Proteína Morfogênica Óssea-2 (rhBMP2) -Loaded Silk Fibroin Scaffolds para Aumentar a Osteoindutividade na Engenharia de Tecido Ósseo

Resumo

Há uma demanda crescente por formulações de andaimes de fibroína de seda (SF) em aplicações biomédicas. SF foi reticulado via glutaraldeído com proteína morfogênica óssea humana recombinante osteoindutora-2 (rhBMP2) de diferentes proporções viz. (i) 3% SF sem rhBMP2 (SF), (ii) 3% SF com quantidade igual de rhBMP2 (SF + BMP2), e (iii) 12% SF com 3% de rhBMP2 (4SF + BMP2), e estes soluções foram usadas na fabricação baseada em eletrofiação de nanoscaffolds para avaliar o potencial osteoindutivo aumentado de scaffolds SF com rhBMP2. A relação tensão-deformação sugeriu que não há perda na resistência mecânica das fibras com a adição de rhBMP2, e a resistência mecânica do andaime foi melhorada com o aumento da concentração de SF. A associação de rhBMP2 aumentou a capacidade de retenção de água do andaime, conforme evidente em estudos de intumescimento. Verificou-se que a viabilidade de hMSCs é maior em andaimes conjugados, e os andaimes não exibem qualquer citotoxicidade para células hóspedes. Verificou-se que as células têm maior atividade de fosfatase alcalina em andaimes conjugados sob condições in vitro e in vivo, o que estabelece a osteoindutividade aumentada da nova construção. Os scaffolds foram considerados eficazes também para a formação óssea in vivo.

Histórico

A capacidade regenerativa do osso permite o reparo de pequenas fraturas ósseas por si só. O osso é formado, seguido pela união e, finalmente, reconstrução da forma original e forma do osso. No entanto, essa capacidade é limitada, o que cria a necessidade de autoenxertos ou aloenxertos para o tratamento [1]. A aloenxertia envolve a obtenção do osso de um doador separado que pode causar reação imunológica. O autoenxerto, onde o osso é obtido do próprio corpo do paciente, não cria problemas imunológicos, mas é limitado pela quantidade suficiente de ossos disponíveis [2,3,4].

A engenharia de tecidos está sendo percebida como uma tecnologia potencial para superar a limitação imunológica do aloenxerto e do autoenxerto. Com a engenharia de tecidos, células especializadas como células-tronco mesenquimais humanas ou células de osteossarcoma (MG63) são cultivadas em um ambiente adequado sobre uma estrutura pré-fabricada, e este sistema de células e estrutura é então usado como um enxerto [5, 6].

O andaime é usado para fornecer ancoragem e nicho bioquímico às células para sobrevivência e proliferação. Várias propriedades viz. resistência mecânica, osteoindução, biorresorção, porosidade graduada e biocompatibilidade devem ser consideradas ao selecionar o material para a fabricação do andaime. A osteoindução (indução da formação óssea) é uma das propriedades exigidas do material a ser utilizado na fabricação de andaimes de engenharia de tecido ósseo (BTE) [7]. Scaffolds com fatores osteogênicos são potentes por mimetizarem o processo de regeneração do tecido ósseo que acopla a angiogênese e a osteogênese que podem recrutar células progenitoras e sua diferenciação. Proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) são a classe de fatores de crescimento que induzem a formação óssea e são propostas para aplicações BTE juntamente com matriz óssea desmineralizada (DBM) e fosfato de cálcio [8,9,10].

Vários grupos relataram o uso de metais, cerâmicas, polímeros sintéticos e compostos e fibroína de seda como materiais potenciais para a fabricação de andaimes em BTE. A fibroína de seda (SF) tem sido relatada como um material adequado para a fabricação de andaimes para aplicação em engenharia de tecidos devido às suas notáveis propriedades mecânicas e biocompatíveis [5]. Até a data, nenhum relatório foi publicado avaliando os benefícios associativos de BMPs com nanoscaffolds eletrofiados SF.

