Detecção baseada em nanopartículas de ouro de AGEs de baixo peso molecular de amostras de hemoglobina A0 glicada in vitro

Resumo

A glicação de proteínas é um importante evento bioquímico que ocorre no plasma de pacientes diabéticos devido ao aumento dos níveis de açúcar. A glicação extensiva leva à formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) que são bem conhecidos por terem efeitos prejudiciais em pacientes diabéticos. No presente trabalho, temos glicado a proteína fisiologicamente importante Hemoglobina A0 in vitro para estudar a formação e atividade de AGE usando-os como um modelo para a síntese de nanopartículas de ouro (GNPs). Verificou-se que a ressonância plasmônica de superfície de GNPs sintetizados apresentou alta correlação com a extensão da glicação. No fracionamento, a hemoglobina A0 glicada segregou em duas populações distintas de produtos, uma consistindo em fragmentos maiores proteicos reticulados de hemoglobina A0 e uma segunda população de AGEs não proteicos de baixo peso molecular. Apenas AGEs de baixo peso molecular contribuíram para a síntese de GNPs ao usar as frações como um modelo, substanciando o princípio do ensaio baseado em GNP proposto. Devido à sua importância fisiológica, os AGEs podem ser usados ​​como meio de diagnóstico para diabetes e suas complicações associadas. Neste estudo, empregamos a alta reatividade dos AGEs para o desenvolvimento de um novo sensor colorimétrico baseado em GNP para permitir sua detecção. Nosso sensoriamento baseado em GNP proposto pode ter alto significado clínico na detecção de diabetes e suas complexidades associadas.

Histórico

O diabetes mellitus tipo II (DM2) é um distúrbio metabólico complexo caracterizado pela presença de níveis elevados de açúcar no sangue. A hiperglicemia que persiste no corpo inicia uma série de reações químicas e bioquímicas e a reação mais importante que ocorre durante o curso da hiperglicemia é conhecida como reação de Maillard, que envolve uma reação não enzimática entre açúcares e proteínas para formar uma aldimina reversível (base de Schiff) ligação. A base de Schiff relativamente instável tautomeriza em sua forma cetônica mais estável, que também é conhecida como o 'Produto Amadori' [1]. Os produtos Amadori, também conhecidos como produtos intermediários de glicação ou produtos de glicação precoce, sofrem rearranjos de grupo, ciclização, desidratação e reações de degradação para formar uma variedade de compostos químicos. Esses compostos são conhecidos por serem potenciais reticulantes de proteínas e agentes glicosilantes [2]. Eles são suscetíveis a degradação adicional levando à formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) [3]. Em altas concentrações endógenas, os AGEs contribuem para as complicações do diabetes [4] por indução de ligações cruzadas de proteínas ou por meio de transdução de sinal intracelular mediada por receptor (RAGE), levando ao estresse oxidativo e inflamação [5, 6]. Também é conhecido por estar associado a doenças cardiovasculares [7, 8], nefropatias [9, 10], retinopatias [11, 12], envelhecimento [13, 14], artrite, câncer [15,16,17], doenças neurodegenerativas como Alzheimer [15] e desenvolvimento de depressão [18]. Além da reação de Maillard, várias outras vias, incluindo a oxidação da glicose, a peroxidação de lipídios e a via do poliol, também levam à formação de AGEs [19, 20] in vivo. Além disso, a ingestão dietética de certos itens alimentares que são conhecidos por serem ricos em AGEs também contribuem para o total de AGEs dentro do corpo [6].

Embora a maioria dos produtos AGE tenham um elemento estrutural comum [21], as estruturas químicas exatas de centenas de AGEs ainda não foram identificadas [22]. Apesar de sua heterogeneidade, a formação de ligações cruzadas covalentes com a proteína e o "efeito de escurecimento" são típicos para todos os AGEs conhecidos [23]. Os adutos envolvendo açúcar e proteína que são formados no estágio inicial da glicação são chamados de adutos de glicação precoce. A frutosilisina e a frutosamina são exemplos de tais estruturas e são potenciais reticulantes [24,25,26]. Algumas das idades amplamente estudadas incluem N -carboximetil-lisina (CML), N -carboxietil-lisina (CEL) [27], pentosidina [28], glucosepano [29], pirralina, Argpiramidina, Crossline e Vesperlisina C [30].

