Osteoindutividade Melhorada com Andâimes de Fibroína de Seda Carregados com rhBMP-2 para Engenharia de Tecido Ósseo

Resumo

Existe uma demanda crescente por formulações de andâimes de fibroína de seda (SF) em aplicações biomédicas. A SF foi reticulada via glutaraldeído com a proteína morfogenética óssea recombinante humana-2 (rhBMP-2) osteoindutiva em diferentes proporções: (i) 3% SF sem rhBMP-2 (SF), (ii) 3% SF com quantidade igual de rhBMP-2 (SF+BMP2), e (iii) 12% SF com 3% de rhBMP-2 (4SF+BMP2). Estas soluções foram utilizadas na fabricação de nanoandâimes baseada em eletrofiação para avaliar o potencial osteoindutivo aumentado dos andâimes de SF com rhBMP-2. A relação tensão-deformação sugeriu que não há perda de resistência mecânica das fibras com a adição de rhBMP-2, e a resistência mecânica do andâime melhorou com o aumento da concentração de SF. A associação com rhBMP-2 aumentou a capacidade de retenção de água do andâime, conforme evidenciado por estudos de inchamento. A viabilidade de células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) foi maior nos andâimes conjugados, e os andâimes não exibiram citotoxicidade para as células hospedeiras. As células apresentaram maior atividade de fosfatase alcalina nos andâimes conjugados, tanto em condições in vitro quanto in vivo, o que estabelece a osteoindutividade aumentada do novo constructo. Os andâimes também se mostraram eficazes para formação óssea in vivo.

Introdução

A capacidade regenerativa do osso permite a reparação de pequenas fraturas por si só. O osso é formado, seguido pela união e, finalmente, pela reconstrução da forma original. No entanto, esta capacidade é limitada, criando a necessidade de autoenxertos ou alogenxertos para tratamento. O alogenxerto envolve obtenção de osso de um doador separado, o que pode causar reação imunológica. O autoenxerto, onde o osso é obtido do próprio paciente, não cria problemas imunológicos, mas é limitado pela quantidade suficiente de osso disponível.

A engenharia de tecidos é percebida como uma tecnologia potencial para superar as limitações imunológicas do alogenxerto e autoenxerto. Com a engenharia de tecidos, células especializadas como células-tronco mesenquimais humanas ou células de osteossarcoma (MG63) são cultivadas sob um ambiente adequado sobre um andâime pré-fabricado, e este sistema de células e andâime é então usado como enxerto.

O andâime fornece ancoragem e nicho bioquímico para sobrevivência e proliferação celular. Várias propriedades — resistência mecânica, osteoindução, biorreabsorção, porosidade graduada e biocompatibilidade — devem ser consideradas na seleção do material para fabricação do andâime. A osteoindução (indução da formação óssea) é uma das propriedades requeridas do material para fabricação de andâimes de engenharia de tecido ósseo (BTE). Andâimes com fatores osteogênicos são potentes para imitar o processo de regeneração de tecido ósseo, que acopla angiogênese e osteogênese, podendo recrutar células progenitoras e sua diferenciação. As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são uma classe de fatores de crescimento que induzem formação óssea e são propostas para aplicações em BTE junto com matriz óssea desmineralizada (DBM) e fosfato de cálcio.

Diversos grupos relataram o uso de metais, cerâmicas, polímeros sintéticos e compósitos, e fibroína de seda como materiais potenciais para fabricação de andâimes em BTE. A fibroína de seda (SF) tem sido relatada como material adequado para fabricação de andâimes para aplicações em engenharia de tecidos, devido às suas notáveis propriedades mecânicas e biocompatíveis. Até o momento, nenhum relatório foi publicado avaliando os benefícios associativos de BMPs com nanoandâimes eletrofiados de SF.

