Deposição precisa in situ modificada em campo elétrico de fibras de cola médica eletroferadas no fígado para hemostasia rápida

Resumo

A deposição precisa de nanofibras ainda é uma questão importante nas aplicações de eletrofiação (e-spinning), especialmente na hemostasia rápida de órgãos como fígado, pulmão e rim. Neste estudo, propomos uma técnica de e-spinning modificada por campo elétrico com um cone de metal acoplado ao bico giratório para realizar deposição precisa e controlável de fibras. A faixa de deposição das fibras e-fiadas é ajustável mudando o tamanho do cone de metal, e ao mecanismo é atribuído o campo elétrico focalizado verificado por simulações teóricas. Este método de e-spinning modificado por campo elétrico foi usado posteriormente para depositar com precisão a cola médica N in situ -octil-2-cianoacrilato (NOCA) no local de ressecção do fígado de rato para realizar hemostasia rápida em 10 s. Os resultados patológicos pós-operatórios indicam que menos resposta inflamatória e adesão do tecido são observadas neste grupo de e-spinning modificado com campo elétrico em comparação com o grupo assistido por fluxo de ar tradicional. Esta técnica combinada com nosso dispositivo portátil de e-spinning pode ser usada em tratamento médico de emergência, clínicas, sobrevivência em campo e atendimento domiciliar por sua portabilidade e características de deposição precisas.

Histórico

A ressecção hepática é uma forma eficaz de tratar câncer no fígado [1]. No entanto, o sangramento intenso geralmente ocorre na ressecção hepática devido ao vaso sanguíneo abundante neste local especial [2]. A falha em parar o sangramento em tempo hábil pode levar a falências graves de órgãos que podem até ameaçar a vida humana [3]. Os métodos atuais para estancar o sangramento concentram-se principalmente em métodos mecânicos como sutura e ligadura, métodos térmicos como eletrocauterização [4] e uso de agentes de método hemostático como selantes de fibrina [5, 6], matriz de gelatina [7] e adesivo de hidrogel de quitosana [8 ] Claro, todos eles têm vantagens e limitações óbvias. Por exemplo, a sutura é a maneira mais eficaz de parar o sangramento, mas requer um processo oportuno e meticuloso; caso contrário, causa isquemia em longo prazo [9]. Da mesma forma, os métodos térmicos podem danificar os tecidos locais e podem torná-los anormais do tecido normal, que não podem ser distinguidos facilmente [10]. Além disso, os selantes de fibrina amplamente usados para hemostasia podem facilmente levar a uma resposta imune humana adversa e também têm desvantagens, como vida útil curta, vulnerabilidade à intrusão microbiana e alto preço [11]. Em contraste, a tecnologia e-spinning mostra um excelente potencial na hemostasia por suas características especiais, como o uso de menos dosagem e revestimento nos locais da ferida, mesmo com superfícies irregulares [12, 13]. No entanto, as técnicas e dispositivos de e-spinning existentes para hemostasia ainda têm vários problemas a superar:(1) o volume e o peso são tão volumosos que não podem ser transportados facilmente, (2) a deposição imprecisa de fibras [14] leva mais tempo para realizar o mesmo efeito de hemostasia e também pode causar aderência do tecido após a operação, e (3) eles dependem do fornecimento de energia elétrica urbana, portanto, não são adequados para uso em áreas externas e remotas sem fornecimento de energia [15]. Embora nosso grupo tenha relatado recentemente uma técnica de e-spinning assistida por fluxo de ar que utiliza um soprador de bomba de ar para permitir a deposição orientada de fibras [12], ela precisa de fornecimento de energia adicional para a bomba de ar. Portanto, uma técnica e um dispositivo portátil de e-spinning que não dependa principalmente de eletricidade, mas também possa atingir a deposição orientada de fibras para hemostasia rápida, são altamente desejados.