Os estudos sobre o papel dos AGEs na progressão do diabetes, envelhecimento e complicações associadas estão em alta e foram relatados como um bom biomarcador para os respectivos estudos [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224] [ 31,32,33,34]. No entanto, a complexidade e heterogeneidade na estrutura dos AGEs é um grande obstáculo no desenvolvimento de um sistema de detecção universal [35]. A análise qualitativa de AGEs é geralmente feita através de técnicas espectroscópicas e colorimétricas [36] nas quais a evolução dos produtos da reação de Maillard é monitorada medindo o aumento da absorção de luz a 280 nm, que corresponde aos produtos iniciais da reação de Maillard [37], ou medindo a emissão de fluorescência em 450 nm [38,39,40,41,42]. Estudos para a identificação de produtos distintos de AGE ainda estão em andamento; no entanto, algumas tentativas foram feitas para a quantificação de pentosidina [43] e carboximetil lisina [44]. A maioria dos AGEs foi estudada no nível do tecido por imuno-histoquímica e quantificação baseada em ELISA usando uma gama de anticorpos poli- e monoclonais [21, 45]. A melhor técnica analítica disponível até o momento para a detecção de AGE é a cromatografia líquida ou gasosa seguida por detecção espectrofotométrica ou espectrométrica de massa [12, 46,47,48,49]. A análise quantitativa dos AGEs ainda é um grande desafio técnico e as poucas técnicas disponíveis para os mesmos são caras e, portanto, limita seu uso em aplicações de ponto de atendimento. O desenvolvimento de novas estratégias para a avaliação qualitativa e quantitativa dos AGEs é a necessidade do momento, devido às suas implicações em doenças potencialmente fatais.

Grandes esforços têm sido colocados no desenvolvimento de sensores colorimétricos devido à sua simplicidade na detecção, rápido tempo de resposta e custo-benefício, especialmente para aplicações biológicas [50]. Entre eles, os sensores baseados em ressonância plasmônica de superfície (SPR) são de particular interesse devido à sua alta sensibilidade de detecção [51]. No presente estudo, exploramos as propriedades ópticas das nanopartículas de ouro (GNPs) para a identificação qualitativa de produtos de AGE. Os GNPs são conhecidos por seu SPR único e ajustável e, portanto, evoluíram como um repórter colorimétrico para a detecção de várias biomoléculas. Sensores ópticos baseados em GNPs incluem aqueles para analitos químicos pequenos [52], açúcares [53], proteínas diferentes [54], agregados de proteínas [55] e variantes conformacionais de uma proteína [56]. Anteriormente, mostramos que os GNPs quando semeados em um modelo de proteína glicada podem responder ao avanço da glicação [57]. Aqui, estendemos este conceito para a detecção qualitativa de diferentes produtos de glicação colorimetricamente, empregando a propriedade redutora exibida pelos AGEs. Resumidamente, HbA0 foi glicada in vitro, usando frutose como o açúcar redutor, a formação de AGE e as mudanças estruturais associadas na estrutura da proteína foram confirmadas usando espectroscopia. A Hb glicada foi fracionada por cromatografia de filtração em gel para separar os produtos com base no peso molecular e os GNPs foram sintetizados a partir das frações obtidas. Apenas os produtos AGE não proteicos direcionaram a síntese de nanoestruturas de ouro, possibilitando sua identificação.

Evidências crescentes apóiam o envolvimento de diferentes produtos de glicação em doenças, incluindo diabetes, envelhecimento, Alzheimer, doenças renais, aterosclerose e diferentes tipos de câncer. Nossos resultados acentuam o uso de GNPs como uma plataforma de detecção colorimétrica simples e altamente sensível para a identificação de diferentes produtos AGE que podem estar implicados no prognóstico de complicações de saúde associadas ao diabetes.

Métodos

Materiais

A hemoglobina A0 (HbA0) e o Sephadex (G25) foram obtidos na Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Tetracloroaurato de hidrogênio (III) tri-hidratado (HAuCl ₄ .3H ₂ O) foi adquirido na Loba Chemie. Frutose, di-hidrogenortofosfato de potássio, ortofosfato de hidrogênio dipotássico, ortofosfato de sódio di-hidrogenado, ortofosfato de hidrogênio dissódico, ferricianeto de potássio, ácido tricloroacético, cloreto férrico, ácido nítrico (HNO ₃ ), ácido clorídrico (HCl), acrilamida, bis acrilamida, persulfato de amônio, TEMED, dodecil sulfato de sódio, Coomassie Brilliant Blue, glicerol, ditiotreitol, base TRIS e outros produtos químicos usados ​​eram de grau analítico e usados ​​sem purificação adicional. Água ultrapura MilliQ (> 18 MΩ) foi usada para todos os experimentos.

