Captação Dependente da Forma de Nanoestruturas de Ouro em Células de Glioblastoma: Da Síntese à Interação Celular

Resumo

Nanoestruturas de ouro (Au NSs) com tamanho e forma controlados estão emergindo como ferramentas versáteis para nanomedicina. No entanto, o destino celular de diferentes geometrias permanece mal compreendido, particularmente em cânceres agressivos como glioblastoma. Aqui sintetizamos cinco Au NSs distintas — nanobastões (NRs), tetraexaedros (THH), bipirâmides (BPs), partículas esféricas (SPs) e uma forma nova denominada nano-makura (NM) — usando crescimento mediado por sementes com surfactantes binários e rota Turkevich modificada. Todas as partículas foram funcionalizadas com PEG-SH e ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) para conferir carga negativa e estabilidade estérica. Ensaios de citotoxicidade (LIVE/DEAD) em células de glioblastoma U-87 MG revelaram efeitos dependentes da forma: NM exibiu maior morte celular (~20% a 2 mg mL⁻¹) enquanto SPs e BPs permaneceram amplamente não tóxicas. Microscopia eletrônica de transmissão mostrou que NM entra nas células via endocitose mediada por receptores dentro de 2 h e posteriormente desencadeia macropinocitose, levando a acúmulo vesicular e eventual desprendimento celular. Esses achados demonstram que a morfologia da partícula, e não apenas o tamanho, governa vias de captação celular e resultados citotóxicos, posicionando NM como candidato promissor para terapia fototérmica direcionada e liberação de fármacos em glioblastoma.

Introdução

Nanoestruturas de ouro são valorizadas por suas propriedades ópticas e eletrônicas dependentes de forma e tamanho, permitindo aplicações de biossensores a terapia fototérmica. Ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) na região visível-infravermelho próximo (NIR) torna partículas anisotrópicas, especialmente nanobastões de alto aspecto, excelentes agentes de contraste para tomografia computadorizada e imagem fotoacústica. Nanoestruturas menores exibem absorção superior, aumentando eficiência fototérmica. Além disso, formas anisotrópicas podem auto-organizar-se em superestruturas que geram campos eletromagnéticos intensos, vantajosos para espalhamento Raman amplificado por superfície e liberação direcionada de fármacos.

Crescimento mediado por sementes, frequentemente suplementado com íons prata e misturas de surfactantes (ex.: CTAB com ácido oleico ou DDAB), tornou-se método preferido para personalizar Au NSs, pois permite controle preciso sobre razão de aspecto e crescimento de facetas. Apesar dos avanços na síntese, estudos sistemáticos sobre como diferentes geometrias interagem com células — particularmente glioblastoma, tumor cerebral altamente proliferativo e invasivo — são limitados. Compreender essas interações é essencial para projetar nanomedicinas que alvejem seletivamente células cancerígenas minimizando efeitos off-target.

Glioblastoma multiforme (GBM) permanece o tumor cerebral primário mais letal, com sobrevida média inferior a 15 meses apesar de terapia agressiva. Células U-87 MG de glioblastoma-astrocitoma proliferam rapidamente (tempo de duplicação ~32 h) e internalizam prontamente partículas estranhas, tornando-as ideais para estudos de captação. Aqui, apresentamos comparação abrangente de cinco formas de Au NS, focando em síntese, funcionalização superficial, citotoxicidade e mecanismos de captação em células U-87 MG.

Experimental

Materiais

Todos reagentes (ácido oleico, nitrato de prata, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, ácido ascórbico, NaBH₄, PEG-SH, MUA, etc.) adquiridos da Sigma-Aldrich ou Merck e usados sem purificação adicional. Soluções preparadas com água ultrapura (18,2 MΩ cm).

