Transportadores de lipídios nanoestruturados híbridos liofilizados para aumentar a absorção celular de verapamil:otimização estatística e avaliação in vitro

Resumo

O verapamil é um bloqueador dos canais de cálcio altamente eficaz no tratamento da hipertensão, angina de peito e outras doenças. No entanto, o medicamento tem uma baixa biodisponibilidade de 20 a 35% devido ao efeito de primeira passagem. O objetivo principal deste estudo foi desenvolver portadores de lipídios nanoestruturados de verapamil-dextrana híbridos (HVD-NLCs) em uma tentativa de aumentar a captação celular de verapamil. As formulações foram preparadas com sucesso por um método de homogeneização de alto cisalhamento e otimizadas estatisticamente usando 2 ⁴ planejamento fatorial completo. As formulações de HVD-NLCs foram liofilizadas usando trealose como crioprotetor. Os resultados mostraram que a fórmula otimizada (VER-9) possuía um tamanho de partícula (PS), índice de polidispersidade (PDI) e a porcentagem de eficiência de aprisionamento (% EE) de 192,29 ± 2,98, 0,553 ± 0,075 e 93,26 ± 2,66% , respectivamente. A incorporação de sulfato de dextrana na formulação prolongou a liberação de verapamil (~ 85% em 48 h) no fluido gástrico simulado (pH 1,2) e fluido intestinal simulado (pH 6,8). A análise de calorimetria exploratória diferencial não mostrou interação química entre o verapamil e os excipientes da formulação. Enquanto os estudos de espalhamento de raios-X de grande angular demonstraram o fármaco na forma amorfa após a incorporação nos NLCs. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura revelaram que as nanopartículas tinham formato esférico. O estudo de captação celular usando a linha celular Caco-2 mostrou uma maior captação de verapamil de HVD-NLCs em comparação com solução de verapamil e complexo verapamil-dextrano. A formulação otimizada (VER-9) armazenada sob refrigeração (5 ° C ± 3 ° C) manteve-se estável por 6 meses. Em conclusão, os HVD-NLCs eram portadores potenciais do verapamil, pois aumentavam significativamente a absorção celular da droga.

Histórico

O verapamil é um agente bloqueador dos canais de cálcio do tipo L da classe das fenilalquilaminas e um antagonista do receptor α-adrenérgico. É amplamente utilizado no tratamento da hipertensão, taquiarritmia supraventricular, angina de peito e cefaleias em salvas. De acordo com o sistema de classificação biofarmacêutica, o verapamil é classificado como medicamento de classe I. Os medicamentos desta classe são conhecidos por terem boa absorção pela membrana intestinal (≤ 90%) após a administração oral. No entanto, apenas 20 a 35% da dose oral de verapamil é passada para a circulação sanguínea devido ao rápido metabolismo de primeira passagem através da circulação portal [1]. Portanto, é importante desenvolver transportadores adequados que possam aumentar a absorção celular de verapamil e, possivelmente, melhorar sua biodisponibilidade.

A segunda geração, nanoformulações baseadas em lipídios, como carreadores de lipídios nanoestruturados (NLCs), exibiram um grande potencial para uso na entrega de agentes terapêuticos [2, 3]. Os NLCs apresentam maior estabilidade química e física em comparação às nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs), além de possuir propriedades de liberação controlada. Além disso, os NLCs exibem alta capacidade de carregamento para moléculas de fármaco, formando uma rede cristalina menos ordenada de matriz lipídica, que poderia minimizar a expulsão do fármaco durante o armazenamento. Os NLCs são preparados a partir de lipídios, que aceleram a formação de quilomícrons dentro do intestino e facilitam a absorção dos NLCs que podem aumentar a biodisponibilidade das drogas [4]. Portanto, o presente estudo desenvolveu carreadores lipídicos híbridos de verapamil-dextrana nanoestruturados (HVD-NLCs) para melhorar a captação celular do fármaco, o que pode levar ao aumento de sua biodisponibilidade.