Aqui, relatamos a fabricação de novos arcabouços nanofibrosos de SF por eletrofiação de osso humano recombinante de proteína-2 (rhBMP2) conjugada. Os scaffolds foram comparados com os scaffolds SF puros para elucidar o efeito da conjugação de rhBMP2 na osteoindução. A viabilidade celular e as propriedades de proliferação celular também foram medidas para estabelecer a potência do arcabouço para novas e melhores aplicações de engenharia de tecido ósseo.

Métodos

Preparação de soluções aquosas de SF / BMP2

No início, SF foi isolado dos casulos do bicho-da-seda, Bombyx mori , como uma solução aquosa. O protocolo estabelecido foi seguido com pequenas modificações [11]. Os casulos foram fervidos em 100 mL de Na ₂ 0,02 M CO ₃ por 20 min e, em seguida, enxágue abundantemente com água destilada para remover o excesso de sericina e cera solúvel em água. A fibroína extraída foi então dissolvida em solução de brometo de lítio 9 M a 60 ° C por 4 h e foi posteriormente dialisada contra água por 4 dias. A concentração final foi determinada pesando a matéria seca após a secagem e verificou-se ser 7% w / v . Esta solução foi então usada após concentração em diferentes níveis por diálise contra 1 L de polietilenoglicol a 25% (PEG, 10.000 g mol ⁻¹ ) solução à temperatura ambiente. Soluções aquosas de SF diluídas foram preparadas por diluição com água destilada, e todas as soluções foram armazenadas a 10 ° C até o processamento posterior. Pó liofilizado de proteína-2 morfogênica óssea humana recombinante (rhBMP2) foi dissolvido em PBS (pH 3,8). A solução de proteína foi esterilizada com filtros de seringa de 0,22 μm e adicionada como solução aquosa a cada solução de fibroína com agitação contínua. A reticulação mediada por glutaraldeído foi empregada para associar o BMP à fibroína. Resumidamente, para 10 mL de mistura de reação, 5 mL de cada um de 6% de fibroína de seda e 1% de rhBMP2 foram reticulados usando 200 μL de glutaraldeído e 40 μL, 12 N de HCl como agente de ativação de grupo. Com este procedimento, três soluções foram preparadas:(i) fibroína de seda de 3% sem rhBMP2 (SF), (ii) fibroína de seda de 3% com 0,5% de rhBMP2 (SF + rhBMP2), e (iii) fibroína de seda de 12% com 0,125% de rhBMP2 como em (ii) (4SF + rhBMP2). Essas soluções foram utilizadas em procedimentos de eletrofiação para fabricação de andaimes.

Fabricação de andaimes por eletrofiação

Para a fabricação do andaime, cada solução foi carregada em uma seringa de vidro de 5 mL com uma agulha de aço inoxidável (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) que está conectada a um suprimento DC de 5,5 kV. Para a preparação das fibras, a taxa de fluxo de saída foi mantida em 0,4 mL h ⁻¹ usando uma bomba de seringa, e as fibras eletrofiadas foram coletadas em uma folha de alumínio mantida a uma lacuna de 15 cm da ponta do capilar. As amostras foram coletadas por 4 h cada.

Microscopia Eletrônica de Varredura

Para o exame morfológico dos scaffolds preparados, SEM foi realizado usando Zeiss EVO40SEM. As amostras foram revestidas por pulverização catódica com ouro antes de as imagens de digitalização serem processadas. A determinação do diâmetro da fibra é feita calculando a média dos diâmetros de 10 fibras aleatórias no quadro da imagem.

Propriedades mecânicas do andaime

Experimentos compressivos foram feitos para avaliar as propriedades mecânicas de andaimes desenvolvidos usando o testador eletromecânico de mesa de coluna única Instron (modelo 3345, Instron, Canton, MA). Fibras com 0,2 mm de diâmetro, obtidas por eletrofiação com durações mais longas, foram usadas para determinar a resistência à tração e o alongamento na ruptura das curvas tensão-deformação a 25 ° C e 50% de umidade.

Estudo de inchaço

Para medição da razão de dilatação, cada formulação foi dissolvida em PBS (pH 7,4) a 37 ° C. As amostras foram retiradas em intervalos de tempo pré-determinados, e o peso seco foi medido em uma balança eletrônica. O teste foi continuado até que o peso de equilíbrio fosse alcançado. A taxa de inchaço foi expressa como abaixo:
$$ \ mathrm {Inchaço} \ \ mathrm {ratio} \ left (\% \ right) =\ frac {W \ mathrm {s} -W \ mathrm {o}} {W \ mathrm {o}} $$
onde, W _o =peso seco inicial das matrizes nanofibrosas e W _s =peso das matrizes nanofibrosas inchadas em cada ponto de tempo.

Cultura de células

Células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) foram utilizadas no presente estudo para avaliar o potencial osteoindutor dos nanocanos fabricados. As hMSCs foram cultivadas e mantidas em DMEM com 10% de soro fetal de vitela e 1% de penicilina, a 37 ° C em 5% de CO ₂ atmosfera umidificada até 90% de confluência. As células foram então tripsinizadas, centrifugadas e ressuspensas em meio para quantificação.

Os andaimes foram esterilizados por lavagem com etanol e irradiação com luz ultravioleta por 30 min e depois lavados com PBS (pH 7,4). Um tratamento com DMEM é dado aos andaimes antes da semeadura das células. 20 μL de suspensão de células foram adicionados gota a gota a cada andaime e filme plástico servindo como controle. Os andaimes foram mantidos em repouso em atmosfera umidificada (37 ° C, 5% CO ₂ ) por 30 min. Em seguida, os andaimes foram incubados em DMEM por 21 dias com reposição regular de meio em dias alternados.

Ensaio de adesão celular

Para avaliar a capacidade de adesão das células com o andaime, o número de células não aderidas foi contado após 1, 3 e 6 h de semeadura inicial de acordo com o método na literatura com pequenas modificações [6]. O meio celular foi coletado e a contagem das células feita com hemocitômetro. A diferença entre a contagem de semeadura inicial e o número de células não aderidas foi considerada como o número de células aderidas. Os resultados foram expressos em termos de porcentagem de adesão de acordo com a seguinte equação:
$$ \% \ mathrm {Adesão} =\ frac {\ mathrm {Inicial} \ \ mathrm {semeadura} - \ mathrm {número} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {não} \ \ mathrm {aderente} \ kern0 .5em \ mathrm {células}} {\ mathrm {Inicial} \ \ mathrm {semeadura}} \ vezes 100 $$

Ensaio de citotoxicidade

Para medir o efeito tóxico de matrizes nanofibrosas, o ensaio MTT foi realizado. Após o respectivo período de tempo, os construtos foram incubados em solução de MTT (1 mg mL ⁻¹ solução estoque diluída em PBS (pH 7,4) em uma proporção de 1:10) e incubada por 4 h. As células viáveis convertem MTT em sal de formazan durante este período de incubação. O sal formazan foi dissolvido pela adição de DMSO e mantido à parte durante 20 min. A absorbância originada do sal de formazan foi medida quantitativamente registrando as mudanças na absorbância a 570 nm usando um leitor de microplaca.

