Sensor Colorimétrico de Nanopartículas de Ouro para AGEs de Baixo Peso Molecular em Hemoglobina A0 Glicada

Resumo

A glicação de proteínas no plasma diabético gera produtos finais de glicação avançada (AGEs) que impulsionam a progressão da doença. Glicamos hemoglobina A0 (HbA0) in vitro usando frutose e, em seguida, utilizamos a proteína glicada resultante como molde para a síntese de nanopartículas de ouro (GNPs). A ressonância de plasmon de superfície (SPR) das GNPs correlacionou-se fortemente com o grau de glicação. A fracionamento por filtração em gel revelou duas populações de produtos: fragmentos proteicos de alto peso molecular entrelaçados e AGEs não proteicos de baixo peso molecular. Apenas estes últimos induziram a formação de GNPs, validando o ensaio proposto. Como os AGEs servem como biomarcadores confiáveis para diabetes e suas complicações, este sensor colorimétrico baseado em GNPs oferece uma ferramenta diagnóstica rápida, barata e com potencial impacto clínico.

Introdução

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado por hiperglicemia crônica que desencadeia a reação de Maillard — uma glicação não enzimática de proteínas e açúcares. A base de Schiff inicial converte-se rapidamente no produto de Amadori, que sofre transformações adicionais para formar AGEs. Os AGEs entrelaçam proteínas, ativam o receptor RAGE e induzem estresse oxidativo e inflamação, contribuindo para doenças cardiovasculares, nefropatia, retinopatia e neurodegeneração. Outras vias, como oxidação de glicose, peroxidação lipídica e a via do poliol, também geram AGEs, e a ingestão dietética aumenta os níveis sistêmicos. Apesar de sua heterogeneidade, os AGEs compartilham entrelaçamento covalente e um efeito de escurecimento que os tornam biomarcadores atraentes para diabetes, envelhecimento e distúrbios relacionados.

A detecção atual de AGEs depende de cromatografia-espectrometria de massa ou ELISA caros, limitando o uso em ponto de cuidado. Sensores colorimétricos simples, rápidos e custo-efetivos são, portanto, altamente desejáveis. Nanopartículas de ouro (GNPs) oferecem SPR ajustável e têm sido empregadas com sucesso como relatores colorimétricos para açúcares, proteínas e agregados proteicos. Mostramos anteriormente que proteínas glicadas podem semear a síntese de GNPs, com a extensão da glicação refletida na resposta óptica. Com base nisso, investigamos se AGEs de baixo peso molecular poderiam impulsionar a formação de GNPs e assim servir como base para um sensor qualitativo.

Métodos

Materiais

Hemoglobina A0 e Sephadex G25 (Sigma Aldrich) foram usados como recebidos. Cloreto de ouro(III) tri-hidratado (HAuCl₄·3H₂O, Loba Chemie) foi a fonte de Au⁺. Frutose, tampões fosfato e reagentes de grau analítico foram obtidos de fornecedores padrão. Água MilliQ (>18 MΩ) foi usada em todo o processo.

Procedimentos

Glicação da HbA0

HbA0 (1 mg mL⁻¹) foi incubada com frutose (0,1 M) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, a 37 °C por 1–10 dias. Amostras foram alíquotadas no dia 0 (controle) e dia 10 (totalmente glicada) e armazenadas em condições estéreis.

Ensaio de Propriedade Redutora

A atividade redutora foi quantificada via ensaio de redução de ferricianeto. Após incubação com ferricianeto de potássio, a mistura de reação foi acidificada e a absorbância a 700 nm medida; absorbância maior indicava maior poder redutor.

Cromatografia de Filtração em Gel

Amostras de Fruc-Hb dos dias 0 e 10 foram fracionadas em coluna Sephadex G25 (15 cm × 1 cm) a 7,5 mL h⁻¹. Trinta frações foram coletadas e analisadas por absorção UV (280 nm) e ensaio de Bradford.

Síntese de Nanopartículas de Ouro

Sal de ouro (1% p/v HAuCl₄) foi misturado com água e agitado até ficar amarelo pálido. Fruc-Hb (12,5 ng μL⁻¹) ou frações individuais (1 ng μL⁻¹) foram adicionadas, e a mistura foi deixada em repouso para permitir o crescimento das GNPs. As cores finais variaram do rosa ao roxo, indicando formação bem-sucedida de nanopartículas.

Ensaio de Bradford

O conteúdo proteico em cada fração foi quantificado medindo absorbância a 595 nm e 450 nm; a razão (OD₅₉₅/OD₄₅₀) refletiu o enriquecimento proteico.