A maioria das drogas lipofílicas pode ser facilmente incorporada aos NLCs, mas é muito difícil aprisionar drogas hidrofílicas como o verapamil em uma nanoformulação à base de lipídios. Assim, no presente estudo, NLCs híbridos usando um contra-íon de dextran sulfato de sódio foram preparados para aumentar a encapsulação de verapamil e prolongar sua liberação dos NLCs (Fig. 1). As formulações de HVD-NLCs foram preparadas pelo método de homogeneização a quente e de alto cisalhamento e otimizadas estatisticamente usando um 2 ⁴ planejamento fatorial completo. Dois tipos de lipídios foram utilizados no estudo, o lipídio sólido Compritol 888 ATO® e o lipídio ácido oleico líquido. Os HVD-NLCs preparados foram caracterizados por seu tamanho de partícula (PS), potencial zeta (ZP), índice de polidispersidade (PDI) e a porcentagem de eficiência de aprisionamento de fármaco (% EE). Os HVD-NLCs otimizados foram liofilizados usando trealose como crioprotetor. Os perfis de liberação in vitro foram conduzidos em ambientes alcalinos e ácidos. O estudo de captação celular in vitro de verapamil a partir dos HVD-NLCs selecionados foi realizado usando linhas de células Caco-2. O estudo de estabilidade da formulação otimizada foi conduzido por 6 meses em três condições diferentes (5 ° C ± 3 ° C, 25 ° C ± 2 ° C / 60% UR ± 5% UR e 40 ° C ± 2 ° C / 75% UR ± 5% UR).

Formação de complexo eletrostático de cloridrato de verapamil, droga catiônica solúvel em água e polímero de contra-íon sulfato de dextrana de sódio

Métodos

Material

O verapamil HCl foi adquirido da fábrica farmacêutica de Wenzhou (Wenzhou, China). Compritol 888 ATO® (Dibehenato de glicerol EP – Behenato de glicerila NF) foi obtido da Gattefosse (Saint-Priest, França). O ácido oleico foi adquirido da R&M Chemical (Essex, Reino Unido). Tween 80® (Polissorbato 80) foi adquirido na Euro chemo-pharma Sdn. Bhd. (Penang, Malásia). O Poloxamer 188 (Pluronic® F-68) foi adquirido na Molekula (Dorset, Reino Unido). Trehalose, Sephadex® G-25 e soro fetal bovino (FBS) foram obtidos na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A linha celular Caco-2 foi obtida da ATCC (Virginia, EUA). A solução de penicilina-estreptomicina 100 X foi obtida na Biowest (Nuaillé, França). A tripsina 0,25% e o meio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) foram adquiridos da GE Healthcare Life Science, Hyclone laboratories (Utah, EUA). O Passive Lysis Buffer, 5X foi adquirido na Promega (Wisconsin, EUA).

Métodos

Preparação de HVD-NLCs

Os HVD-NLCs foram preparados pelo método de homogeneização de alto cisalhamento a quente. A fase lipídica consistia em Compritol ATO 888® e o ácido oleico foi fundido por aquecimento a 85 ° C (10 ° C acima do ponto de fusão do lípido sólido). A quantidade necessária de verapamil foi pesada e dissolvida na fase aquosa contendo uma mistura de Tween 80® e poloxamer 188 em uma proporção de 1:1 w / w . A fase aquosa foi aquecida à mesma temperatura da fase lipídica. A fase aquosa foi vertida na fase lipídica e homogeneizada usando um homogeneizador digital T25 Ultra-Turrax®, IKA® (Staufen, Alemanha) a 24.000 rpm, 85 ° C. Posteriormente, a solução aquosa de sulfato de dextrana (proporção de 1:1 para verapamil) foi adicionada lentamente à mistura durante o processo de homogeneização. Os HVD-NLCs preparados foram deixados a arrefecer à temperatura ambiente (25 ± 2 ° C).