Métodos

Glicação de HbA0

Soluções estoque de HbA0 e frutose foram preparadas em tampão de fosfato de potássio autoclavado (0,1 M, pH 7,4) e filtradas usando filtros de seringa de 0,2 μm antes do uso. Amostras de HbA0 foram incubadas com diferentes concentrações de frutose por diferentes períodos de tempo (1 a 10 dias) em uma incubadora a 37 ° C. As concentrações finais de frutose e HbA0 foram de 0,1 M e 1 mg mL ⁻¹ respectivamente. Também foram mantidos controles de HbA0 e frutose, que estavam nas mesmas concentrações. As amostras que foram glicadas por 10 dias são marcadas com um prefixo de ‘Dia 10’ e as amostras de controle que não foram incubadas são marcadas com o prefixo ‘Dia 0’. Todos os experimentos foram realizados em condições estéreis em uma capela de fluxo de ar laminar.

Reduzindo o ensaio de propriedade

As propriedades redutoras das amostras glicadas foram determinadas pelo método descrito por Gu. et al. [37] com pequenas modificações. Em seguida, 100 μL das amostras glicadas e seus respectivos controles de proteína e açúcar foram misturados com 1 mL de tampão de fosfato de sódio 0,2 M e 1 mL de ferricianeto de potássio a 1%. As misturas foram incubadas a 50 ° C em banho-maria durante 20 min. Após arrefecimento da mistura até à temperatura ambiente, foi adicionado 1 mL de ácido tricloroacético a 10%. A 1 mL desta mistura, foram adicionados 1 mL de água MilliQ e 200 mL de cloreto férrico 0,1%. A absorvância da mistura resultante foi medida a 700 nm. Um controle negativo foi mantido no qual tampão de fosfato 0,1 M foi adicionado no lugar da amostra glicosilada e isso serviu como um branco para medições de absorvância. Quanto maior a absorbância em 700 nm, maior será sua propriedade redutora.

Cromatografia de filtração em gel do dia 0 Fruc-Hb e do dia 10 Fruc-Hb usando Sephadex (G25)

Resumidamente, contas de Sephadex (G25) foram embebidas em água MilliQ durante a noite e, em seguida, empacotadas em uma coluna de vidro de 15 cm de comprimento, 1 cm de diâmetro e 15 mL de volume interno. No início, a coluna foi lavada com grande quantidade de água MilliQ seguida por tampão de fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,4). Aproximadamente 600 μL da amostra de Fruc-Hb foram carregados na coluna após equilibrar a mesma com tampão de fosfato. A eluição foi realizada com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 7,5 mL por hora. As frações foram coletadas uma vez que a amostra carregada cruzou aproximadamente 10 cm de distância da coluna. Aproximadamente 30 frações foram coletadas de cada uma das amostras e posteriormente caracterizadas. Aqui, o dia 0 Fruc-Hb e as frações derivadas dele serviram como um controle contra a amostra do dia 10 Fruc-Hb e suas respectivas frações.

Síntese de nanopartículas de ouro

Todas as vidrarias utilizadas para a síntese do GNP foram lavadas com Aqua Regia (HCl:HNO ₃ em uma proporção de 3:1 por volume) e enxaguado com etanol e água ultrapura antes do uso ( Atenção! Aqua Regia é um agente oxidante muito corrosivo que deve ser manuseado com muito cuidado ) A síntese dos GNPs foi realizada, explorando a propriedade redutora dos produtos de glicação da Hb. Em um experimento típico realizado em temperatura ambiente (RT), 32 μL de solução aquosa de HAuCl ₄ (1% w / v ) foi adicionado a 3,868 mL de água MilliQ sob agitação constante. Após a dissolução completa do sal de ouro, a solução torna-se amarelo pálido. Em seguida, 50 μL da amostra necessária de Fruc-Hb ou 100 μL da fração foram adicionados à solução de sal de ouro. Uma vez que todos os reagentes foram completamente misturados, a agitação foi interrompida e a mistura de reação foi deixada sem perturbação para permitir o crescimento de GNPs. Na mistura de reação final, a concentração da amostra de Fruc-Hb foi de 12,5 ng μL ⁻¹ (12,5 μg mL ⁻¹ ) e o da fração era de 1 ng μL ⁻¹ (1 μg mL ⁻¹ ) (Os cálculos detalhados são fornecidos em S6). Cores variando de rosa a roxo desenvolveram-se nas misturas de reação, dependendo da amostra adicionada. Todas as amostras foram mantidas até que a cor da mistura de reação se estabilizou e nenhuma alteração adicional foi observada.