Síntese de Au NSs Anisotrópicas

Partículas-semente (~5 nm) preparadas reduzindo HAuCl₄ com NaBH₄ em CTAB. Para nanobastões, tetraexaedros e bipirâmides, solução de crescimento contendo CTAB, co-surfactante (ácido oleico ou DDAB), AgNO₃ e ácido ascórbico aquecida a 80 °C. Após resfriamento, solução-semente e HAuCl₄ adicionados, mistura agitada a 35 °C por 24 h. Ajuste da razão ácido oleico/CTAB rendeu morfologia desejada: razões baixas produziram nanobastões dog-bone, razões maiores deram tetraexaedros alongados, e combinação CTAB/DDAB produziu bipirâmides. Para a nova forma nano-makura, crescimento em duas etapas empregado: reação inicial mediada por semente seguida por segunda etapa de crescimento usando solução intermediária, produzindo partícula tridimensional irregular semelhante a travesseiro (travesseiro = makura em japonês).

Síntese de Au NSs Esféricas

SPs fabricadas por método Turkevich modificado: solução de citrato de sódio 10 mM (10 mL) aquecida a 70 °C, seguida por adição gota a gota de 1,5 mM HAuCl₄ (10 mL). Mistura tornou-se vermelho-arroxeado após ~8 min e resfriada à temperatura ambiente antes de centrifugação (14.500 rpm, 10 min).

Funcionalização Superficial

Partículas primeiro incubadas com PEG-SH (1 mg mL⁻¹) por 2 h para substituir CTAB e proporcionar estabilização estérica. Após centrifugação, NSs PEGiladas tratadas com MUA (250 µL 10 mM em EtOH/H₂O) por 1 h a 55 °C, alcançando remoção completa de CTAB e conferindo carga superficial negativa. Tamanho e potencial zeta monitorados por DLS; XPS confirmou remoção de bromo da superfície.

Cultura Celular e Ensaio de Viabilidade

Células U-87 MG mantidas em EMEM suplementado com 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 1% NEAA, 1 mM piruvato de sódio e 1,25% gentamicina. Para citotoxicidade, células a 70% de confluência incubadas com Au NSs a 100, 200, 500 µg mL⁻¹ e 2 mg mL⁻¹ por 24 h. Morte celular quantificada por ensaio LIVE/DEAD (calceína AM e etídio homodímero-1) e coloração nuclear Hoechst, imageadas em microscópio Zeiss Axiovert 200 M. Três poços independentes por concentração analisados.

Estudo de Captação Dependente do Tempo (NM)

Células expostas a 2 mg mL⁻¹ NM por 2, 6, 12 e 24 h. Após incubação, células fixadas com 2% paraformaldeído e 2,5% glutaraldeído, pós-fixadas com tetróxido de ósmio (± ferrocianeto de potássio), desidratadas e embutidas para seções ultrafinas (70 nm) de MET. Imagens de MET usadas para rastrear localização e morfologia de NM dentro de compartimentos celulares.

Caracterização

STEM de campo claro e HRMET (JEOL 2100, 200 kV) avaliaram morfologia e cristalinidade. Espectros UV-Vis (200–800 nm) registrados em Shimadzu UV-2401PC. Espalhamento dinâmico de luz e potencial zeta medidos em Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS realizado com espectrômetro Kratos Axis Ultra DLD (Al Kα, 1486,6 eV).

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização de Au NSs Anisotrópicas

Crescimento mediado por sementes com surfactantes binários produziu nanobastões de alto rendimento (~20 nm × 50 nm), tetraexaedros (~50 nm comprimento de aresta) e bipirâmides (~200 nm). Partículas nano-makura exibiram morfologia única, tridimensional, irregular, confirmada por MET em múltiplas orientações. HRMET revelou núcleos monocristalinos com facetas lisas para NRs, enquanto NM mostrou superfícies irregulares e banda LSPR mais ampla, refletindo sua polidispersividade. Espectros UV-Vis exibiram picos de plasmon longitudinal e transversais distintos: NRs (516, 679, 796 nm), THH (≈568 nm), BPs (≈593 nm), NM (≈557 e 760 nm). SPs mostraram pico único a 520 nm.