Otimização estatística dos parâmetros de formulação usando 2 ⁴ Projeto Fatorial Completo e Abordagens da Função de Desejabilidade

Um planejamento fatorial completo com dois níveis e quatro variáveis foi realizado para otimizar e avaliar o efeito da formulação das variáveis independentes (fatores) sobre as características (variáveis dependentes ou respostas) (Tabela 1). Os verdadeiros níveis alto e baixo para cada variável independente foram selecionados com base nos estudos preliminares.

As respostas experimentais obtidas a partir das variáveis dependentes foram os resultados dos efeitos individuais e combinados das quatro variáveis independentes. Este projeto experimental de dois níveis fornece dados suficientes para ajustar a seguinte equação polinomial.
$$ X ={\ upbeta} _0 + {\ upbeta} _1A + {\ upbeta} _2B + {\ upbeta} _3C + \ upbeta 4D + {\ upbeta} _ {12} AB + {\ upbeta} _ {13} \ mathrm {AC} + {\ upbeta} _ {14} \ \ mathrm {AD} + {\ upbeta} _ {23} \ mathrm {BC} + {\ upbeta} _ {24} \ mathrm {BD} + {\ upbeta} _ {34 } \ mathrm {CD} $$ (1)
Onde X é uma variável dependente; β ₀ é uma interceptação; β ₁ , β ₂ , β ₃ , e β ₄ são os coeficientes das variáveis independentes A , B , C e D respectivamente. Enquanto β ₁₂ , β ₁₃ , β ₁₄ , β ₂₃ , β ₂₄ , e β ₃₄ são as respectivas interações (isto é, AB, AC, AD, BC, BD e CD). Os resultados experimentais foram analisados por um software Design-Expert® versão 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, EUA) seguido de análise de variância (ANOVA) para determinar a significância dos fatores e suas interações. A análise estatística foi considerada significativa quando o p os valores foram <0,05.

As formulações finais foram selecionadas com base na abordagem da função de desejabilidade. A função de desejabilidade combina todas as respostas em uma variável para prever os níveis ótimos dos fatores estudados. Portanto, a conveniência foi determinada para selecionar as formulações otimizadas com o menor tamanho de partícula (PS) e índice de polidispersidade (PDI) e o maior potencial zeta (ZP) e valores de eficiência de aprisionamento percentual (% EE). A função de desejabilidade converte todas as respostas em uma escala comum (0, 1) e as combina por meio geométrico para a otimização da métrica geral. O valor de desejabilidade 1 denota um valor aceitável (valor mais desejado) para as respostas, enquanto o valor de desejabilidade 0 indica um valor inaceitável.

Medições de tamanho de partícula, índice de polidispersidade e potencial zeta

O PS e PDI das nanopartículas preparadas foram medidos usando um espectrômetro de correlação de fótons (Zetasizer 1000HS / 3000HS, Malvern Instrument, Malvern, UK). O ZP foi determinado usando um analisador de potencial zeta (Zetasizer nano series, Nano Z-red badge, Malvern Instrument, Malvern, UK). Todas as amostras foram diluídas com água destilada filtrada (filtro de nylon de 0,45 μm) e as medidas foram feitas em triplicata.

Determinação da porcentagem de eficiência de aprisionamento

A amostra preparada contendo complexo verapamil-dextrano livre e HVD-NLCs foram separados pelo método de centrifugação em mini-coluna usando Sephadex® G25. Um volume de 1 mL da amostra foi colocado no topo da coluna e, em seguida, centrifugado por 2 min a 2.000 rpm. O eluente que continha HVD-NLCs foi recolhido e liofilizado utilizando um liofilizador (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Kansas City, EUA).