Espectroscopia

Espectroscopia UV-Visível

Espectros foram registrados em Perkin Elmer Lambda 25 de 200–800 nm com comprimento de percurso de 1 cm.

Espectroscopia de Fluorescência

Fluorescência intrínseca de proteína (excitação 280 nm) e fluorescência de AGEs (excitação 350 nm) foram medidas em Agilent Cary Eclipse.

Espectroscopia de Dicroísmo Circular

CD no UV distante (190–260 nm) avaliou mudanças na estrutura secundária usando espectrômetro Chirascan.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

GNPs foram imageadas em JEOL 2100F TEM após centrifugação e secagem em grades de carbono.

Perfil de Intensidade de Cor das GNPs

A cor foi quantificada calculando (R–B)/G a partir de imagens digitais.

SDS-PAGE

Amostras de HbA0 glicada e controle foram resolvidas em gel resolvente a 12%, visualizadas sob luz branca.

Resultados

Síntese de GNPs a partir de Frutose, HbA0 e HbA0 Glicada

A fluorescência a 450 nm (excitação 350 nm) aumentou >10× após 10 dias de incubação com frutose, confirmando formação de AGEs. Ensaios de poder redutor mostraram: Fruc-Hb dia 10 > Fruc-Hb dia 0 > frutose > HbA0. Apenas Fruc-Hb do dia 10 produziu GNPs estáveis dentro de 4 dias, exibindo pico SPR a 530 nm e partículas esféricas de 22 ± 2,4 nm. Os dados confirmam que AGEs, não meras alterações proteicas, impulsionam a síntese de GNPs.

Fracionamento de Fruc-Hb Resolve Duas Classes Distintas de Produtos de Glicação

A filtração em gel rendeu duas populações no Fruc-Hb do dia 10: fragmentos proteicos de alto peso molecular (frações 5–12, 15+) e AGEs não proteicos de baixo peso molecular (população II). O Fruc-Hb do dia 0 produziu apenas a fração proteica (população I). Absorção UV a 280 nm e análise de Bradford confirmaram a natureza proteica da população I, enquanto a população II exibiu absorção UV mas conteúdo proteico negligenciável.

Fluorescência de Produtos de Glicação Proteicos e Não Proteicos

Apenas frações do dia 10 mostraram fluorescência de AGEs a 450 nm. Frações da população I tiveram maior intensidade de fluorescência, indicando AGEs ligados a proteínas, enquanto frações da população II emitiram fluorescência mais fraca mas mantiveram absorção UV, confirmando sua natureza não proteica e de baixo peso molecular.

GNPs Semedas em Frações de Fruc-Hb Diferenciam Produtos de Glicação

Quando a síntese de GNPs foi realizada com frações individuais, apenas a população II (AGEs não proteicos) produziu GNPs estáveis e coloridas, enquanto a população I não o fez. Isso demonstra que AGEs de baixo peso molecular são responsáveis pela formação de nanopartículas e podem servir como sensor seletivo. O aumento das concentrações de Fruc-Hb e ouro acelerou a reação para 1 dia, destacando adequação para configurações de ponto de cuidado. A intensidade de cor linear versus concentração de Fruc-Hb de 8–40 ng μL⁻¹ confirmou potencial quantitativo.

Discussão

Nosso estudo estabelece que AGEs de baixo peso molecular são as espécies ativas impulsionando a síntese de GNPs. O fracionamento revelou que apenas AGEs não proteicos desencadeiam a formação de nanopartículas, fornecendo base mecânica clara para o sensor. GNPs oferecem alta sensibilidade e podem detectar AGEs em níveis de nanogramas, com limite de detecção de 1 ng μL⁻¹. O método é simples, custo-efetivo e compatível com pequenos volumes de amostra, tornando-o ideal para monitoramento rápido de diabetes em ponto de cuidado. Trabalhos futuros poderiam estender esta abordagem para distinguir espécies específicas de AGEs e detectar produtos finais de peroxidação lipídica avançada, ampliando ainda mais a utilidade clínica.

Conclusões

Apresentamos um ensaio colorimétrico robusto que detecta AGEs de baixo peso molecular em hemoglobina glicada com sensibilidade de nanogramas. Aproveitando o poder redutor dos AGEs para semear a formação de GNPs, o sensor discrimina entre amostras glicadas e não glicadas, e entre AGEs ligados a proteínas e livres. Comparado com LC-MS/MS, este ensaio oferece uma alternativa rápida e barata para monitorar progressão do diabetes e complicações associadas. A especificidade para AGEs, combinada com sua simplicidade, posiciona-o como ferramenta promissora para diagnóstico clínico e gestão glicêmica personalizada.