Uma placa de metal colocada no campo eletrostático irá gerar cargas indutivas em sua superfície devido à interação eletrostática, que pode induzir um novo campo elétrico e, assim, alterar as distribuições originais do campo eletrostático [16,17,18]. Por outro lado, o processo de e-spinning utiliza o chicote instável e a divisão de jatos carregados durante o campo eletrostático para atingir micro / nanofibras e, finalmente, depositar em um coletor aterrado [19, 20]. O jato carregado é sensível à distribuição do campo eletrostático, de modo que fibras mais finas geralmente são obtidas alterando a tensão [21, 22]. Portanto, com base neste princípio descrito acima, podemos introduzir uma placa de metal no processo de e-spinning para produzir deposição mais orientada, diminuindo o ângulo de divergência do jato voador por meio da alteração da distribuição do campo eletrostático. Além disso, usamos cola médica de cianoacrilato (CA) usada clinicamente [23] como medicamento para hemostasia [24], porque uma grande dosagem geralmente é necessária nas clínicas para formar um filme espesso para hemostasia. No entanto, este filme é rígido para a grande espessura da cola médica CA. Pelo contrário, as membranas de fibra polimérica geradas por métodos de e-spinning são frequentemente flexíveis e compactas o suficiente [25]. Portanto, é de grande importância usar métodos modificados por campo eletrostático para cola médica CA de e-spinning com deposição precisa no fígado para hemostasia rápida.

Neste estudo, propomos uma técnica de e-spinning modificada por campo elétrico para realizar a deposição precisa e controlável de fibras de cola médica no local da ressecção hepática. A faixa de deposição das fibras e-fiadas é ajustável alterando o tamanho do cone de metal. Este método de e-spinning modificado por campo elétrico foi usado posteriormente para depositar com precisão a cola médica N in situ -octil-2-cianoacrilato (NOCA) no local de ressecção do fígado de rato para realizar hemostasia rápida em 10 s. Os resultados patológicos pós-operatórios indicam que menos resposta inflamatória e adesão de tecido são observadas neste grupo de e-spinning modificado com campo elétrico em comparação com aqueles no grupo assistido por fluxo de ar tradicional. Esta técnica combinada com nosso dispositivo portátil de e-spinning pode ser usada em tratamento médico de emergência, clínicas, sobrevivência em campo e atendimento domiciliar por sua portabilidade e características de deposição precisas.

Métodos

Materiais

Adesivo médico rápido α-cianoacrilato (CA) que é composto por N -octil-2-cianoacrilato e polimetilmetacrilato de grau médico (PMMA, um aditivo para aumentar a viscosidade) foram fornecidos por Guangzhou Baiyun Medical Adhesive Co., Ltd. e usados sem purificação adicional. O hidrato de cloral foi adquirido da Aladdin, que foi diluído em 10% para posterior anestesia.

Experimentos hemostáticos in vivo

Os experimentos de hemostasia após a ressecção do fígado do rato foram operados em 40 ratos SD machos adultos pesando 300 ~ 350 g. Esses ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos para fluxo de ar assistido in situ ( n =20) e e-spinning modificado com campo elétrico ( n =20) tratamento. Todos os ratos aceitaram 0,7 ml de hidrato de cloral a 10% antes da operação, em seguida, uma laparotomia, sem lóbulo, e uma ressecção hepática de 50%, seguida por campo elétrico modificado in situ (comprimento do lado do eletrodo de 2,5 cm, ângulo do eletrodo de 60 °, e - distância de giro de 10 cm, tensão de 10 kV) ou com fluxo de ar assistido (diâmetro de saída de 1,2 mm, tensão de 10 kV, taxa de fluxo de 120 μl min ⁻¹ , e distância de e-spinning de 10 cm) fibras NOCA de e-spinning. Todo o processo demorou cerca de 20 minutos para cada rato. Todos os procedimentos operacionais estavam em conformidade com os regulamentos do National College of Animal Experiments e dos regulamentos de gerenciamento do University Animal Research Committee.