Resultados da Funcionalização Superficial

Medidas DLS mostraram aumentos incrementais de tamanho após revestimento PEG-SH e MUA, exceto para BPs onde leve diminuição observada devido a empacotamento mais denso. Potencial zeta mudou de positivo (revestido com CTAB) para negativo (revestido com MUA), confirmando troca de ligantes bem-sucedida. Espectros XPS exibiram bromo negligenciável, indicando remoção quase completa de CTAB. Espectros ópticos permaneceram largamente inalterados, com apenas leve alargamento de pico para formas anisotrópicas, atribuível a aumento de tamanho e rugosidade superficial.

Citotoxicidade Dependente da Forma

Ensaio LIVE/DEAD revelou que NM induziu maior morte celular (~20% a 2 mg mL⁻¹), enquanto SPs e BPs permaneceram <5% citotóxicas em todas concentrações. NRs, apesar de alta razão de aspecto e carga superficial positiva, não aumentaram morte celular relativo a outras formas, sugerindo que medição de carga superficial por potencial zeta pode não refletir carga local real em partículas anisotrópicas. Globalmente, tamanho desempenhou papel menor; tanto SPs de 15 nm quanto BPs de 650 nm exibiram captação e toxicidade comparáveis.

Mecanismos de Captação de nano-makura

MET resolvido no tempo mostrou NM associando-se à membrana plasmática após 2 h, seguido por internalização via endocitose mediada por receptores. A 12 h, vesículas contendo NM indicaram mudança para macropinocitose, provavelmente devido a agregação e adsorção de proteínas. NM localizou-se preferencialmente na periferia de endossomos, alinhando-se com membrana vesicular, e trafegou em direção à região perinuclear. A 24 h, extenso acúmulo vesicular correlacionou-se com mudanças morfológicas: células perderam filopódios, tornaram-se arredondadas e desprenderam do substrato, indicando disrupção citoesquelética e apoptose.

Discussão

Estes resultados destacam influência crítica da morfologia da partícula nas vias de captação celular. Enquanto formas anisotrópicas podem melhorar propriedades ópticas e fototérmicas, sua geometria irregular também pode aumentar formação de coroa proteica, promovendo macropinocitose e citotoxicidade. Partículas nano-makura, com estrutura semelhante a travesseiro, alcançaram internalização eficiente e morte celular significativa, tornando-as candidatas atraentes para terapia de glioblastoma. Estudos futuros devem explorar biodistribuição in vivo e eficácia terapêutica, bem como funcionalização com ligantes direcionadores para melhorar seletividade.

Conclusões

Sintetizamos cinco nanoestruturas de ouro de formas e tamanhos distintos, uniformemente funcionalizadas com PEG-SH e MUA para gerar partículas estáveis e negativamente carregadas. Forma, e não apenas tamanho, ditou captação celular e citotoxicidade em células U-87 MG de glioblastoma. A nova forma nano-makura demonstrou internalização superior, levando a morte celular significativa via endocitose mediada por receptores e subsequente macropinocitose. Estes achados posicionam nano-makura como plataforma promissora para terapia fototérmica combinada e liberação de fármacos em tumores cerebrais agressivos.

Abreviações

AgNO₃

Nitrato de prata

Au

Ouro

BF

Campo claro

BPs

Bipirâmides

CTAB

Brometo de cetiltrimetilamônio

DDAB

Brometo de didodecildimetilamônio

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

EMEM

Meio Essencial Mínimo de Eagle

EthD-1

Etídio homodímero-1

GBM

Glioblastoma multiforme

HAuCl₄

Ácido cloroáurico

HRTEM

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

IR

Infravermelho

LSPR

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MUA

Ácido 11-mercaptoundecanoico

Na-citrato

Citrato de sódio di-hidratado

NM

nano-makura

NRs

Nanobastões

Ns

Nanoestrutura

OA

Ácido oleico

PEG-SH

O-[2-(3-mercaptopropionilamino)etil]-O-etilpolietilenoglicol

STEM

Microscopia eletrônica de transmissão de varredura

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

THH

Tetraexaedros

UV-Vis

Espectroscopia ultravioleta-visível

XPS

Espectroscopia de fotoelétrons por raios X