Aqui, relatamos a fabricação de novos nanoandâimes fibrosos eletrofiados de fibroína de seda conjugados com proteína morfogenética óssea recombinante humana-2 (rhBMP-2). Os andâimes foram comparados com os de SF pura para elucidar o efeito da conjugação com rhBMP-2 na osteoindução. Propriedades de viabilidade e proliferação celular também foram medidas para estabelecer a potência do andâime para novas e melhores aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Métodos

Preparação de Soluções Aquosas de SF/BMP2

Inicialmente, a SF foi isolada dos casulos do bicho-da-seda Bombyx mori como solução aquosa. O protocolo estabelecido foi seguido com pequenas modificações. Os casulos foram fervidos em 100 mL de Na₂CO₃ 0,02 M por 20 min e então enxaguados abundantemente com água destilada para remover sericina solúvel em água e cera em excesso. A fibroína extraída foi então dissolvida em solução de brometo de lítio 9 M a 60 °C por 4 h e dialisada contra água por 4 dias. A concentração final foi determinada pela pesagem da matéria seca após secagem, sendo 7% p/v. Esta solução foi então concentrada a diferentes níveis por diálise contra 1 L de solução de polietilenoglicol (PEG, 10.000 g mol⁻¹) a 25% em temperatura ambiente. Soluções aquosas diluídas de SF foram preparadas por diluição com água destilada, e todas as soluções foram armazenadas a 10 °C até processamento posterior. O pó liofilizado de rhBMP-2 foi dissolvido em PBS (pH 3,8). A solução proteica foi esterilizada com filtros de seringa de 0,22 µm e adicionada como solução aquosa a cada solução de fibroína com agitação contínua. A reticulação mediada por glutaraldeído foi empregada para associar BMP com fibroína. Brevemente, para 10 mL de mistura de reação, 5 mL cada de 6% fibroína de seda e 1% rhBMP-2 foram reticulados usando 200 µL de glutaraldeído e 40 µL de HCl 12 N como agente ativador de grupo. Com este procedimento, três soluções foram preparadas: (i) 3% fibroína de seda sem rhBMP-2 (SF), (ii) 3% fibroína de seda com 0,5% de rhBMP-2 (SF+rhBMP2), e (iii) 12% fibroína de seda com 0,125% de rhBMP-2 como em (ii) (4SF+rhBMP2). Estas soluções foram usadas nos procedimentos de eletrofiação para fabricação do andâime.

Fabricação do Andâime por Eletrofiação

Para fabricação do andâime, cada solução foi carregada em uma seringa de vidro de 5 mL com agulha de aço inoxidável (25G, DI 0,26 mm, Sigma Aldrich) conectada a uma fonte DC de 5,5 kV. Para preparação das fibras, a vazão de saída foi mantida em 0,4 mL h⁻¹ usando uma bomba de seringa, e as fibras eletrofiadas foram coletadas em papel alumínio mantido a 15 cm da ponta do capilar. As amostras foram coletadas por 4 h cada.

Microscopia Eletrônica de Varredura

Para exame morfológico dos andâimes preparados, MEV foi realizada usando Zeiss EVO40SEM. As amostras foram metalizadas com ouro antes da digitalização, e as imagens foram processadas. A determinação do diâmetro das fibras foi feita pela média dos diâmetros de 10 fibras aleatórias no enquadramento da imagem.

Propriedades Mecânicas do Andâime

Experimentos compressivos foram realizados para avaliar as propriedades mecânicas dos andâimes desenvolvidos usando testador eletromecânico de coluna única Instron (modelo 3345, Instron, Canton, MA). Fibras com 0,2 mm de diâmetro, obtidas por eletrofiação em durações maiores, foram usadas para determinar resistência à tração e alongamento na ruptura a partir das curvas tensão-deformação a 25 °C e 50% de umidade.

Estudo de Inchamento

Para medição da razão de inchamento, cada formulação foi dissolvida em PBS (pH 7,4) a 37 °C. As amostras foram retiradas em intervalos de tempo pré-determinados, e o peso seco foi medido usando balança eletrônica. O teste continuou até que o peso de equilíbrio fosse atingido. A razão de inchamento foi expressa como:

Razão de inchamento (%) = (Wₛ - W₀) / W₀

onde W₀ = peso seco inicial das matrizes nanofibrosas e Wₛ = peso das matrizes nanofibrosas inchadas em cada ponto de tempo.