Exame de sangue e seccionamento patológico

Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca no terceiro e quinto dias após a operação para detecção de contagem de leucócitos (leucócitos) e testes de função hepática. Os ratos foram submetidos à eutanásia e o lobo excisado no sétimo dia de pós-operatório, no qual o lobo foi posteriormente fixado em solução de formalina neutra a 4%, embebido em parafina e corado com hematoxilina e eosina (HE).

Simulação de campo elétrico

O método de análise de elementos finitos foi usado para simular a distribuição do campo elétrico. O modelo geométrico consiste em uma fonte de alimentação de 12 kV, uma agulha de cobre acoplada a um cone de cobre e uma placa coletora de alumínio no ar. Os parâmetros de comprimento da agulha, diâmetro do cone e distância de recebimento foram definidos como 3, 5 e 10 cm, respectivamente.

Caracterização

A imagem SEM foi realizada em um microscópio eletrônico de varredura Hitachi TM-1000. O espectro infravermelho da transformada de Fourier (FTIR) foi medido em um espectrômetro Nicolet In10 para analisar a estrutura intermolecular das fibras. Um microscópio óptico (Olympus BX51) foi usado para encontrar o limite de deposição e avaliar a área de deposição. A câmera Casio Exilim foi usada para registrar o processo de ressecção hepática in vivo.

Resultados e discussão

Fiação E modificada por campo elétrico para deposição precisa

Figura 1 e arquivo adicional 1:A Figura S1 exibe nosso dispositivo de e-spinning portátil equipado com a técnica de e-spinning modificada por campo elétrico. Ele usa duas baterias AAA alcalinas sem mercúrio (diâmetro de 10 mm, altura de 44 mm; LR03, Fujian Nanping, Bateria Nanfu, China) como fonte de alimentação com um conversor de alta tensão e se livra da limitação do fornecimento de eletricidade urbano que se desenvolve muito o uso portátil em exteriores. É importante ressaltar que, significativamente diferente do nosso dispositivo de e-spinning relatado recentemente [11], um cone metálico com tamanho ajustável é equipado na agulha giratória. A introdução do cone metálico mudaria as distribuições do campo eletromagnético original e afetaria o processo de e-spinning. Deve-se notar que os problemas de segurança, como choque elétrico, geralmente são causados por corrente alta, e não por alta tensão. Neste estudo, o dispositivo portátil possui um conversor que é utilizado para manter uma alta tensão e uma baixa corrente para garantir a segurança.

Diagrama esquemático das fibras NOCA de e-spinning modificadas por campo elétrico para hemostasia de ressecção hepática

A Figura 2a mostra a imagem SEM de fibras NOCA de cola médica. O diâmetro das fibras NOCA é de cerca de 1 ~ 3 μm, e essas fibras exibem uma morfologia de fibra contínua. A Figura 2b mostra o espectro de FTIR dessas fibras NOCA. Picos a 714 cm ⁻¹ , 2761 cm ⁻¹ e 1732 cm ⁻¹ correspondem à vibração de –CH ₂ -, –C≡N e –C =O, respectivamente. O pico em 3127 cm ⁻¹ correspondendo a =CH– quase desaparece, o que é causado pelo processo de polimerização durante o processo de e-spinning em que a maioria das ligações alquenil C =C em moléculas de monômero são transformadas em cadeias de polímero. Além disso, investigamos a relação entre o tamanho do cone metálico e a deposição orientada. Conforme mostrado na Fig. 2c, o diâmetro da área de deposição diminui com a diminuição do tamanho do cone metálico quando a distância entre a ponta da agulha e o coletor foi fixada em 10 cm. Este fenômeno é provavelmente devido ao fato de que o campo eletrostático seria restringido em uma faixa mais estreita [26, 27] com a diminuição do tamanho do cone metálico e, portanto, o processo de chicoteamento no e-spinning seria mais restrito levando a uma área de deposição menor . Além disso, a relação entre a distância de e-spinning e a área de deposição também foi estudada (Fig. 2d). Arquivo adicional 1:A Tabela S1 apresenta a largura de deposição de três métodos diferentes de e-spinning com o aumento da distância de e-spinning. A deposição de concreto descobriu que a área de deposição aumenta com o aumento da distância de e-fiação, o que é consistente com os resultados de e-fiação tradicionais. No entanto, em comparação com a e-spinning tradicional, a nossa e-spinning com campo elétrico modificado com um cone metálico traz uma área de deposição menor, ou seja, uma deposição melhor orientada. Mesmo em comparação com o nosso e-spinning assistido por fluxo de ar relatado recentemente, este e-spinning com campo elétrico modificado exibe uma deposição melhor orientada. Conforme mostrado na Fig. 2c, d, o ajuste da distância de e-spinning e do comprimento lateral do cone de metal pode focalizar o campo elétrico e produzir uma força de convergência mais forte. Embora alguma parte mais próxima, como a pele ou o músculo do abdômen, possa produzir uma força para atrair o jato voador, podemos ajustar esses dois parâmetros para gerar uma força de convergência mais forte que pode reduzir esse efeito negativo da força de atração. Além disso, a e-spinning assistida por fluxo de ar requer uma fonte de alimentação adicional para a bomba de ar, e essa e-spinning modificada em campo pode eliminá-la, trazendo mais conveniência.