Ensaio de Bradford

As frações coletadas das amostras de Fruc-Hb foram analisadas quanto à presença ou ausência de proteína usando o ensaio de Bradford. Resumidamente, a cada um dos 20 μL de frações não diluídas, cerca de 200 μL de reagente de Bradford foram adicionados e a absorbância foi medida a 595 nm e 450 nm [58]. A razão de OD em 595 nm a 450 nm foi representada graficamente contra o número da fração e uma razão mais alta indicou uma porcentagem relativamente maior da proteína.

Espectroscopia

Espectroscopia UV-Visível

Os espectros de UV-visível de todas as amostras de Fruc-Hb, seus respectivos controles e as frações cromatográficas das amostras glicadas foram registrados em um espectrômetro Perkin Elmer, Lambda 25 UV-Visible. Os espectros foram obtidos executando uma varredura de 800 a 200 nm com uma velocidade de varredura de 240 nm / min e largura de fenda de 1 nm. Todas as medições foram feitas usando cubetas de quartzo de 1 cm de comprimento de trajeto e 1 mL. Os espectros de UV-Visível de GNPs também foram registrados de maneira semelhante.

Espectroscopia de fluorescência

Para identificar alterações estruturais de proteínas e formação de AGE, os perfis de emissão de fluorescência de amostras Fruc-Hb e as frações do dia 0 Fruc-Hb e dia 10 Fruc-Hb foram realizados usando o espectrofotômetro de fluorescência Agilent Technologies Cary Eclipse. As larguras da fenda de excitação e emissão foram definidas para 5 nm e os espectros foram obtidos usando uma cubeta de quartzo com comprimento de caminho de 1 cm. As amostras foram excitadas a 280 nm e 350 nm para verificação da fluorescência do triptofano / fluorescência da proteína intrínseca e fluorescência do AGE, respectivamente [34,35,36,37,38].

Espectroscopia de dicroísmo circular

As alterações da estrutura secundária nas amostras de Fruc-Hb foram identificadas por espectroscopia de dicroísmo circular. As medições foram realizadas usando espectrômetro de dicroísmo circular (CD) com Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, UK). Os espectros foram obtidos no ultravioleta distante, variando de 190 a 260 nm.

Para todas as medições de espectroscopia, amostras de Fruc-Hb de 0,1 mg mL ⁻¹ concentração foram utilizadas e as frações do dia 0 Fruc-Hb e dia 10 Fruc-Hb foram analisadas sem qualquer diluição. O tampão de fosfato de potássio (pH 7,4, 10 mM) serviu como um branco em todos os experimentos. Todas as leituras foram feitas em triplicado à temperatura ambiente.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

Para identificar o tamanho e a estrutura dos GNPs sintetizados a partir das amostras de Fruc-Hb e seus respectivos controles, análises de microscopia eletrônica foram realizadas usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM) –JEOL 2100F. Os GNPs foram concentrados por centrifugação a 6000 rpm e foram moldados por gota em grades de carbono revestidas com cobre de tamanho de malha 300. As amostras foram deixadas secar durante a noite à temperatura ambiente antes da análise.

Perfil de intensidade de cor dos PNB

A fim de expressar a cor dos GNPs em valores mensuráveis, (RB) / G ((intensidade do vermelho - intensidade do azul) / intensidade do verde) foi calculado pela extração de planos de cores vermelho, azul e verde de cada um dos colóides de ouro usando uma cor digital metro.

Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS

A eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS PAGE) foi realizada para verificar as diferenças no peso molecular de HbA0, após a glicação. Os controles de HbA0 do dia 0, dia 10 e Fruc-Hb do dia 0 e dia 10 foram misturados com SDS a 10% contendo tampão de carregamento 6X e fervidos por 5 min após o qual 30 μL das amostras foram carregadas no gel fundido (gel de empilhamento - 5%; gel de resolução - 12%). As amostras foram executadas junto com a escada de proteína pré-corada 10-175 kDa PiNK Plus (Cat No. PM005 0500) a 100 V usando o sistema Mini PROTEAN Tetrad da Bio-Rad. Os géis foram visualizados sob a fonte de luz branca de um iluminador Bio-Rad Trans.

