Nanopartículas de Ouro Modulam Atividade de CYP3A4 e Toxicidade Celular em Carcinoma Hepatocelular Humano: Influência de Tamanho, Química de Superfície e Coroa Protéica

Resumo

Investigamos como nanopartículas de ouro (AuNP) de 40 e 80 nm funcionalizadas com polietilenimina ramificada catiônica (BPEI), ácido lipóico aniônico (LA) ou polietileno glicol neutro (PEG) interagem com a linhagem de carcinoma hepatocelular humano (HCC) C3A, tanto na presença quanto ausência de coroa protéica de plasma humano (PC). AuNP nuas, exceto 80-nm LA-AuNP, foram citotóxicas para células C3A, mas a PC atenuou significativamente estes efeitos. Captação celular dependente do tempo aumentou para 40-nm BPEI-AuNP, enquanto PC reduziu captação de 80-nm PEG-AuNP. BPEI-AuNP elicitou respostas bifásicas de estresse oxidativo/nitrosativo, enquanto PEG-AuNP atuou como potente antioxidante. Todas as AuNP nuas inibiram atividade de CYP3A4 independentemente de tamanho ou carga superficial, mas PC restaurou atividade exceto para PEG-AuNP. 40-nm PEG-AuNP induziu mudanças de expressão gênica afetando principalmente β-oxidação de ácido graxo mitocondrial e, em menor extensão, transportadores hepáticos de effluxo/captação. Estes achados aprofundam nossa compreensão de interações AuNP-célula e seus fundamentos moleculares em HCC, oferecendo insights para estratégias terapêuticas aprimoradas.

Introdução

Carcinoma hepatocelular (HCC) permanece um dos cânceres mais prevalentes mundialmente e a causa de mortalidade por câncer de crescimento mais rápido nos Estados Unidos. Opções curativas atuais — transplante hepático ou ressecção cirúrgica — são limitadas a doença em estágio inicial, enquanto tumores avançados dependem de quimioterapia ou radioterapia, ambas com baixa seletividade e toxicidade sistêmica significativa. Terapias de silenciamento gênico, particularmente interferência de RNA (RNAi), prometem maior especificidade, mas entrega eficiente requer vetores que penetrem células-alvo com segurança. Enquanto vetores virais oferecem alta eficiência de transdução, plataformas não-virais como nanopartículas (NP) são preferidas por seu perfil de segurança e propriedades físico-químicas ajustáveis. Nanopartículas de ouro (AuNP) são especialmente atraentes devido à sua fácil modificação de superfície e características ópticas, permitindo entrega direcionada de cargas terapêuticas. No entanto, ao entrar na corrente sanguínea, AuNP adquirem uma coroa protéica (PC) que altera sua química de superfície e consequentemente seu destino biológico, incluindo captação celular e toxicidade. Entender como tamanho de NP, carga superficial e PC modulam respostas celulares em células HCC é essencial para projetar nanomedicinas seguras e eficazes.

Métodos

Síntese de Nanopartículas de Ouro

AuNP de 40 e 80 nm foram fabricadas sob encomenda pela nanoComposix (San Diego, CA). Funcionalização com BPEI, LA ou PEG foi alcançada via química EDC, conjugação de ácido diidrolipóico ou PEGilação tiol-metoxi, respectivamente. Tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e potencial zeta foram confirmados por espalhamento dinâmico de luz (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e espectroscopia UV-Vis. AuNP foram purificadas por filtração de fluxo tangencial (TFF) e esterilizadas por filtração.

Preparação da Coroa Protéica

Plasma humano (n=5) da Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) foi misturado com AuNP a 55% (v/v) e incubado a 37 °C, 250 rpm por 1 h. Proteínas fracamente ligadas foram removidas por lavagens repetidas com PBS (20.000 × g, 20 min). As AuNP revestidas com PC resultantes foram ressuspensas em PBS e então diluídas em meio de cultura celular.

Caracterização Físico-Química de AuNP

Diâmetros hidrodinâmicos (D_H), PDI e potencial zeta de AuNP nuas e revestidas com PC foram medidos em água DI, PBS e EMEM completo (10% FBS) a 25 °C e 37 °C (0 e 24 h). Espectros de absorção óptica foram registrados a temperatura ambiente.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

Morfologia de AuNP foi avaliada por MET (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV). Amostras foram depositadas em grades de cobre 200-mesh e secas ao ar.

Cultura Celular e Medição de Viabilidade

Células C3A (ATCC CRL-10741) foram cultivadas em EMEM + 10% FBS, semeadas a 8 × 10⁴ células/poço (placas de 96 poços), e permitidas aderir por 48 h antes da dosagem. Viabilidade foi medida usando ensaio alamarBlue® após 24 h de exposição a concentrações de AuNP variando de 0 a 250 µg/cm².

Medição de Captação Celular por ICP-MS

Células foram tratadas com 1,56 µg/cm² de AuNP por 0,5–24 h. Após etapa de etching para remover partículas ligadas à superfície, células foram digeridas em água régia, e Au intracelular quantificado por ICP-MS. Captação expressa como AuNP por célula.

Medidas de Estresse Oxidativo/Nitrosativo

Produção de ROS/RNS foi quantificada usando kit de ensaio total ROS/SO (Enzo Life Sciences) a 1, 3 e 24 h após exposição a 40-nm BPEI- e PEG-AuNP até 125 µg/cm².

Atividade do Citocromo P450 3A4

Atividade CYP3A4 foi avaliada com ensaio P450-Glo™ (Promega) após 24 h de exposição a concentrações LC₅₀ de cada tipo de AuNP. Luminescência foi normalizada a controles de veículo.

Perfil de Expressão Gênica

Dado os efeitos pronunciados de 40-nm PEG-AuNP, células C3A foram expostas à sua LC₅₀ (129,5 µg/cm²) por 24 h. RNA total (RIN ≥ 7,8) foi isolado, retrotranscrito e analisado pelos arrays Human Molecular Toxicology Pathway Finder e Human Drug Transporters RT² Profiler™ PCR (Qiagen). Genes diferencialmente expressos (|fold change| > 2, p < 0,05) foram validados por qRT-PCR para nove genes representativos.

Análise Estatística

Valores LC₅₀ foram ajustados usando equação de Hill de inclinação variável no GraphPad Prism. ANOVA de uma via (SAS 9.4) seguido pelo teste HSD de Tukey avaliou significância (p < 0,05).

Resultados e Discussão

Caracterização Físico-Química de AuNP Nuas e Revestidas com PC

Conforme mostrado na Figura 1, MET confirmou AuNP monodispersas com tamanhos correspondentes aos 40 e 80 nm nominais. Formação de PC induziu aumento modesto em D_H e deslocamento para o vermelho no pico de plasmon UV-Vis, indicando adsorção de proteína. Em EMEM completo, D_H e PDI permaneceram estáveis por 24 h, exceto para PC-BPEI-AuNP, que exibiu diminuição transitória em PDI, sugerindo estabilidade coloidal aprimorada. Potenciais zeta deslocaram-se para valores neutros após revestimento com PC, refletindo mascaramento de cargas superficiais por proteínas.

Citotoxicidade de AuNP

Valores LC₅₀ para AuNP nuas variaram de 127,3 a 205,5 µg/cm² (Figura 2a). Todos 40-nm BPEI-, LA- e PEG-AuNP, bem como 80-nm BPEI-AuNP, foram citotóxicos, enquanto 80-nm LA-AuNP não mostrou toxicidade significativa. PC reduziu marcadamente citotoxicidade na maioria dos tipos de AuNP, com exceção de 80-nm BPEI-AuNP, que reteve 51% viabilidade a 250 µg/cm² (Figura 2b). Estes achados alinham-se com trabalho prévio mostrando atenuação mediada por PC de toxicidade de AuNP em hepatócitos primários e outras linhagens celulares.

Captação Intracelular de AuNP

Análises de captação dependente do tempo (Figura 3) revelaram que 40-nm BPEI-AuNP acumularam rapidamente, pico a 6 h antes de declinar. Em contraste, PC atenuou captação de 40- e 80-nm BPEI- e LA-AuNP mas aumentou internalização de 80-nm PEG-AuNP. Estas tendências são consistentes com literatura indicando que PC pode tanto dificultar quanto promover entrada de NP dependendo de tamanho, química de superfície e tipo celular.

Medidas de Estresse Oxidativo e Nitrosativo

Ambos tipos de AuNP induziram ROS/RNS de forma dependente de tempo e concentração (p < 0,0001). Altas concentrações de 40-nm BPEI-AuNP produziram resposta bifásica: efeito antioxidante inicial a 1 h, seguido por surto pró-oxidante pronunciado a 3 h e além. Em contraste, 40-nm PEG-AuNP consistentemente suprimiu produção de ROS/RNS (fold change < 0,5) em todos os pontos de tempo, sugerindo papel antioxidante protetor (Figura 4).

Medição de Atividade CYP3A4

Todas as AuNP nuas (40- e 80-nm BPEI, LA e PEG) inibiram atividade CYP3A4 a 20–31% dos níveis de controle em concentrações LC₅₀ (Figura 5). Concentrações não-tóxicas de 80-nm LA- e PEG-AuNP também suprimiram atividade (~30%). PC restaurou amplamente atividade CYP3A4 para todas AuNP exceto PEG-AuNP, que reteve 63% e 46% atividade para partículas de 40- e 80-nm, respectivamente. Estes resultados corroboram relatos prévios de inibição de CYP3A4 mediada por AuNP via interação direta com enzima ou bloqueio de sítio de substrato.

