Nec-1 atenua a neurotoxicidade induzida por nanomateriais de dióxido de titânio em células Sh-Sy5y através de RIP1

Resumo

Os nanomateriais de dióxido de titânio são aplicados em vários campos devido às suas esplêndidas características físico-químicas, que por sua vez representam uma ameaça potencial à saúde humana. Recentemente, vários estudos in vivo revelaram que as nanopartículas de dióxido de titânio (TNPs) podem ser transportadas para o cérebro de animais após a exposição por várias rotas. Os TNPs absorvidos podem se acumular no cérebro e podem perturbar as células neuronais, levando à disfunção cerebral. Estudos in vitro verificaram a neurotoxicidade dos TNPs. Os mecanismos subjacentes à neurotoxicidade dos TNPs permanecem obscuros. Não se sabe se a necroptose está envolvida na neurotoxicidade dos TNPs. Portanto, realizamos um estudo in vitro e descobrimos que os TNPs induzem lesão inflamatória em células SH-SY5Y de forma dose-dependente, que foi mitigada pelo pré-tratamento com necrostatina-1 (Nec-1). Como a proteína quinase 1 que interage com o receptor (RIP1) é relatada como o alvo de Nec-1, nós a silenciamos por siRNA. Nós expusemos células mutantes e de tipo selvagem a TNPs e avaliamos a lesão inflamatória. O silenciamento da expressão de RIP1 inibiu a lesão inflamatória induzida pela exposição a TNPs. Em conjunto, o Nec-1 melhora a neurotoxicidade dos TNPs por meio do RIP1. No entanto, mais estudos devem ser realizados para avaliar de forma abrangente a correlação entre a neurotoxicidade de TNPs e RIP1.

Introdução

Devido às suas esplêndidas propriedades físico-químicas, os nanomateriais de dióxido de titânio são sintetizados [1] e amplamente utilizados para diversos fins, como cosméticos [2], campos da indústria [3, 4] e áreas médicas [5]. No entanto, esse uso generalizado pode representar uma grande ameaça à saúde humana [6]. Uma vez expostas, a maioria das nanopartículas de dióxido de titânio (TNPs) entra no corpo humano por inalação e ingestão [6]. O sistema respiratório [7], o sistema digestivo [8] e o sistema cardiovascular [9] podem ser interrompidos por TNPs absorvidos. Da mesma forma, o cérebro, como a parte mais importante do sistema nervoso central, também pode ser perturbado, uma vez que os TNPs na circulação podem penetrar na barreira hematoencefálica e os NPs inalados podem ser transportados para o cérebro através da via olfatória [10] . Uma vez que os TNPs entram no cérebro, eles podem se acumular lá e causar danos ao cérebro, levando a disfunções. Danos ao cérebro são geralmente irreversíveis e graves e, portanto, qualquer causa potencial de dano deve ser investigada [11].

Embora nenhum estudo epidemiológico tenha explorado a associação entre a exposição aos TNPs e doenças cerebrais, muitos estudos in vivo e in vitro confirmaram a neurotoxicidade dos TNPs [12]. Além disso, o foco principal tem sido a pesquisa para descobrir os mecanismos subjacentes. