Nanobastões de Ouro Revestidos com Albumina Sérica Bovina Permitem Terapia Fototérmica NIR-II de Baixa Dose

Resumo

A segunda janela do infravermelho próximo (NIR-II, 1000–1300 nm) oferece penetração tecidual incomparável, posicionando-a como o regime óptico ideal para imagem e terapia fototérmica. No entanto, criar nanobastões de ouro que absorvam nesta banda mantendo baixa citotoxicidade permanece desafiador. Projetamos uma série de nanobastões de ouro de alto aspecto exibindo robusta ressonância de plasmão de superfície através da janela NIR-II. O revestimento destes nanobastões com albumina sérica bovina (BSA) aumentou dramaticamente sua biocompatibilidade sem comprometer o desempenho óptico. Em um modelo murino de câncer de mama, os nanobastões revestidos com BSA alcançaram ablação tumoral completa usando intensidade modesta de laser NIR-II de apenas 0,75 W cm⁻². Estes resultados confirmam que terapia fototérmica NIR-II de baixa dose é viável com nanobastões de ouro de grande aspecto.

Introdução

Nanopartículas de ouro (AuNPs) emergiram como agentes versáteis em pesquisa biomédica devido à sua excepcional biocompatibilidade e baixa citotoxicidade. Sua alta atenuação de raios-X as torna atraentes para imagem de tumores por tomografia computadorizada (TC) [1, 2], enquanto sua pronunciada ressonância de plasmão de superfície (SPR) permite conversão eficiente fóton-para-calor para terapia fototérmica (PTT) [3, 4]. AuNPs com tamanho e morfologia ajustáveis — nanobastões, nanocascas, nanogaias — foram adaptados para ablação de câncer, particularmente nanobastões de ouro (AuNRs) cuja anisotropia proporciona forte absorção NIR e estabilidade fototérmica [5–8]. Luz NIR penetra tecidos mais profundamente que luz visível, e comprimentos de onda maiores experimentam espalhamento reduzido [9]. Partículas em forma de bastão também exibem permeabilidade tumoral aprimorada e circulação prolongada, aumentando acumulação [10, 11]. No entanto, PTT convencional frequentemente requer lasers de alta potência, arriscando dano colateral [12]. A janela NIR-II oferece penetração mais profunda e menor espalhamento que NIR-I, permitindo terapia eficaz em menores intensidades de laser [13–17]. Ainda, produzir AuNRs que absorvam em NIR-II mantendo biocompatibilidade é difícil. Aqui, relatamos uma síntese sem sementes de AuNRs com picos de absorção a 1000–1300 nm, seguida de revestimento com BSA para reduzir citotoxicidade. Avaliamos seu desempenho fototérmico in vitro e in vivo, demonstrando ablação tumoral em modelo murino de câncer de mama com intensidade de laser tão baixa quanto 0,75 W cm⁻².

Materiais e Métodos

Materiais

Cloreto de ouro tri-hidratado (HAuCl₄·3H₂O, 99,9 %), brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB, 99 %), ácido nítrico (GR 65–68 %), peróxido de hidrogênio (30 %), borohidreto de sódio (NaBH₄, 97 %), nitrato de prata (AgNO₃, 99,8 %), ácido clorídrico (38 %), hidroquinona (99 %), albumina sérica bovina (BSA, 98 %) foram obtidos da Shanghai Aladdin Biological Technology Co. Ltd. RPMI 1640, Penicilina-Estreptomicina, PBS, soro fetal bovino (FBS), células 4T1 e Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) foram obtidos da HyClone, Corning, Gibco e Dojindo, respectivamente. Água ultrapura (Millipore) foi usada throughout.

Preparação de AuNR@CTAB

AuNRs foram sintetizados via protocolo sem sementes. Brevemente, 0,4 mL de 10 mM HAuCl₄ e 10 mL de 0,1 M CTAB foram combinados com 23–33 µL de 100 mM AgNO₃. Adição subsequente de 10–30 µL de 1,2 M HCl e 525 µL de 0,1 M hidroquinona resultou em solução de crescimento amarelo-clara. Após 15 min de agitação, 10–40 µL de NaBH₄ 10 mM recém-preparado em gelo foi injetado, seguido por 30 s de agitação e envelhecimento de 18 h à temperatura ambiente. AuNR@CTAB foi purificado por duas lavagens com PBS.