Cultura Celular

Células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) foram usadas para avaliar o potencial osteoindutivo dos nanoandâimes fabricados. As hMSCs foram cultivadas e mantidas em DMEM com 10% soro fetal bovino e 1% penicilina, a 37 °C em atmosfera umificada com 5% CO₂ até atingir 90% de confluência. As células foram então tripsinizadas, centrifugadas e ressuspensas no meio para quantificação.

Os andâimes foram esterilizados por lavagem com etanol e irradiação com luz UV por 30 min, e lavados com PBS (pH 7,4) posteriormente. Um tratamento com DMEM foi dado aos andâimes antes da semeadura celular. 20 µL de suspensão celular foi adicionado gota a gota a cada andâime e filme plástico servindo como controle. Os andâimes foram mantidos em repouso em atmosfera umificada (37 °C, 5% CO₂) por 30 min. Então, os andâimes foram incubados em DMEM por 21 dias com reposição regular do meio a cada dois dias.

Ensaio de Adesão Celular

Para avaliar a capacidade de adesão das células ao andâime, o número de células não aderidas foi contado após 1, 3 e 6 h da semeadura inicial conforme método na literatura com pequenas modificações. O meio celular foi coletado e a contagem celular feita com hemocitômetro. A diferença entre a contagem de semeadura inicial e o número de células não aderidas foi considerado como o número de células aderidas. Os resultados foram expressos em percentual de adesão:

% Adesão = (Semeadura inicial - Número de células não aderentes) / Semeadura inicial × 100

Ensaio de Citotoxicidade

Para medir o efeito tóxico das matrizes nanofibrosas, o ensaio MTT foi realizado. Após o respectivo período, os constructos foram incubados em solução MTT (1 mg mL⁻¹ solução estoque diluída em PBS pH 7,4 na razão 1:10) e incubados por 4 h. Células viáveis convertem MTT em sal de formazan durante este período. O sal de formazan foi dissolvido pela adição de DMSO e mantido por 20 min. A absorbância originada do sal de formazan foi medida quantitativamente registrando mudanças na absorbância a 570 nm usando leitor de microplacas.

Ensaio de Proliferação Celular

O ensaio de redução do corante Alamar Blue (AB) foi realizado para determinar a proliferação de células dentro do andâime. Os andâimes foram incubados no corante diluído com DMEM por 4 h, e a redução do corante foi medida espectrofotometricamente. A redução percentual de AB foi calculada conforme fórmula padrão utilizando coeficientes de extinção molar nas formas oxidada e reduzida a 570 nm e 600 nm.

Ensaio ALP

A produção de fosfatase alcalina (ALP) por hMSCs cultivadas dentro do andâime foi medida conforme protocolo do fabricante no kit. Brevemente, PBS estéril (pH 7,4) foi usado na lavagem e incubação dos andâimes, seguido por homogeneização com 1 mL de tampão Tris (1 M, pH 8,0) e sonicação por 3 min em gelo. 25 µL do lisado foi então incubado com 1 mL de solução de p-nitrofenil fosfato (16 mM) a 30 °C por 5 min. Medidas espectrofotométricas foram realizadas a 405 nm para monitorar a produção de p-nitrofenol na presença de ALP.

Atividade ALP In Vivo

Nove ratos nú masculinos atímicos, pesando 100–120 g cada, foram dissecados bilateralmente nos músculos abdominais para criar bolsas. Um modelo de camundongo nú foi utilizado para demonstrar o potencial osteoindutivo do andâime in vivo. Um de cada um dos três tipos de andâimes (5 mm × 5 mm) foi cortado e acondicionado nas bolsas musculares separadamente. A bolsa foi fechada com sutura não absorvível. Após 14 dias da operação, os implantes foram recuperados por excisão dos músculos reto abdominais e mantidos em PBS. Retalhos musculares foram excisados, e o tecido de explante obtido foi homogeneizado em tampão de extração para liberar fosfatase alcalina. 50 µL de alíquota da solução foi usado para medição da atividade ALP.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) das amostras, salvo menção contrária. Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi realizada usando software estatístico Origin 6.0 para avaliar diferenças incertas e significativas. Valor P de 0,05 ou menos significa diferenças significativas entre os grupos de estudo.