Ensaio de proliferação celular

O ensaio de redução do corante azul Alamar (AB) foi realizado para determinar a proliferação de células dentro da estrutura. Os andaimes foram incubados em corante diluído com DMEM por 4 h, e a redução no corante foi medida espectrofotometricamente. A redução percentual AB foi calculada como:
$$ \% \ mathrm {AB} \ \ mathrm {redução} =\ left [\ left ({\ varepsilon} _ {\ mathrm {ox}} {\ lambda} _2 \ right) \ left (\ mathrm {A} {\ lambda} _1 \ right) - \ left ({\ varejpsilon} _ {\ mathrm {ox}} {\ lambda} _1 \ right) \ left (\ mathrm {A} {\ lambda} _2 \ right) / \ left ({\ varepsilon} _ {\ mathrm {red}} {\ lambda} _1 \ right) \ left ({\ mathrm {A}} ^ {'} {\ lambda} _2 \ right) - \ left ({\ varejpsilon} _ {\ mathrm {red}} {\ lambda} _2 \ right) \ left ({\ mathrm {A}} ^ {'} {\ lambda} _1 \ right) \ right] \ times 100 $$
onde, ελ ₁ =coeficiente de extinção molar de alamar blue a 570 nm e ελ ₂ =o coeficiente de extinção molar de alamar blue a 600 nm, no oxidado ( ε _boi ) e reduzido ( ε _vermelho ) formulários. A λ ₁ e A λ ₂ denotou a absorbância dos poços de teste.

A ’ λ ₁ =absorbância do poço de controle negativo a 570 nm.

A ’ λ ₂ =absorbância do poço de controle negativo a 600 nm.

Ensaio ALP

A produção de fosfatase alcalina (ALP) por hMSC cultivado dentro do andaime foi medida de acordo com o protocolo do fabricante no kit [12]. Resumidamente, PBS estéril (pH 7,4) foi usado na lavagem e incubação de andaimes, seguido por homogeneização com 1 mL de tampão Tris (1 M, pH 8,0) e sonicação por 3 min em gelo. 25 μL do lisado foram então incubados com 1 mL de solução de p-nitrofenil fosfato (16 mM) a 30 ° C por 5 min. Medidas espectrofotométricas foram realizadas em 405 nm para monitorar a produção de p-nitrofenol na presença de ALP.

Atividade ALP in vivo

Nove ratos nus atímicos machos, pesando 100-120 g cada, foram retirados e dissecados bilateralmente nos músculos abdominais para criar bolsas. Um modelo de camundongo nu foi utilizado para demonstrar o potencial osteoindutor da estrutura in vivo. Um de cada três tipos de andaimes (5 mm x 5 mm) foi cortado e embalado nas bolsas musculares separadamente. A bolsa foi então fechada com sutura não absorvível. Após 14 dias de operação, os implantes foram retirados por excisão dos músculos retos abdominais e mantidos em PBS. Retalhos de músculo foram excisados e tecido de explante é obtido que foi homogeneizado em tampão de extração para liberar fosfatase alcalina. 50 μL de uma alíquota de solução foram usados para a medição da atividade de ALP.

Análise estatística

Todos os experimentos foram feitos em triplicata e os dados apresentados são formatados como média ± desvio padrão (DP) das amostras, a menos que mencionado. A análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada usando o software estatístico Origin 6.0, para avaliar diferenças incertas e diferenças significativas. P valor de 0,05 ou menos significa diferenças significativas entre os grupos de estudo.

Resultados

Morfologia do andaime

Imagens SEM (Fig. 1) do andaime fabricado revelaram estrutura nanofibrosa finamente fiada. Os diâmetros médios das fibras em scaffolds SF e SF + BMP2 parecem ser semelhantes, variando de 100 a 900 nm, em todas as concentrações, visto que o diâmetro é uma função do tempo durante o qual a eletrofiação foi realizada [13], enquanto SF nanofibras foram consideradas uniformes e a conjugação de BMP2 levou a não uniformidade no diâmetro da fibra. O tamanho dos poros dos andaimes parece ser homogêneo nos andaimes fabricados e é independente da concentração de fibroína. A concentração de SF não afeta o tamanho dos poros significativamente [11].