Perfil de Expressão Gênica Focado em Vias de Toxicidade de 40-nm PEG-AuNP

Análise de array gênico identificou 212 genes diferencialmente expressos (186 down-regulados, 26 up-regulados) na LC₅₀ de 40-nm PEG-AuNP (Figura 6). Notavelmente, 12,3% destes genes envolviam β-oxidação de ácido graxo mitocondrial, com enzimas-chave (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) marcadamente suprimidas (fold change 2–18). A down-regulação de enzimas de β-oxidação indica produção prejudicada de NADH/FADH₂, comprometendo ciclo TCA e síntese de ATP, marca de disfunção mitocondrial observada em hepatócitos tratados com AuNP.

Genes de apoptose (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) foram up-regulados, enquanto genes anti-apoptóticos (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) foram down-regulados, consistente com citotoxicidade dependente de dose observada. Pontos de verificação de dano e reparo de DNA (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) mostraram regulação mista, sugerindo integridade genômica prejudicada. Proteínas de choque térmico (HSPA1A/B) foram up-reguladas, enquanto subfamílias HSP40/90/60 foram down-reguladas, refletindo resposta de estresse complexa. Genes antioxidantes (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) foram induzidos, enquanto genes pró-oxidantes (TXNIP, PPP1R15B) foram suprimidos, alinhando-se com fenótipo antioxidante de PEG-AuNP.

Perfil de Expressão Gênica de Transportadores de Captação e Effluxo de Fármacos

Modulação de transportadores de fármacos induzida por PC ressalta implicações farmacocinéticas potenciais. Dos 35 genes de transportadores examinados, 12 transportadores ABC foram down-regulados (ex: ABCB1, ABCC2/3/4, ABCG2/8, ABCA1) e 21 transportadores SLC foram suprimidos (ex: SLC31A1, SLC22A9). Inversamente, MDR4 (ABCB4) e transportador ABC mitocondrial (ABCB6) foram up-regulados, indicando resposta compensatória à exposição a nanopartículas. Estas mudanças podem influenciar concentração intracelular de quimioterápicos e merecem consideração cuidadosa em terapias combinadas.

Validação por PCR em tempo real de nove genes selecionados confirmou resultados do array, reforçando confiabilidade dos dados transcripcionais.

Conclusões

Este estudo demonstra que química de superfície de AuNP e presença de coroa protéica de plasma humano criticamente ditam sua citotoxicidade, captação celular, perfil de estresse oxidativo, inibição de CYP3A4 e mudanças de expressão gênica em células C3A HCC. AuNP nuas BPEI- e LA- foram altamente citotóxicas, enquanto PEG-AuNP exibiu propriedades antioxidantes mas ainda suprimiu atividade CYP3A4. PC largamente mitigou toxicidade e inibição de CYP3A4, exceto para PEG-AuNP, que reteve efeitos significativos. Análise de expressão gênica de 40-nm PEG-AuNP revelou down-regulação predominante de enzimas de β-oxidação de ácido graxo mitocondrial, up-regulação de genes pró-apoptóticos e modulação extensiva de transportadores de fármacos, fornecendo insight sobre potenciais mecanismos de hepatotoxicidade e interações fármaco-nanopartícula. Estes achados ressaltam a importância de considerar formação de coroa protéica e funcionalização de superfície ao projetar terapêuticos baseados em AuNP para HCC.

Abreviações

ANOVA:

Análise de variância de uma via

AuNP:

Nanopartículas de ouro nuas: sem PC

BPEI:

Polietilenimina ramificada

CYP:

Citocromo P450

D _H:

Diâmetros hidrodinâmicos

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

EDTA:

Ácido etilenodiaminotetraacético

EMEM:

Meio essencial mínimo de Eagle

HCC:

Carcinoma hepatocelular humano

HPTC:

Células tubulares proximais renais humanas

HSD:

Teste de diferença significativa honesta de Tukey

HUVEC:

Células de veia umbilical humana

ICP-MS:

Espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente

LA:

Ácido lipóico aniônico

LC₅₀:

Concentração letal mediana

MDR:

Multirresistência a fármacos

NP:

Nanopartículas

PBS:

Salina fosfatada tamponada

PC:

Coroa protéica de plasma humano

PDI:

Índice de polidispersidade

PEG:

Polietileno glicol neutro

RNAi:

Interferência de RNA

RNS:

Espécies reativas de nitrogênio

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

SO:

Superóxido

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

TFF:

Filtração de fluxo tangencial