Resultados

Síntese de GNP a partir de frutose, hemoglobina A0 e hemoglobina glicosilada A0

É conhecido que o açúcar redutor de glicose reage com HbA0 in vivo para produzir HbA1c, o conhecido aduto de glicação precoce que é um importante biomarcador para os níveis hiperglicêmicos associados ao diabetes [59]. Para atingir uma cinética de glicação mais rápida e alto acúmulo de AGE in vitro, a frutose é usada no lugar da glicose, que é um agente de glicose potente em comparação com o último [55,56,57,58,59,60]. Em nosso estudo, realizamos a glicação da hemoglobina A0 usando frutose como açúcar redutor e a glicação foi monitorada por até 10 dias, o que é relatado como bom o suficiente para a formação substancial de AGE [57]. A Figura 1 ilustra a formação de AGEs nas amostras de HbA0 após 10 dias de incubação com frutose in vitro. A formação de AGE foi avaliada medindo qualitativamente a emissão de fluorescência a 450 nm após excitação a 350 nm [38,39,40,41,42]. O aumento de mais de dez vezes na emissão de fluorescência em 450 nm confirmou a formação de produtos AGE em HbA0 glicosilada (dia 10 Fruc-Hb) em comparação com a HbA0 não glicosilada (dia 0 Fruc-Hb - mistura física de HbA0 e frutose sem incubação). A caracterização biofísica detalhada das amostras é discutida no arquivo adicional 1 (S1 e S2).

Formação de AGEs medido por geração de fluorescência a 450 nm quando a hemoglobina é incubada com frutose por 10 dias. Comparação da emissão de fluorescência de 450 nm no dia 0 Fruc-Hb e no dia 10 Fruc-Hb

A fim de usar GNPs como um sensor colorimétrico para AGEs derivados da glicação de proteínas, era um pré-requisito estudar a cinética de formação de GNPs a partir dos reagentes de açúcar e proteína. Já foi relatado que a frutose e a hemoglobina A0 direcionam a síntese de nanoestruturas de ouro [53, 61,62,63] quando usadas sozinhas ou em combinação com um forte agente redutor. No entanto, para entender a diferença na cinética de formação, comparamos os GNPs sintetizados a partir de Fruc-Hb, frutose e HbA0 incubados por 0 e 10 dias, respectivamente, na ausência de um agente redutor adicional. A propriedade de redução desses modelos foi medida bioquimicamente de acordo com o protocolo descrito na seção de métodos. No geral, as amostras do dia 10 mostraram propriedade de redução mais alta do que as amostras do dia 0, e Fruc-Hb exibiu a propriedade de redução máxima seguida por frutose e HbA0 em ambos os casos, o que poderia ser atribuído à presença de AGEs em amostras de Fruc-Hb ( Fig. 2a). Destas amostras, em uma concentração típica, apenas o dia 10 Fruc-Hb contribuiu para a síntese de GNPs estáveis ​​(Fig. 2b) ao final de 4 dias, enquanto o resto das amostras só puderam fazê-lo quando foram autorizados a ser mantido por um período prolongado (normalmente mais de 10 dias) e os resultados estão de acordo com as propriedades de redução obtidas das amostras (dados não mostrados). O espectro de absorção de luz visível do dia 10 Fruc-Hb_GNPs gerou um pico em torno de 530 nm (Fig. 2c) e as partículas também foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), para estudar o tamanho e morfologia (Fig. 2d). A micrografia eletrônica mostrou a presença de partículas esféricas com diâmetro médio de 21,930 ± 2,4 nm (Fig. 2e). Além disso, as partículas eram de natureza policristalina com pontos de rede correspondentes a 111, 200, 220, 311 planos de uma rede de fcc (Fig. 2f). Uma análise cinética detalhada da formação de GNP de amostras diferencialmente glicadas é fornecida em S3.