Os HVD-NLCs liofilizados (10 mg) foram dissolvidos em clorofórmio e evaporados sob azoto gasoso a 40 ° C. A amostra seca foi então dissolvida em 1 mL de água destilada, agitada em vórtex por 2 min e centrifugada (Eppendorf, Alemanha) a 12.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi coletado e a quantidade de verapamil foi determinada usando um método validado de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O% EE foi calculado usando a seguinte equação:
$$ \% \ mathrm {EE} =\ frac {\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {encapsulado} \ \ mathrm {verapamil}} {\ mathrm {Inicial} \ \ mathrm {peso} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {verapamil}} \ kern0.5em \ times \ kern0.75em 100 $$ (2)
A análise por HPLC para quantificação de verapamil foi realizada usando o sistema cromatográfico Shimadzu equipado com bomba de entrega LC 20AD (Kyoto, Japão) e coluna Phenomenex C18 (250 × 4,6 mm). A fase móvel consistia em acetato de amônio 20 mM e acetonitrila na proporção de 40:60 ( v / v ) O pH da fase móvel foi ajustado para pH 6,5 com ácido acético glacial. O volume de injeção foi de 20 μL e o comprimento de onda de detecção do verapamil foi fixado em 278 nm e a taxa de fluxo foi fixada em 1,5 mL / min.

Estudo de liofilização

A liofilização foi feita a -40 ° C por 24 h usando um Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Kansas City, EUA). Cinco tipos de açúcares comumente usados, incluindo manitol, frutose, sacarose, lactose e trealose na proporção lípido:crioprotetor de 1:1 foram selecionados, a fim de selecionar um crioprotetor adequado para a liofilização dos HVD-NLCs. O crioprotetor que produziu PS e PDI médios mais baixos da formulação liofilizada após reconstituição em água destilada foi selecionado para estudo posterior.

No próximo estudo, a formulação de HVD-NLCs foi misturada com o crioprotetor selecionado usando dois métodos. No primeiro método, o crioprotetor foi adicionado após a preparação da formulação de HVD-NLCs e foi denominado como "após o processo de homogeneização". Enquanto no segundo método, o crioprotetor foi adicionado durante a preparação da formulação de HVD-NLCs e foi denominado como "durante o processo de homogeneização". No primeiro método, vários lipídios e proporções crioprotetoras de 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 e 1:8 foram preparados e liofilizados. As formulações de HVD-NLCs liofilizadas foram redispersas na água destilada filtrada (filtro de nylon de 0,45 μm) e as amostras foram avaliadas quanto ao PS médio, PDI e% EE. As proporções lipídio:crioprotetor que produziram o menor PS e PDI e o maior% EE foram selecionadas para estudos adicionais no segundo método de mistura.

Estudo de liberação in vitro

O estudo de liberação in vitro de verapamil de NLCs foi realizado usando uma bolsa de diálise colocada em um fluido intestinal simulado (pH 6,8) ou fluido gástrico simulado (pH 1,2). Neste estudo, 2 mL de dispersão de HVD-NLCs foram colocados na bolsa de diálise (corte de 12.000 Da MW). A bolsa foi lacrada e então imersa em 150 mL de meio de liberação pré-aquecido. O estudo de liberação foi realizado em um agitador magnético de placa quente ajustado para velocidade de agitação de 100 rpm e 37 ° C. Em intervalos de tempo programados de 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 e 72 h, 1 mL da amostra foi retirado e substituído pelo mesmo volume de meio fresco. A concentração de verapamil liberado foi determinada por HPLC.

Calorimetria de varredura diferencial

A análise de calorimetria de varredura diferencial (DSC) foi realizada usando um DSC Perkin-Elmer Pyris 6 (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido). As amostras foram pesadas (5–7 mg) em uma bandeja de alumínio e seladas usando uma prensa crimpadora de bandeja de amostra padrão (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido). As curvas de DSC foram registradas na taxa de 10 ° C / min de 0 a 260 ° C.