Micrografias SEM de suportes preparados. a SF b SF + rhBMP2. c 4SF + rhBMP2

Propriedades mecânicas do andaime

As curvas tensão-deformação de andaimes de nanofibras são representadas na Fig. 2. Foi observado que a adição de BMP não altera as propriedades mecânicas do andaime SF, mas com o aumento na concentração de material de fabricação (SF), a propriedade de tração das matrizes foi melhorada . Pode ser devido à formação de ligações interfibras durante a reticulação. Fibras de SF de baixa concentração, portanto, não exibiram melhor resistência mecânica em comparação com uma superior.

Relação tensão-deformação de nanofibras eletrofiadas. A relação tensão-deformação foi comparada entre (a) SF, (b) SF + rhBMP2 e (c) 4SF + rhBMP2 andaime

Estudo de inchaço

As razões de intumescimento em função do tempo para os andaimes foram representadas na Fig. 3. Os andaimes incharam bem com o tempo de maneira uniforme inicialmente e atingiram o equilíbrio em cerca de 380 min. As fibras ligadas a rhBMP2 absorveram mais água em comparação com os andaimes apenas de SF, sugerindo o aumento de bolsas hidrofílicas devido à associação de BMP2. Fibras SF equilibradas em ∼ 70% enquanto as fibras contendo BMP2 foram equilibradas em ∼ 81% de água.

Propriedade de dilatação do andaime fabricado. Mudanças na propriedade de intumescimento do andaime SF foram observadas após a modificação com SF + rhBMP2 e 4SF + rhBMP2

Ensaio de adesão celular

A adesão das células ao andaime é necessária para o crescimento das células e a indução para a diferenciação. Neste estudo, observamos que hMSCs aderiram bem aos andaimes, e a aderência de hMSC ao andaime 4SF-BMP2, SF-BMP2 e SF foi representada na Fig. 4.

Histograma que representa a adesão percentual versus tempo para três pontos de tempo. Mudanças no nível de adesão em (a) SF, (b) SF + rhBMP2, e (c) 4SF + rhBMP2 andaime

Havia uma preocupação de perda de aderência no andaime blended que foi descartada com os resultados observados. A mistura com BMP2 não diminui a capacidade de aderência do andaime. Como é evidente na Fig. 3, foi bem entendido que com um aumento no tamanho dos poros (diminuição na concentração de SF), a aderência da célula ao andaime aumenta. ANOVA entre as três formulações diferencia significativamente as variações na 3ª e 6ª hora. Porém, não houve diferença significativa observada na 1ª hora.

Ensaio de Citotoxicidade e Proliferação Celular

Cell viability was significantly increased in the rhBMP2-conjugated scaffolds, and the constructed scaffolds do not create any cytotoxic effects to the guest cells in concern (Fig. 4), and cell proliferated well in all the scaffolds comparatively Fig. 5. There was an increasing trend in viability with number of days, and SF+BMP2 scaffold exhibited least toxicity at each time point. ANOVA revealed significant difference among the values of cell viability of three formulations in concern.

Cell viability assay represented as histogram for four time points. The cell viability assay was performed by MTT assay, and the results are presented as percentage relative to control

From Fig. 6, cell proliferation can be examined. Cell proliferated well in all the three scaffold preparations with best in SF+BMP2 each time point. Larger pores in SF + BMP2 scaffold were providing maximum space for growth of cells. The significance of differences among the group was well established from ANOVA.

Representation of cell proliferation as percentage of alamar blue dye reduction at four time points for SF, SF+BMP2, and 4SF+BMP2

ALP Assay

ALP activity is a standard marker of osteoinductive property of the environment around the cell [13]. In our experiment, we observed a higher ALP activity in the SF+BMP2 constructs as compared to SF-only constructs (Fig. 7). SF nanostructured scaffolds were able to exhibit osteoinduction alone as well but as evident from Fig. 7 and ANOVA, SF+BMP2 scaffold proved to be best among the scaffolds in concern. The ALP concentration was increased in due course of time of experiment, and the constructs with higher SF concentration, however, exhibited lower ALP activity in comparison to constructs with lower SF concentration.