a A imagem SEM e b Espectro FTIR de fibras NOCA obtido pelo dispositivo e-spinning assistido por campo elétrico. O tamanho da área de deposição em função de c diâmetro do cone metálico e d distância de e-spinning

Análise do mecanismo de deposição precisa

Para entender a razão pela qual este dispositivo de e-spinning equipado com um cone de metal poderia trazer uma área de deposição menor, suas simulações de campo elétrico foram conduzidas posteriormente. A Figura 3 mostra a distribuição do campo elétrico de modelos e-spinning equipados com e sem cone de metal. A seta vermelha representa a linha do campo elétrico, cuja direção e comprimento representam a orientação e a intensidade do campo elétrico neste ponto, respectivamente. O e-spinning tradicional é aquele sem um cone de metal (Fig. 3a), e nosso e-spinning modificado por campo elétrico é aquele com um cone de metal (Fig. 3b). Conforme mostrado na Fig. 3, o potencial elétrico (barra de cores) é significativamente diminuído ao longo da direção da agulha para a placa de coleta e, portanto, as fibras com carga positiva podem ser montadas na placa de coleta. Mais interessante, comparando a Fig. 3a com b, maior intensidade do campo elétrico e menor ângulo de divergência da direção do campo elétrico foram observados na Fig. 3b, e esses fenômenos são mais óbvios quando estão perto do cone de metal. Seu efeito na mudança do campo elétrico atua como o efeito de convergência da luz por uma lente convexa. As linhas do campo elétrico são convergentes, de modo que provoca um menor ângulo de divergência de direção do campo elétrico. Além disso, a intensidade do campo elétrico na mesma posição também se torna maior devido a esta convergência e ao princípio de superposição do campo elétrico. A inserção é a linha de campo elétrico representativa selecionada na mesma área com ampliação. A intensidade do campo é 4 × 10 ⁵ V / m na inserção da Fig. 3b, que é maior do que 3 × 10 ⁵ V / m na inserção da Fig. 3a, indicando que a maior intensidade do campo elétrico ocorre no espaço após a adição de um cone de metal. E o ângulo de divergência da direção do campo elétrico é de 6 ° na inserção da Fig. 3b, que é menor do que 20 ° na inserção da Fig. 3a. Esses resultados implicam que este e-spinning modificado por campo elétrico equipado com um cone de metal trazendo uma área de deposição menor pode ser atribuído a uma força de campo elétrico mais forte e menor ângulo de divergência, o que restringe as fibras de carga positiva voando em um espaço mais estreito, confinando assim sua deposição em uma área menor.