Dispersão de raios-X de grande angular

A análise θ / 2θ de espalhamento de raios-X de ângulo amplo (WAXS) foi realizada à temperatura ambiente usando um PANalytical X’Pert PRO MRD PW3040 (Almelo, Holanda) aplicando radiação Cu Kα. As amostras foram executadas na faixa de temperatura de 2–60 ° C com uma taxa de varredura de 5 ° C / min.

Microscópio Eletrônico de Transmissão e Microscópio Eletrônico de Varredura

A morfologia (isto é, forma e tamanho) de HVD-NLCs foi observada por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) usando (Philips CM12, Eindhoven, Holanda). Uma gota de dispersão de HVD-NLCs diluída foi colocada em uma grade de cobre de 400 mesh seguida por uma coloração negativa com 2% de ácido fosfotúngstico. A amostra preparada foi seca ao ar antes do exame TEM.

A morfologia de HVD-NLCs liofilizados foi observada usando um microscópio eletrônico de varredura (SEM) (Leo Supra 50 VP field Emission SEM, Oberkochen, Alemanha). A amostra de HVD-NLCs liofilizada foi fixada em um stub de alumínio, em seguida, revestido com ouro (10 nm de espessura) em um dispositivo de pulverização catódica a 15 mA por 15 min. A amostra foi visualizada usando um sistema de microanálise de energia dispersiva de raios-X Oxford INCA com tensão de aceleração de 10 kV.

Captação celular de HVD-NLCs

O estudo de absorção celular in vitro de verapamil da formulação de HVD-NLCs foi investigado usando uma linha de células Caco-2. As células foram cultivadas em meio de crescimento DMEM suplementado com solução de penicilina-estreptomicina a 1% e FBS a 10% em frasco de cultura de tecido T-25. Em seguida, as células Caco-2 foram coletadas e semeadas em placas de 48 poços, a 60.000 células de densidade por poço com meio DMEM completo até que as células se tornassem confluentes e formassem uma monocamada no fundo da placa de poços. Várias soluções contendo a mesma concentração de verapamil foram preparadas diluindo HVD-NLCs, solução de verapamil e complexo verapamil-dextrano apenas com meio DMEM. Solução de verapamil e complexo verapamil-dextran foram usados como controles. Posteriormente, os meios completos DMEM da monocamada de células Caco-2 em placas de 48 poços foram trocados por diferentes diluições de HVD-NLCs, solução de verapamil e complexo verapamil-dextrano e incubados a 37 ° C por 6 h. Após completar o período de incubação, os HVD-NLCs, a solução de verapamil e as amostras do complexo verapamil-dextrano foram removidos dos poços. O resíduo das amostras de teste e células mortas foram removidos das monocamadas por lavagem três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células da monocamada foram lisadas pela adição de tampão de lise passivo (200 μL) a cada poço de amostra. As amostras foram pipetadas e centrifugadas a 12.000 rpm por 10 min para extrair o verapamil das células. Os sobrenadantes foram coletados e a concentração de verapamil foi quantificada por HPLC.

Estudo de estabilidade de curto prazo

O estudo de estabilidade de curto prazo da formulação otimizada de HVD-NLCs foi realizado de acordo com o conselho internacional para harmonização de requisitos técnicos para produtos farmacêuticos para humanos (ICH), diretrizes Q1A (R2). A formulação HVD-NLCs liofilizada recentemente preparada (VER-9) foi colocada em três condições diferentes (5 ± 3 ° C, 25 ± 2 ° C / 60 ± 5% de umidade relativa (UR) e 40 ± 2 ° C / 75 ± 5% UR) por 6 meses. A estabilidade da formulação otimizada de HVD-NLCs foi examinada medindo PS, PDI, ZP e o teor total de droga em 0, 1, 3 e 6 meses.

Análise estatística

Os resultados foram analisados por meio de análise de variância (ANOVA) e seguida por post-hoc de Tukey-HSD. A análise estatística foi realizada no software IBM® SPSS® Statistical (Versão 22, NY, EUA). Todos os valores foram expressos em média e desvio padrão (média ± DP). A diferença foi estatisticamente significativa quando p <0,05.