Caracterização da formação de AGE e síntese de GNP a partir de amostras de HbA0, frutose e Fruc-Hb. a Propriedades redutoras de HbA0, frutose, Fruc-Hb de 0 e 10 dias de incubação respectivamente medidas pelo teste de redução do íon férrico. b Fotografias de PNB sintetizadas a partir das respectivas amostras. c Espectro de absorção UV-visível para o dia10 Fruc-Hb_GNPs. d Micrografia eletrônica de transmissão do dia10 Fruc-Hb_GNPs (barra de escala:20 nm). e Distribuição de tamanho das partículas e f SAED para as partículas

Aqui, Fruc-Hb atua tanto como um molde quanto como estabilizador para direcionar a síntese de nanoestruturas de ouro de forma esférica. Uma vez que apenas o dia 10 Fruc-Hb permite a síntese de partículas em um tempo estipulado em comparação com as contrapartes de açúcar e proteína, este mecanismo pode ser usado para diferenciar entre um modelo de proteína glicada e não glicada.

O fracionamento de Fruc-Hb resolve duas classes distintas de produtos de glicosilação

Foi interessante ver se os AGEs ou as alterações no esqueleto da proteína são responsáveis ​​pela resposta SPR diferencial observada nos GNPs semeados no modelo de Fruc-Hb do dia 10. Para investigar melhor, fracionamos o dia 10 Fruc-Hb e o dia 0 Fruc-Hb usando cromatografia de filtração em gel, conforme descrito na seção de métodos. As frações derivadas do dia 0 Fruc-Hb serviram como controle contra as frações do dia 10 Fruc-Hb. A Figura 3 resume a caracterização espectroscópica das frações. A Figura 3a mostra os perfis de eluição das frações coletadas do dia 0 Fruc-Hb (vermelho) e do dia 10 Fruc-Hb (preto). O perfil de eluição característico obtido para o fracionamento de Fruc-Hb é consistente com os relatórios anteriores [37].

Perfil de eluição das frações do dia 0 Fruc-Hb (vermelho) e do dia 10 Fruc-Hb (preto). Perfil de absorbância de UV medido em 280 nm ( a ) e ensaio de Bradford para a presença de proteínas ( b ) de frações do dia 0 Fruc-Hb e dia 10 Fruc-Hb

A presença de proteína nas frações do dia 0 e dia 10 foi confirmada pela absorção da luz ultravioleta a 280 nm pelos aminoácidos aromáticos presentes na proteína. O perfil de eluição do dia 10 Fruc-Hb medido por absorção de luz a 280 nm mostra a presença de duas populações de produtos marcados I e II. A população I, que consiste em produtos de alto peso molecular, varia da fração no. 5 a 12 e fração no. 15 em diante correspondendo a produtos de baixo peso molecular caem na população II. Uma pequena faixa abrangendo 2–3 frações foi observada entre I e II, onde nenhuma absorção de UV foi observada. Por outro lado, uma única população de frações do dia 0 Fruc-Hb apresentou absorção de luz UV (população I), confirmando que a absorção na região II nas frações do dia 10 é pelos produtos gerados no dia 10 Fruc-Hb como resultado de glicação. Já foi relatado que os intermediários da reação de Maillard absorvem luz na faixa próxima do UV [64], o que apóia a observação. A absorção aprimorada de luz UV em 280 nm por frações do dia 10 em comparação com as frações do dia 0 pode ser devido ao extenso desdobramento da proteína como resultado da glicação, resultando na exposição de aminoácidos aromáticos (Fig. 3a).

A glicação altera consideravelmente as estruturas secundárias e quaternárias da proteína, conforme discutido em S1. Para confirmar o estado estrutural da proteína nas frações, realizamos a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS das frações e descobrimos que, no lugar das bandas monoméricas e diméricas, bandas fundidas foram observadas confirmando a reticulação da proteína na amostra de Fruc-Hb do dia 10 (Arquivo adicional 1:Figura S4).

Ao comparar os perfis de eluição do dia 0 Fruc-Hb e do dia 10 Fruc-Hb, discernimos que as frações que caem na população I são de natureza proteica e a segunda população que estava completamente ausente nas frações do dia 0 (não glicosadas) consiste em produtos de glicação não proteicos. Estas descobertas são apoiadas pela estimativa de proteína pelo ensaio de Bradford, onde a natureza proteica das frações na população I de ambos os dias 0 e 10 Fruc-Hb foi confirmada (Fig. 3b). Resumidamente, o fracionamento do dia 10 Fruc-Hb por cromatografia de filtração em gel produziu duas populações diferentes de frações, ambas absorvendo luz a 280 nm, sendo uma de natureza proteica e a outra não proteica.