Distribuição de campo elétrico de modelos de e-spinning equipados a sem e b com um cone de metal. As inserções são imagens ampliadas da mesma área e mostram o ângulo entre a linha de campo e a direção vertical

Hemostasia e análise rápidas in vivo

A Figura 4a-c mostra o principal processo de hemostasia na ressecção hepática de ratos. Uma hemostasia rápida e eficaz foi alcançada em 10 s por fibras NOCA usando esta técnica de e-spinning modificada por campo elétrico, que é mais rápida do que a e-spinning assistida por fluxo de ar. Este fenômeno pode ser atribuído à deposição melhor orientada de e-spinning modificado por campo elétrico do que e-spinning assistido por fluxo de ar verificado na Fig. 2d, o que significa que a mesma quantidade de cola médica pode ser depositada com mais precisão no local da ferida durante o mesmo tempo de e-spinning. Na verdade, a cola médica NOCA usada em clínicas costuma ser pulverizada [28,29,30], enquanto a área de deposição é relativamente grande, levando a algumas aderências teciduais graves, o que torna difícil realizar operações pós-operatórias, como remoção de suturas e até mesmo causar danos secundários. A deposição melhor orientada não só permite uma hemostasia mais rápida, mas também pode evitar a adesão do tecido. A Figura 4d mostra a imagem SEM em corte transversal de fibras NOCA que se depositaram na superfície do fígado para hemostasia. Isso mostra que as fibras de NOCA estão fortemente aderidas à superfície da seção do fígado e formaram uma membrana de fibra compacta cuja espessura é de cerca de 50 μm com o tempo de e-spinning de 10 s. Durante este curto tempo de e-spinning de 10 s, a mudança de distância causada pelo tremor da mão que normalmente vem da fadiga é minúscula, geralmente não mais que 1 cm e, portanto, a variação da faixa de deposição é pequena. Mais interessante, a superfície da seção do fígado não é lisa, mas de forma irregular (Fig. 4c), enquanto as fibras de NOCA podem se depositar nesta superfície irregular com uma boa espessura uniforme (Fig. 4d), implicando que este campo elétrico modificado e A técnica de giro possui vantagens únicas na hemostasia rápida, mesmo em algumas superfícies irregulares de órgãos.

Hemostasia em modelo de ressecção hepática de rato por meio de e-spinning assistido por campo elétrico in situ. a O fígado foi dissociado e o lobo hepático exposto. b O lobo estava livre e fixado com sutura cirúrgica para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo hepático. c Uma hepatectomia foi feita e fibras de cola médica NOCA foram depositadas no local da ferida com nosso dispositivo e-spinning assistido por campo elétrico. d Imagem SEM em corte transversal de fibras de cola médica NOCA depositadas na superfície do fígado para hemostasia

O teste de contagem de leucócitos (fig. 5a) foi usado para avaliar infecções pós-operatórias causadas por hepatectomia e hemostasia em ratos. Cinco dias após a cirurgia, o número de leucócitos ( P <0,05) no grupo de e-spinning modificado com campo elétrico foi significativamente menor do que no grupo de pulverização convencional e no grupo assistido por fluxo de ar ( P <0,01). Além disso, foi próximo ao grupo sham-operado (grupo controle), o que indica que a inflamação aguda após 5 dias no grupo e-spinning modificado com campo elétrico diminuiu para um estado normal. Pelo contrário, os ratos no grupo de pulverização e no grupo assistido por fluxo de ar apresentam resposta inflamatória grave e regressão mais lenta.

Teste de sangue. a Contagem de leucócitos. b - d Teste de enzimas da função hepática. b Alanina aminotransferase (ALT). c Aspartato aminotransferase (AST). d Glutamiltransaminase (GGT)

A função hepática foi avaliada pela concentração de ALT sérica (Fig. 5b), AST (Fig. 5c) e GGT (Fig. 5d). Aqui, a concentração de ALT e AST pode refletir sensivelmente a extensão do dano às células do fígado. Altas concentrações de GGT podem refletir hepatite, icterícia obstrutiva, estase biliar e outros sintomas. Conforme mostrado na Fig. 5b-d, os níveis de enzimas da função hepática no grupo e-spinning modificado com campo elétrico após 5 dias de operação foram basicamente próximos aos do grupo sham (grupo controle) e foram significativamente menores do que aqueles no grupo convencional grupo de pulverização e grupo assistido por fluxo de ar, indicando que o estado fisiológico dos ratos no grupo e-spinning modificado com campo elétrico e no grupo sham foi semelhante. No entanto, GGT no grupo de pulverização e grupo assistido por fluxo de ar ainda permaneceu um nível alto no quinto dia após a operação ( P <0,001), indicando que existem alguns problemas graves, como estase biliar e danos ao fígado.