Resultados e discussão

Análise usando 2 ⁴ Projeto Fatorial Completo

Os valores das variáveis independentes selecionadas, ou seja, tempo de homogeneização (A), concentração de lipídios sólidos (B), concentração de lipídios líquidos (C) e concentração de surfactante (D) e os resultados obtidos das respostas selecionadas, ou seja, PS, PDI , ZP e% EE são apresentados na Tabela 2. Cada variável independente e suas interações foram avaliadas estatisticamente por meio da ANOVA. O coeficiente polinomial para cada variável dependente foi gerado pelo software Design-Expert® para quantificar o efeito de cada variável independente, conforme mostrado nas Eqs. 3, 4, 5 e 6. As equações representam apenas os fatores significativos e suas interações.
$$ \ mathrm {PS} =185,73-7.64A-2.13C-12.03D-2.15 \ mathrm {AC} +2,16 \ mathrm {BD} -3,53 \ mathrm {CD} $$ (3) $$ \ mathrm {PDI } =0,48-0,060C-0,029 \ mathrm {AC} +0,039 \ mathrm {CD} $$ (4) $$ \ mathrm {ZP} =- 45,94-2,06C-1,41D + 0,91 \ mathrm {BD} -1,09 \ mathrm {CD} $$ (5) $$ \% \ mathrm {EE} =81,40-4,31A + 8,45D-2,13 \ mathrm {AD} +1,90 \ mathrm {BD} $$ (6)
onde A é o tempo de homogeneização (min), B é a concentração de lipídios sólidos (mg), C é a concentração de lipídeo líquido (mg), e D é a concentração do surfactante (mg). Os sinais positivos e negativos antes de cada fator ou fatores de interação nas equações estão representando um efeito sinérgico ou antagônico, respectivamente. Os gráficos de superfície de resposta foram gerados para observar o efeito simultâneo de cada fator ou interações de fator sobre os parâmetros de resposta.

Efeitos das variáveis no tamanho médio das partículas

Conforme mostrado na Eq. 3, fatores A , C e D têm efeitos antagônicos no tamanho da partícula (PS). Pode-se concluir que aumentando o tempo de homogeneização (fator A ) está simultaneamente associado a uma diminuição significativa no PS de NLCs ( p <0,05). Isso provavelmente se deve à alta força de cisalhamento de homogeneização que quebra com eficiência os glóbulos lipídicos em partículas menores. Da mesma forma, aumentando a concentração de lipídios líquidos ( C ) foi encontrado para diminuir simultaneamente o PS dos NLCs. Isso pode ser atribuído à capacidade do ácido oleico de diminuir a viscosidade do sistema, bem como a tensão superficial quando combinado com Compritol 888 ATO®, portanto, produziu menor tamanho de partícula de NLCs. A capacidade do lipídio líquido de diminuir a viscosidade do sistema quando combinado com o lipídio sólido também foi relatada por Jenning et al. quando prepararam uma dispersão SLN [5]. Os autores observaram que o aumento da concentração de lipídios líquidos de 0 a 38% na composição da matriz lipídica reduziria o tamanho das partículas. Além disso, aumentando a concentração de surfactante ( D ) diminuiria o PS, porque maior quantidade de surfactante presente no sistema emulsificaria facilmente o conteúdo total de lipídios na formulação, formando nanopartículas menores.

A Figura 2 mostra o significativo ( p <0,05) efeito das interações dos fatores (AC, BD e CD) no PS do NLC. O impacto positivo do fator (BD) e o impacto negativo dos fatores (interação AC e CD) mostraram um efeito significativo no tamanho das partículas dos NLCs. O impacto negativo do fator (AC) mostrou que em maior tempo de homogeneização e maior concentração de lipídeo líquido causou uma diminuição no PS. A interação entre maiores concentrações de lipídio sólido e surfactante na formulação NLC (interação BD) apresentou um impacto positivo significativo no tamanho de partícula, o que resultou em maior tamanho de partícula. Em contraste, a interação entre concentrações mais elevadas do lipídio líquido e surfactante (interação CD) mostrou um impacto negativo significativo no tamanho da partícula onde o tamanho menor foi produzido.