Preparação de AuNR@BSA

Concentração de CTAB em AuNR@CTAB foi ajustada para 1 mM e sonicada para dissolver completamente. 3 mL de AuNR@CTAB foi misturado com 3 mL de BSA 10 mg mL⁻¹ e sonicado por 30 min. Após centrifugação (9500 × g, 40 min), o pellet foi ressuspenso em 6 mL de BSA 5 mg mL⁻¹, pH ajustado para 11–12 com 2 M NaOH, e agitado por ≥18 h. AuNR@BSA final foi purificado por duas lavagens com PBS e armazenado em PBS.

Caracterização

Microscopia eletrônica de transmissão (MET, Talos F200X) avaliou morfologia; espalhamento dinâmico de luz (DLS, Zetasizer Nano ZS) mediu tamanho e potencial zeta; espectroscopia UV-Vis (Shimadzu UV-2700) registrou absorção. Distribuição tumoral in vivo foi examinada por MET de seções tumorais excisadas pós-injeção. Análises FT-IR e XRD (Beijing Zhongke Baice Co.) confirmaram revestimento de BSA e ouro cristalino, respectivamente.

Desempenho Fototérmico

Soluções de AuNR (OD = 0,5–2 a 1064 nm) foram irradiadas com laser de 1064 nm (0,35–1 W cm⁻²) por 30 min, e mudanças de temperatura foram monitoradas por imagem térmica infravermelha (FLUKE TI25). Fotoestabilidade foi avaliada por ciclos repetidos de 10 min ligado/desligado a 0,5 W cm⁻².

Citotoxicidade In Vitro

Células 4T1 foram semeadas em placas de 96 poços (5 × 10³ células poço⁻¹) e incubadas 24 h. AuNR@CTAB ou AuNR@BSA (10 µL) foi adicionado em concentrações variadas, seguido por 24 h de incubação. CCK-8 (10 µL) foi adicionado, incubado 40 min, e absorbância medida a 450 nm. Ensaios de fototoxicidade envolveram irradiação de 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min) antes do teste CCK-8.

Estudos em Animais

Camundongos BALB/c fêmeas (6–8 semanas) foram inoculados subcutaneamente com 2 × 10⁶ células 4T1. Quando tumores atingiram ~100 mm³, experimentos começaram. Todos os procedimentos seguiram diretrizes éticas institucionais.

Biodistribuição e Circulação In Vivo

AuNR@BSA (200 µL) foi injetado via veia da cauda. Amostras de sangue foram coletadas a 0,25, 2, 4, 6, 8, 12, 36 e 48 h, digeridas com HNO₃ e H₂O₂, e teor de Au quantificado por ICP-OES. Órgãos (coração, fígado, baço, pulmão, rim) foram colhidos 24 h pós-injeção, digeridos, e concentrações de Au medidas similarmente.

Eficiência do Tratamento Fototérmico

Camundongos foram divididos em quatro grupos: (1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + laser, (3) apenas laser, (4) controle. AuNR@BSA (200 µL) foi injetado intratumoralmente, seguido 10 min depois por irradiação de 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min). Temperatura do tumor, volume e peso corporal foram monitorados por 14 dias. Tumores foram excisados no final do estudo.

Análise de Dados

Análises estatísticas foram realizadas com SPSS 16.0. Dados são expressos como média ± DP; significância foi definida em p < 0,05.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização de AuNR@CTAB

Otimização de concentrações de NaBH₄, HCl e Ag⁺ permitiu controle sobre razão de aspecto e posição do pico SPR. Aumento de NaBH₄ deslocou o pico para o azul de 1223 para 865 nm, enquanto HCl mais alto deslocou para o vermelho de 871 para 1070 nm. Redução da concentração de Ag⁺ estendeu o pico SPR ainda mais. AuNRs finais exibiram cor vinho-avermelhado e máximo de absorção a 1064 nm (Fig. 1). Este comprimento de onda alinha-se com a janela NIR-II e corresponde a fontes de laser disponíveis.

Figura 1. Fotopropriedades de AuNR@CTAB sob condições variadas de síntese: (a) esquema de preparação; (b) imagem MET; (c) espectros UV-Vis versus NaBH₄; (d) versus HCl; (e) versus AgNO₃.

Síntese e Caracterização de AuNR@BSA

CTAB, embora eficaz para crescimento de nanobastões, é citotóxica acima de 1–10 µM e pode precipitar em baixas temperaturas. Substituir CTAB por BSA mitiga toxicidade e melhora estabilidade coloidal. AuNR@BSA manteve razão de aspecto similar mas exibiu pico SPR deslocado ~30 nm para o vermelho a 1064 nm (Fig. 2). Potencial zeta mudou de positivo (CTAB) para negativo (BSA), confirmando troca de superfície. Espectros FT-IR revelaram bandas amida características de BSA (1649 e 1539 cm⁻¹). DLS mostrou diâmetros hidrodinâmicos de 8,6 nm e 89 nm para as duas populações, indicando leve aumento de tamanho após revestimento com BSA. MET confirmou morfologia bastonete com extremidades levemente arredondadas (Fig. 2). Todas as dimensões permaneceram abaixo de 100 nm, favorecendo penetração tumoral.