Resultados

Morfologia do Andâime

Imagens de MEV dos andâimes fabricados revelaram estrutura nanofibrosa finamente fiada. Os diâmetros médios das fibras nos andâimes SF e SF+BMP2 parecem similares, variando de 100 a 900 nm em todas as concentrações, pois o diâmetro é função do tempo de eletrofiação, enquanto as nanofibras de SF foram uniformes, e a conjugação com BMP2 levou a não-uniformidade no diâmetro das fibras. O tamanho dos poros dos andâimes parece homogêneo nos andâimes fabricados e independente da concentração de fibroína. A concentração de SF não afeta significativamente o tamanho dos poros.

Propriedades Mecânicas do Andâime

Curvas tensão-deformação dos andâimes nanofibrosos mostram que a adição de BMP não altera as propriedades mecânicas do andâime de SF, mas com o aumento da concentração do material de fabricação (SF), a propriedade de tração das matrizes melhorou. Isso pode ser devido à formação de ligações interfibras durante a reticulação. Fibras de SF de baixa concentração não exibiram melhor resistência mecânica comparadas às de maior concentração.

Estudo de Inchamento

As razões de inchamento em função do tempo para os andâimes mostram que os andâimes incham bem com o tempo uniformemente inicialmente e atingem equilíbrio em torno de 380 min. Fibras ligadas a rhBMP-2 absorveram mais água comparadas aos andâimes apenas de SF, sugerindo aumento de bolsões hidrofílicos devido à associação com BMP2. Fibras de SF equilibraram a ~70% enquanto fibras contendo BMP2 equilibraram a ~81% de água.

Ensaio de Adesão Celular

A adesão das células ao andâime é requerida para crescimento celular e indução à diferenciação. Neste estudo, observou-se que hMSCs aderiram bem aos andâimes, e a adesão de hMSC aos andâimes 4SF-BMP2, SF-BMP2 e SF foi representada. Houve preocupação de perda de adesão no andâime misto, que foi descartada com os resultados observados. A mistura com BMP2 não diminui a capacidade de adesão do andâime. Com o aumento do tamanho dos poros (diminuição da concentração de SF), a adesão celular ao andâime aumenta. ANOVA entre as três formulações diferencia significativamente variações na 3ª e 6ª hora, sem diferença significativa na 1ª hora.

Ensaio de Citotoxicidade e Proliferação Celular

A viabilidade celular foi significativamente aumentada nos andâimes conjugados com rhBMP-2, e os andâimes construídos não criam efeitos citotóxicos às células hospedeiras, e as células proliferaram bem em todos os andâimes comparativamente. Houve tendência crescente de viabilidade com o número de dias, e o andâime SF+BMP2 exibiu menor toxicidade em cada ponto de tempo. ANOVA revelou diferença significativa entre os valores de viabilidade celular das três formulações.

A proliferação celular pode ser examinada: as células proliferaram bem nas três preparações de andâime, com melhor desempenho no SF+BMP2 em cada ponto de tempo. Poros maiores no andâime SF+BMP2 proporcionaram máximo espaço para crescimento celular. A significância das diferenças entre os grupos foi bem estabelecida pela ANOVA.

Ensaio ALP

A atividade de ALP é um marcador padrão da propriedade osteoindutiva do ambiente ao redor da célula. No experimento, observou-se maior atividade ALP nos constructos SF+BMP2 comparados aos constructos apenas SF. Nanoandâimes estruturados de SF foram capazes de exibir osteoindução sozinhos, mas o andâime SF+BMP2 provou ser o melhor entre os andâimes. A concentração de ALP aumentou no decorrer do tempo do experimento, e os constructos com maior concentração de SF exibiram menor atividade ALP em comparação aos constructos com menor concentração de SF.