Gráfico de superfície de resposta representando a significância ( p <0,05) efeito do tempo de homogeneização, concentração de lipídios líquidos, concentração de surfactante e interação entre a AC, b BD e c CD no PS de HVD-NLCs. A tempo de homogeneização, B lipídio sólido, C lípido líquido, D surfactante

Efeitos das variáveis no PDI

Conforme ilustrado na Eq. 4, o ácido oleico mostrou ter um impacto negativo no PDI, o que significa que o aumento da concentração de ácido oleico diminuiria os valores do PDI e levaria a uma melhor distribuição das partículas de NLC. Efeito semelhante do ácido oleico no NLC também foi observado por alguns pesquisadores [6]. A Figura 3 representou a interação entre o tempo de homogeneização e a concentração de lipídios líquidos (interação AC). Esta interação mostrou um efeito negativo significativo no PDI. Isso significa que o tempo de homogeneização mais longo e a maior concentração de lipídios líquidos levariam a uma diminuição nos valores de PDI. Além disso, a interação entre as concentrações de lipídio líquido e surfactante (interação CD) apresentou efeito sinérgico nos valores de PDI. Assim, o aumento simultâneo das concentrações de lipídeo líquido e de surfactante aumentaria os valores de PDI e produziria partículas de HVD-NLCs menos homogêneas. Isso pode ser devido a um maior aumento na concentração de surfactante além do valor otimizado pode causar um acúmulo do surfactante nas superfícies externas das nanopartículas, o que por sua vez aumenta os valores de PDI. O mesmo padrão também foi observado por Shamma et al., Onde o aumento da concentração do surfactante causou um aumento nos valores de PDI dos NLCs [7].

Gráfico de superfície de resposta representando o significativo ( p <0,05) efeito da concentração de lipídios líquidos e interações entre a AC e b CD em PDI de HVD-NLCs. A tempo de homogeneização, C lípido líquido, D surfactante

Efeitos das variáveis no ZP

As formulações de HVD-NLCs tiveram a carga negativa devido à ionização de behenato de glicerila (um ácido graxo em Compritol 888 ATO®), ácido oleico e resíduo de sulfato de dextrana. Com base na Eq. 5, o aumento da quantidade de ácido oleico teve um impacto negativo nas nanopartículas e resultou no aumento da carga negativa das nanopartículas e, portanto, aumentou o ZP de HVD-NLCs. Isso é possivelmente devido à ionização excessiva de grupos carboxílicos abundantes no ácido oleico (lipídio líquido) [8]. Além disso, o behenato de glicerila (lipídio sólido) também apresentou efeito negativo nos valores de ZP, onde o aumento de sua concentração aumenta o ZP das nanopartículas. Isso é devido à maior ionização de carboxílico no behenato de glicerila que leva a cargas negativas mais altas na superfície externa das nanopartículas.

A interação BD teve um efeito positivo significativo no ZP dos NLCs, enquanto a interação CD mostrou um efeito negativo (Fig. 4). Aumentar a concentração de lipídeo sólido e diminuir a concentração de surfactante reduz a carga negativa das nanopartículas e diminui os valores de ZP. Provavelmente, nesta fase, menor concentração de surfactante não seria capaz de ionizar a quantidade total de lipídio sólido, que levaria a reduzir as cargas negativas na superfície das nanopartículas, reduzindo assim o ZP dos HVD-NLCs. Além disso, aumentar simultaneamente a concentração de lipídeo líquido e surfactante (interação de CD) aumentaria significativamente o valor de ZP de HVD-NLCs. Isso ocorre porque mais ácido carboxílico seria ionizado na presença de maior concentração de surfactante na formulação.