Os produtos de glicação proteica e não proteináceos são fluorescentes na natureza

Tendo compreendido a eluição dos produtos de glicação de natureza proteica e não proteica, a emissão de fluorescência dessas frações foi medida a 450 nm para caracterizar a presença de produtos AGE. Semelhante ao perfil de eluição de UV, duas populações de emissão de fluorescência são observadas para as frações do dia 10, mas nenhuma das frações do dia 0 exibiu emissão de fluorescência a 450 nm, uma vez que nenhuma formação de AGE ocorreu no dia 0 Fruc-Hb (Fig. 4). A intensidade da fluorescência variou significativamente entre as frações do dia 10, indicando a natureza química diferencial dos produtos de glicação. No perfil de eluição de fluorescência, os eluídos iniciais pertencentes à população I consistiram em produtos de glicação de alta intensidade de fluorescência. Isso, juntamente com a estimativa de proteína mostrada na Fig. 3, sugere a eluição de produtos de glicação altamente fluorescentes que compreendem estruturas proteicas nessas frações. A segunda população exibiu emissão de fluorescência de menor intensidade em relação às frações iniciais. Verificou-se que eram de natureza não proteica (Fig. 3b), mas capazes de absorver luz ultravioleta a 280 nm (Fig. 3a).

Comparação da fluorescência de AGE nas frações Fruc-Hb do dia 0 e do dia 10 Fruc-Hb expressas como a intensidade da emissão de fluorescência a 450 nm

Levando em consideração a absorção de UV (Fig. 3) e a emissão de fluorescência das frações do dia 10 (Fig. 4), é evidente que o fracionamento diferencia duas classes diferentes de produtos de glicação de HbA0. A população de frações que é eluída da coluna G25 inicialmente é de alto peso molecular, de natureza proteica e emite forte fluorescência a 450 nm. A segunda classe de produtos são estruturas não proteicas de baixo peso molecular, emitindo fluorescência a 450 nm, mas de intensidade comparativamente mais baixa. Uma vez que ambos os produtos exibem fluorescência 'AGE', as estruturas proteicas podem ser os produtos AGE reticulados ao esqueleto da proteína que são formados inicialmente durante a reação de Maillard e as frações da segunda população podem ser os produtos tardios da glicação que são formados como resultado da degradação das ligações cruzadas AGE-proteína.

GNPs semeados em frações da amostra Fruc-Hb permite a diferenciação entre os produtos de glicação

É evidente que a síntese de GNPs pode ser usada para diferenciar entre um modelo glicado e não glicado (Fig. 2). Agora, para investigar se os GNPs podem diferenciar entre os elutos proteicos e não proteicos a partir do dia 10 Fruc-Hb, sintetizamos os GNPs usando as frações obtidas a partir do dia 10 Fruc-Hb conforme descrito nos métodos. A cor dos PNB formados foi monitorada até que todas as amostras se tornassem estáveis.

Como mostrado na Fig. 5, nenhuma das frações consistindo de estruturas proteicas (população I) exibiu formação de GNP notável, enquanto as frações contendo produtos AGE não proteicos (população II) produziram GNPs estáveis ​​exibindo uma gama de cores em solução coloidal. A formação de GNPs foi caracterizada pelo uso de espectroscopia UV-Visível e os máximos de absorbância foram plotados contra os números das frações. Os dados da espectroscopia apoiam bem o perfil de cores do PNB visualizado. Estes dados concluem que a diferenciação do modelo de proteína glicada do modelo de proteína não glicada com base no mecanismo de detecção baseado em GNP é mediada pelos produtos de AGE de baixo peso molecular e o mesmo mecanismo pode ser usado para distinguir entre os protéicos e não -produtos de glicação proteica.

Síntese de GNP a partir das frações Fruc-Hb do dia 10. O perfil colorimétrico dos GNPs sintetizados a partir das frações do dia 10 e seus máximos de absorção plotados contra o número da fração

A cinética da detecção colorimétrica baseada no GNP pode ser aprimorada para maiores extensões simplesmente aumentando as concentrações de Fruc-Hb e sal de ouro, reduzindo assim o tempo de resposta. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Conclusions

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Abreviações

AGEs:

Advanced glycation end products

Fruc-Hb:

Glycated Hb

GNPs:

Gold nanoparticles

HbA0:

Haemoglobin A0

SPR:

Ressonância de plasmon de superfície

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