Atividade ALP In Vivo

Os explantes do tratamento contendo rhBMP-2 induziram maior atividade ALP enquanto andâimes sem rhBMP-2 produziram menor atividade ALP, confirmando o potencial osteoindutivo in vivo.

Discussão

A engenharia de tecidos baseada em andâimes provou seu potencial em medicina regenerativa e testemunhou progresso impressionante como ferramenta para BTE. Estudos prévios estabeleceram o papel crucial da microarquitetura e propriedades físicas das estruturas na tradução de constructos célula-andâime engenhados in vitro em tecido ósseo.

Propriedades mecânicas ótimas (tamanho de poro, resistência à tração, etc.) e biocompatibilidade dos constructos são características potenciais a serem consideradas para colonização e organização celular. O trabalho apresentado descreve fabricação e caracterização de andâime para engenharia de tecido ósseo utilizando combinação de propriedades benéficas de materiais propostos. Enquanto a SF fornece plataforma adequadamente forte e biocompatível, o rhBMP-2 incorporado induz formação de novos osteócitos. A SF é extensivamente estudada por vários grupos em diferentes formulações para proliferação de células osteoblásticas e regeneração tecidual incluindo ligamento, tendão, cartilagem, osso, fígado, pele, traqueia, córnea, nervo, tímpano e bexiga.

Soluções aquosas de SF e SF+rBMP2 foram usadas pois soluções aquosas são preferidas sobre solventes orgânicos para preparação de soluções de SF, já que a degradação de SF é desfavorável em soluções orgânicas. Fibras de SF eletrofiadas foram previamente relatadas com estrutura homogênea de fibras com diâmetro uniforme, e a malha é altamente porosa com poros interligados e cruzados, em estreita concordância com nosso estudo. Não houve observação de formação de estruturas tipo conta em fibras de SF em nossos andâimes e nos previamente relatados. Diâmetro de fibra de SF pura foi previamente relatado como diminuindo com aumento da mistura; porém, não observamos perda de diâmetro devido à mistura. Mas a uniformidade da fibra foi perturbada em fibras misturadas possivelmente devido à associação irregular de rBMP2 nas fibras de SF.

Resistência mecânica ampla é propriedade essencial para andâime de tecido. Mistura de SF pura aumentou a flexibilidade de nanofibra em nosso experimento, e relatórios prévios também revelaram tendência similar na melhoria de propriedades mecânicas na mistura de SF com outros materiais para produzir biomateriais mistos empregáveis. Portanto, nosso andâime fabricado possui resistência mecânica e flexibilidade essenciais requeridas em aplicações de engenharia de tecidos.

Andâimes para engenharia de tecidos devem ser capazes de fixar células, facilitar proliferação celular e osteoindução, e ser minimamente citotóxicos para melhor aceitabilidade. Relatórios anteriores sobre andâimes de SF estabeleceram suas atividades não citotóxicas e proliferativas, e nossos estudos estiveram em estreita concordância com resultados prévios.

Devido às suas propriedades osteoindutivas, rhBMP-2 é utilizado em engenharia de tecido ósseo por vários grupos. Estes estudos revelaram que células cultivadas sobre andâimes contendo BMP2 possuíam maior atividade ALP, biomarcador de osteoindução. O efeito da associação com BMP2 foi melhor contrastado conforme o tempo de incubação progrediu.

Conclusões

Fabricamos com sucesso andâimes fibrosos baseados em SF contendo rhBMP-2. Estes andâimes foram homogêneos e apresentaram propriedades mecânicas adequadas e biocompatibilidade. Além disso, a associação com rhBMP-2 atribuiu potencial osteoindutivo aos andâimes fabricados. Os andâimes foram avaliados para aplicações in vivo e mostraram-se adequados para aplicações envolvendo engenharia de tecido ósseo.

Abreviações

ALP:

Fosfatase alcalina

BTE:

Engenharia de tecido ósseo

hMSCs:

Células-tronco mesenquimais humanas

rhBMP2:

Proteína morfogenética óssea recombinante humana-2

SF:

Fibroína de seda