Representation of ALP activity among three different scaffold fabrication strategies at different time points. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 scaffold

In vivo ALP Activity

Fig. 8 depicts ALP activity of explants for (a) SF, (b) SF+rhBMP2, and (c) 4SF+rhBMP2. As expected, explants from treatment containing rhBMP2 induced higher ALP activity while rhBMP2-free scaffold-treated mice produced lower ALP activity.

In vivo ALP activity of the explants obtained after treatment. Nude mouse model was utilized to demonstrate the osteoinductive potential of the scaffold in vivo

Discussions

Scaffold-based tissue engineering has proved its potential in regenerative medicine and has witnessed impressive progress as a tool for BTE. Previous studies have established the crucial role of microarchitecture and physical properties of structures in translating in vitro-engineered cell scaffold constructs into bone tissue [14,15,16].

Optimum mechanical properties (pore size, tensile strength, etc.) and biocompatibility of the constructs are potential features to be considered for cell colonization and organization [17]. The presented work describes fabrication and characterization of scaffold for bone tissue engineering utilizing combination of beneficial properties of materials proposed for the same. While SF provides a suitably strong and biocompatible platform, embedded rhBMP2 induces the formation of new osteocytes. SF is being extensively studied by several groups in different formulations for osteoblastic cell proliferation [18] and tissue regeneration including ligament, tendon, cartilage, bone, liver, skin, trachea, cornea, nerve, eardrum, and bladder [19, 20].

We have used aqueous solutions of SF and SF+rBMP2 for our study as aqueous solutions are preferred over organic solvents for preparation of SF solutions as degradation of SF is unfavorable in organic solutions [18]. Electrospun SF fibers were previously reported to have homogenous structure of fibers with uniform diameter, and the mesh is highly porous with interlinked and cross-connected pores which is in close accordance with our study as well [21, 22]. There was no observation of formation of bead-like structures in SF fibers in our scaffolds and the previously reported ones [21]. Diameter of the pure SF fiber was previously reported to lessen with increase in blend [11, 21]; however, we did not observe a loss in diameter due to blending. But uniformity of fiber was disturbed in blended fibers possibly due to uneven association of rBMP2 onto the SF fibers.

Ample mechanical strength is a property essential for a tissue scaffold. Blending of pure SF increased the flexibility of nanofiber in our experiment, and previous reports also revealed a similar trend in improvement of mechanical properties upon blending of SF with other materials to yield employable blended biomaterials [21, 23]. So, our fabricated scaffold possesses essential mechanical strength and flexibility which is required in tissue engineering applications.

Scaffolds for tissue engineering should be able to attach cells over it, should facilitate cell proliferation and osteoinduction and should be least cytotoxic for its better acceptability. Earlier reports on SF scaffolds have established its non-cytotoxic and cell-proliferative activities [21, 24], and our studies were in close accordance with the previously reported results.

Owing to its osteoinductive properties, rhBMP2 is being utilized in bone tissue engineering by several groups [25,26,27]. These studies have revealed that cells cultured over BMP2-containing scaffolds possessed higher ALP activity, a biomarker of osteoinduction. The effect of BMP2 association was better contrasted as the time of incubation progressed. Kim et al. utilized BMP2-associated porous microspheres and observed a similar enhancement in osteoinduction [25].

Conclusions

We successfully fabricated SF-based fibrous scaffolds containing rhBMP2. These scaffolds were homogenous and were found to have adequate mechanical properties and biocompatibility. Further rhBMP2 association attributed to the osteoinductive potential of the fabricated scaffolds. The scaffolds were further evaluated for in vivo applications and found to be suitable for application involving bone tissue engineering.

Abreviações

ALP:: Alkaline phosphatase
BTE:: Bone tissue engineering
hMSCs:: Human mesenchymal stem cells
rhBMP2:: Recombinant human bone morphogenic protein-2
SF:: Silk fibroin

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