWIR

Spectral Unmixing Software

Para a análise do cubo de dados espectrais obtidos, desenvolvemos o algoritmo de unmixing espectral usando o ambiente MATLAB. O espectro de cada pixel é considerado uma mistura linear de membros finais conhecidos:\ (F \ left (\ lambda \ right) =\ sum \ limits_i {a} _i {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), onde F ( λ ) —Espectro de pixel, G _i - espectros de membros finais e a _i são abundância de membros finais. O objetivo do software de unmixing é estimar as abundâncias de membros finais conhecidos, resolvendo o problema de análise de mistura espectral linear (LSMA) em cada pixel do cubo de dados espectrais adquiridos. Suponha, L é o número de bandas espectrais e p é o número de membros finais presentes em uma mistura. Então, o problema LSMA pode ser declarado como F = Ga + n , onde F é L × 1 vetor de intensidades de pixel, G é L × p matriz contendo todos os vetores de membros finais, a é p × 1 vetor de abundâncias desconhecidas e n é L × 1 vetor de erro. O método baseado no erro de mínimos quadrados (LSE) para resolver o problema LSMA pode ser formado como a seguinte tarefa de otimização:min _a {( F - Ga ) ^T ( F - Ga )}, e a solução clássica é a ( r ) =( G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . No entanto, essa solução pode conter valores negativos para abundâncias, que não têm significado físico. Para resolver este obstáculo, a tarefa de otimização LSE deve ser modificada:min _a {( F - Ga ) ^T ( F - Ga )}, sujeito a a ≥ 0. Para resolver esta tarefa, utilizamos algoritmo iterativo, baseado na análise de mistura espectral linear com restrição de não negatividade (NC-LSMA) que é descrita em detalhes em [49, 50]. Após o cálculo das abundâncias para cada componente, eles são mapeados como gráficos de mapa de cores 2D. Finalmente, o software de unmixing produz imagens de intensidade dos componentes correspondentes, com base nas abundâncias obtidas:\ ({I} _i \ left (x, y \ right) ={a} _i \ left (x, y \ right) \ sum \ limits_ {\ lambda} {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), onde eu _i ( x , y ) —Intensidade integral de i -ésimo membro final em pixel e a _i ( x , y ) - i -ésima abundância.

Experimentos com animais

Os camundongos nus BALB / c (Fonte:The Jackson Laboratory, EUA) foram criados sob condições escuras e assépticas em uma pequena instalação de animais. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os critérios do Regulamento Nacional da China para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Antes da imagem, camundongos nus machos (6 semanas de idade, 20 ± 2 g) foram anestesiados com hidrato de cloral a 5% (0,06 ml por grama de peso do camundongo) por injeção intraperitoneal. Para imagens SWIR PL in vivo, as nanopartículas foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x e 100 μL de cada suspensão de PBS de PNPs, RENPs ou suas misturas foram injetadas por via subcutânea nos camundongos.

Resultados e discussão

Dois tipos de NPs fotoluminescentes SWIR foram preparados para uso em HSI:(1) PNPs pós-carregados com corante JB9-08, que é virtualmente não fluorescente em soluções aquosas [46], mas, como mostrado por nós [51], restaura sua fluorescência em água por pós-carregamento na matriz polimérica de PNPs (Fig. 3a eb) e (2) NaYF revestido com PAA ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ nanopartículas dopadas com íons de terras raras de núcleo-casca (RENPs, Fig. 3c e d). Nd ³⁺ íons no núcleo de RENPs podem ser excitados com luz ~ 808 nm ( ⁴ I _9/2 → ⁴ F _5/2 transição) e transferir energia para Yb ³⁺ íons, que emitem na faixa de 950-1100 nm com pico em ~ 975 nm ( ² F _5/2 → ² F _7/2 transição). O núcleo de RENPs foi revestido com CaF inerte ₂ shell para reduzir as perdas não radiativas através de defeitos de superfície e interação com o ambiente circundante [48]. Ambas as nanoformulações exibem fotoluminescência na faixa de 900-1200 sob excitação de 808 nm (Fig. 3e).

Caracterização de PNPs e RENPs. Imagem TEM ( a ) e estrutura esquemática ( b ) de PNPs carregados com o corante JB9-08. Imagem TEM ( c ) e estrutura esquemática ( d ) de RENPs. e Espectros de emissão de PL normalizados de suspensões de PNPs-JB9-08 e RENPs sob excitação de 808 nm. Barras de escala, 100 nm