A biópsia patológica em tecidos hepáticos após a hemostasia foi conduzida. As Figuras 6a e c são seções patológicas do fígado após hemostasia com e-spinning assistido por fluxo de ar e modificado por campo elétrico, respectivamente, e as Fig. 6b e d são suas imagens ampliadas. Em comparação com o grupo e-spinning assistido por fluxo de ar, os limites do tecido hepático no grupo e-spinning modificado com campo elétrico são relativamente mais claros e têm uma cápsula mais fina. Esses resultados indicam que a capacidade de regeneração no fígado é melhor no grupo com campo elétrico modificado. Além disso, menos células inflamatórias foram observadas na cápsula, indicando que as membranas fibrosas de NOCA fabricadas pelo método de campo elétrico modificado podem causar menor resposta inflamatória. Esses resultados podem ser atribuídos ao fato de que métodos modificados por campo elétrico têm deposição melhor orientada do que métodos assistidos por fluxo de ar, reduzindo assim a quantidade de cola médica NOCA usada para atingir o mesmo efeito hemostático, o que reduzirá a adesão do tecido e, portanto, a inflamação resposta. Além disso, também pode ser visto na Fig. 6a, b que a cola médica foi separada do tecido do fígado, o que pode ser causado pelo sopro de ar, indicando que a adesão entre eles usando e-spinning assistida por fluxo de ar não é tão forte quanto o e-spinning modificado por campo elétrico.

Exame histopatológico com coloração HE observada sob a , c ampliação × 100 e b , d aumento de 200 ×. O exame histopatológico mostra uma resposta inflamatória e lesão hepática entre os hepatócitos em dois grupos no sétimo dia. Os dois grupos são a , b grupo assistido por fluxo de ar e c , d grupo modificado com campo elétrico (seta azul:células inflamatórias; círculo vermelho:cola médica; seta preta:espessura da zona de hiperemia)

Conclusões

Em resumo, propomos uma técnica de e-spinning modificada por campo elétrico com um cone de metal conectado ao bico giratório para realizar deposição precisa e controlável de fibras. A faixa de deposição das fibras e-fiadas é ajustável mudando o tamanho do cone de metal, e o mecanismo é atribuído ao campo elétrico focalizado verificado por simulações teóricas. Este método de e-spinning modificado por campo elétrico foi ainda usado para depositar com precisão fibras NOCA de cola médica in situ no local de ressecção do fígado de rato para realizar hemostasia rápida em 10 s. Os resultados patológicos pós-operatórios indicam que menos resposta inflamatória e adesão do tecido são observadas neste grupo de e-spinning modificado com campo elétrico em comparação com o grupo assistido por fluxo de ar tradicional. Esta técnica combinada com nosso dispositivo portátil de e-spinning pode ser usada em tratamento médico de emergência, clínicas, sobrevivência em campo e atendimento domiciliar por sua portabilidade e características de deposição precisas.

Abreviações

ALT:: Alanina aminotransferase
AST:: Aspartato aminotransferase
CA:: Cianoacrilato
E-spinning:: Electrospinning
FTIR:: Transformada de Fourier Infra-vermelho
GGT:: Glutamiltransaminase
HE:: Hematoxilina e eosina
NOCA:: N -Octil-2-cianoacrilato
PMMA:: Metacrilato de polimetila
SEM:: Microscópio eletrônico de varredura
WBC:: glóbulo branco

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