Figura 2. Caracterização de AuNR@BSA e AuNR@CTAB: (a) síntese; (b) espectros UV-Vis; (c) distribuição de tamanho DLS; (d) imagens MET.

Efeito Fototérmico In Vitro

AuNR@BSA (OD ≈ 1) alcançou aumento de temperatura de ~25 °C para 80 °C dentro de 5 min sob 0,35 W cm⁻², estabilizando posteriormente (Fig. 3A). Temperatura escalou linearmente com potência do laser (Fig. 3B). Aumento de OD aumentou ainda mais temperaturas de pico. Estabilidade fototérmica confirmada em três ciclos de irradiação de 10 min a 0,5 W cm⁻² (Fig. 3D). Imagens térmicas exibiram temperaturas de pico de 85,5 °C para AuNRs versus 44,5 °C para PBS (Fig. 3E). Estes resultados ressaltam a conversão fototérmica superior e estabilidade de nanobastões revestidos com BSA na faixa NIR-II.

Figura 3. Desempenho fototérmico in vitro: (a) temperatura vs. tempo; (b) temperatura vs. potência do laser; (c) temperatura vs. absorbância; (d) estabilidade de três ciclos; (e) imagens térmicas.

Citotoxicidade e Fototoxicidade In Vitro

AuNR@CTAB exibiu citotoxicidade significativa mesmo em baixas concentrações (OD ≈ 0,05), enquanto AuNR@BSA manteve >80 % viabilidade celular até OD ≈ 1 (Fig. 4A). Tratamento fototérmico (0,75 W cm⁻², 10 min) reduziu viabilidade de células 4T1 para ~20 % a OD ≈ 1, enquanto células controle permaneceram ~100 % viáveis (Fig. 4B). Assim, revestimento com BSA preserva biocompatibilidade enquanto permite morte fototérmica eficaz.

Figura 4. Citotoxicidade e fototoxicidade: (a) viabilidade celular vs. concentração; (b) viabilidade com/sem laser.

Biodistribuição e Circulação In Vivo

AuNR@BSA exibiu meia-vida de ~1,5 h na circulação (Fig. 5A). Após 24 h, acumulação predominante foi observada em fígado e baço, consistente com captação pelo sistema reticuloendotelial (Fig. 5B). Estas descobertas sugerem potencial para aplicações direcionadas a fígado-baço.

Figura 5. Biodistribuição: (a) concentração de Au no sangue ao longo do tempo; (b) distribuição em órgãos a 24 h.

Tratamento Fototérmico In Vivo

Injeção intratumoral de AuNR@BSA seguida por irradiação de 1064 nm (0,75 W cm⁻², 10 min) elevou temperatura do tumor a ~64 °C, enquanto grupos controle permaneceram próximos à temperatura corporal (Fig. 6D). Ao longo de 14 dias, o grupo AuNR@BSA + laser mostrou ablação tumoral completa sem recrescimento; tumores em grupos controle progrediram rapidamente (Fig. 6A, B). Análise pós-mortem confirmou ausência de tecido tumoral residual (Fig. 6C). MET de tumores tratados revelou AuNRs intactos, atestando fotoestabilidade in vivo (Fig. 7).

Figura 6. Resultados do tratamento in vivo: (a) volume tumoral; (b) peso corporal; (c) fotografias do tumor; (d) termografia infravermelha; (e) imagens pós-tratamento.

Figura 7. MET de AuNR@BSA em tecido tumoral: (a) tratado; (b) não tratado.

Conclusão

Sintetizamos nanobastões de ouro revestidos com BSA com pico SPR a 1064 nm, combinando alta eficiência fototérmica com biocompatibilidade aprimorada. Estudos in vivo demonstraram ablação tumoral rápida em modelo murino de câncer de mama usando irradiação NIR-II de baixa dose. Os nanobastões exibem biodistribuição favorável, com captação significativa por fígado e baço, e mantêm fotoestabilidade no microambiente tumoral. Estes atributos posicionam AuNR@BSA como plataforma promissora para terapia fototérmica NIR-II, potencialmente em combinação com imunoterapia ou quimioterapia para tratamento de câncer personalizado, seguro e eficaz.

Disponibilidade de Dados e Materiais

O conjunto de dados subjacente a este estudo está disponível do autor correspondente mediante solicitação razoável. Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.