Deve-se notar que os espectros de emissão de PL das nanopartículas obtidas com espectrofluorômetro não podem ser usados ​​como membros finais em software de desmistura espectral por dois motivos. Em primeiro lugar, a sensibilidade do sistema HSI não é corrigida espectralmente, ao contrário do espectrofluorômetro convencional, portanto, o perfil espectral de emissão adquirido é diferente para dois métodos de aquisição. Em segundo lugar, os quadros HSI são coletados com passo de 10 nm, embora a largura de banda espectral do LCTF seja de 20 nm. Isso resulta na sobreposição do sinal em frames vizinhos, causando distorção do perfil espectral obtido em comparação ao medido com espectrofluorômetro. Para superar esses obstáculos, membros finais (perfis espectrais de amostras de PNPs e RENPs) foram adquiridos com o sistema HSI. Com este objetivo, ambos os tipos de nanossondas foram suspensos em PBS e suas suspensões de PBS foram colocadas em tubos de microcentrífuga (Fig. 4a). Dificilmente é possível diferenciar duas amostras com imagens convencionais de PL, pois seus espectros de emissão de PL se sobrepõem (Figs. 4b e 3e). Usando o sistema HSI, 31 imagens PL foram coletadas em uma faixa espectral de 900 a 1200 nm com 10 nm (Fig.4c). Perfis espectrais de PNPs, RENPs e fundo (BG) foram calculados através da dimensão espectral do cubo de dados espectrais pela média do sinal em áreas marcadas por quadrados vermelhos, azuis e verdes, correspondentemente (Fig.4b). Os perfis espectrais obtidos para PNPs e RENPs (Fig. 4d) foram considerados semelhantes aos medidos por espectrofluorômetro e foram posteriormente usados ​​como membros finais para a desmistura espectral. Depois disso, com PNPs, RENPs e perfis espectrais BG como membros finais, as abundâncias dos componentes correspondentes são calculadas e mapeadas como gráficos de mapa de cores 2D (Fig. 4e). Abundâncias foram calculadas para cada pixel espacial do hipercubo e foram representadas como um valor de 0 a 1, com 0 e 1 indicando a ausência total e a abundância total do componente, respectivamente. A soma das abundâncias de todos os componentes em cada pixel é igual a 1. Deve-se notar que o software de unmixing usou o limiar por intensidade do sinal para eliminar erros causados ​​por pixels de baixa intensidade. Se a intensidade máxima de um pixel ao longo da dimensão espectral fosse inferior a 5% do máximo de todo o hipercubo, tal pixel era considerado totalmente abundante com o componente de ruído. Além disso, imagens de intensidade integral de PNPs e RENPs foram calculadas considerando abundâncias correspondentes e eliminando o componente de fundo (Fig. 4f). Como era de se esperar, tanto o mapeamento de abundância quanto as imagens de intensidade integral demonstram abundância total de PNPs no tubo direito e RENPs no tubo esquerdo, com pequeno erro causado pelo espalhamento da emissão de PL e imperfeição do algoritmo de desmistificação.

HSI de tubos de microcentrífuga contendo RENPs e PNPs. a Imagem de campo claro de tubos de microcentrífuga com PNPs e RENPs suspensos em PBS. b Imagem PL de amostras de PNPs e RENPs excitadas com 808 nm (filtro passa-comprimento de 850 nm foi usado para aquisição de imagem). c Esquema que ilustra o hipercubo composto de quadros HSI. d Perfis espectrais de PNPs, RENPs e plano de fundo (BG) em média do ROI mostrado em b como quadrados vermelhos, azuis e verdes, correspondentemente. e Mapas coloridos de abundância de componentes. f Imagens de intensidade reconstruídas dos componentes PL e imagem mesclada PL / campo claro

A desmistura espectral também é capaz de distinguir a mistura de PNPs, RENPs. Para demonstrar isso, três tubos de microcentrífuga foram preenchidos com soluções de PNPs, RENPs e suas misturas. Após a aquisição do hipercubo e procedimento de desmistura espectral, o mapeamento de abundância indica a presença total de PNPs no primeiro tubo de microcentrífuga, RENPs no segundo e uma mistura dos dois no terceiro (Fig. 5a). A reconstrução das imagens de intensidade foi ainda realizada para revelar a distribuição da intensidade dos sinais de PNPs e RENPs PL na amostra (Fig. 5b).

HSI de tubos de microcentrífuga contendo (da esquerda para a direita) RENPs, PNPs e uma mistura de ambos. a Abundâncias de PNPs, RENPs e antecedentes (BG). b Imagens de intensidade de PL reconstruídas e imagem mesclada de PL / campo claro

Demonstramos ainda a aplicabilidade do nosso método HIS para multiplexar as nanossondas sobrepostas espectralmente em imagens SWIR PL in vivo. O camundongo nu foi anestesiado e injetado subcutaneamente com PNPs, RENPs e uma mistura dos dois. A imagem NIR com filtro passa longo de 850 nm mostra três manchas fotoluminescentes indistinguíveis (Fig. 6a). Depois de realizar HSI e análise, o mapeamento de abundâncias mostra abundâncias completas de PNPs e RENPs nos locais de injeção superior e inferior, respectivamente, enquanto a mistura de dois foi identificada no local de injeção esquerdo (Fig. 6b). Além disso, para adquirir a distribuição da intensidade do PL, foi realizada a reconstrução da intensidade (fig. 6c). Ajustando o valor de limiar no software de unmixing para 15% (estimado empiricamente), tornou-se possível remover o ruído em áreas adjacentes aos pontos de emissão (Fig. 6d). Tais resultados indicam que, ao contrário da modalidade de imagem PL convencional, que emprega filtros ópticos longos ou de passagem de banda, o HSI não só é capaz de mapear a distribuição de intensidade na amostra, mas também pode multiplexar os componentes presentes na mistura, identificando o perfil espectral de intensidade em cada pixel da imagem.

HSI de camundongo injetado por via subcutânea com PNPs (local de injeção superior direito), RENPs (canto inferior direito) e mistura de RENPs / PNPs (esquerda). a Campo claro (SWIR), SWIR PL e imagens mescladas adquiridas com filtro de emissão de passagem de comprimento de 850 nm. b Abundâncias de PNPs, RENPs e antecedentes (BG). c Imagens de intensidade reconstruídas correspondentes. d Imagens de intensidade PL reconstruídas a partir de abundâncias com nível de limiar de 15% e imagem mesclada PL / campo claro.

Assim, a combinação de aquisição de HSI e processamento de unmixing espectral foi aplicada neste trabalho para obter uma imagem multiplexada das nanossondas SWIR PL espectralmente sobrepostas. A few issues should, however, be considered in regard to the applicability of HSI modality. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Conclusões

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Availability of Data and Materials

All data generated or analyzed during this study are included in this published article.

Abreviações

BG:

Fundo

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Near-infrared

NPs:

Nanopartículas

PL:

Photoluminescence

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS:

Poliestireno

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

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