Gráfico de superfície de resposta representando o significativo ( p <0,05) efeito da concentração de lipídios líquidos, concentração de surfactante e interações entre a BD e b CD no ZP de HVD-NLCs. B lipídio sólido, C lípido líquido, D surfactante

Efeitos das variáveis em% EE

A Equação 6 mostrou que aumentar o tempo de homogeneização seria significativamente ( p <0,05) diminuir a% EE do fármaco. Um tempo de homogeneização mais longo poderia descascar ou descascar as moléculas do fármaco ligadas à superfície externa das nanopartículas, o que resultou em uma% EE inferior do fármaco nos HVD-NLCs. Em contraste, o aumento da concentração de surfactante resultou em uma% EE mais alta da droga nos HVD-NLCs. Isso poderia ser devido a uma concentração mais alta de surfactante que aumentaria o revestimento da superfície externa de NLCs, onde parte da droga ficaria presa nele. Zhuang et al. e Das et al. sugeriram que uma concentração adequada de surfactante é essencial para a solubilização das moléculas do fármaco dentro da rede lipídica e na superfície externa das nanopartículas [9, 10].

Conforme mostrado na Fig. 5, a interação AD teve um significativo ( p <0,05) impacto negativo, em que aumentar o tempo de homogeneização e diminuir a quantidade de surfactante diminui a% EE do fármaco nos HVD-NLCs. Em contraste, a interação entre as concentrações de lipídio sólido e surfactante (interação BD) mostrou um efeito positivo na% EE do fármaco. Portanto, o aumento da concentração de lipídeo sólido e surfactante aumentará a% EE do fármaco nos HVD-NLCs. Isso provavelmente se deve à maior concentração de surfactante que solubilizaria o excesso de moléculas de fármaco e, ao mesmo tempo, a maior quantidade de presença de lipídios sólidos no sistema acomodou o excesso de moléculas de fármaco, aumentando, portanto, a% EE do fármaco no HVD- NLCs.

Gráfico de superfície de resposta representando o significativo ( p <0,05) efeito do tempo de homogeneização, concentração de lipídios líquidos, concentração de surfactante e interações entre a AD e b BD em EE de verapamil em HVD-NLCs. A tempo de homogeneização, B lípido sólido, D surfactante

Seleção de HVD-NLCs otimizados usando a função de desejabilidade

As formulações de HVD-NLCs com o código no.VER-9, VER-11, VER-13 e VER-15 tiveram valores de desejabilidade mais elevados de 0,863, 0,852, 0,811 e 0,840, respectivamente. Essas formulações foram selecionadas para estudo posterior porque os valores de desejabilidade estavam mais próximos de 1. A função de desejabilidade individual e combinada de todas as respostas para as formulações selecionadas é ilustrada na Fig. 6. A média de PS, PDI, ZP e% EE dessas as formulações estavam na faixa de 173,46 ± 0,757 a 190,3 ± 8,22, 0,451 ± 0,033 a 0,501 ± 0,019, - 46,73 ± 1,13 a - 49,16 ± 1,55 e 93,95 ± 4,10 a 98,81 ± 1,01, respectivamente.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. a VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ^- ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n =3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.

Conclusion

The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.

Abreviações

%EE:: Percentage of entrapment efficiency
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagles medium
DSC:: Calorimetria de varrimento diferencial
FBS:: Fetal bovine serum
HVD-NLCs:: Hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers
ICH:: The international council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human
IDL:: Intermediate density lipoproteins
LDL:: Low density lipoproteins
NLCs:: Nanostructured lipid carriers
PBS:: Salina tamponada com fosfato
PDI:: Polydispersity index
PS:: Particle size
RH:: Relative humidity
SEM:: Microscópio eletrônico de varredura
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
VLDL:: Very low-density lipoproteins
WAXS:: Wide-angle X-ray scattering
ZP:: Zeta potential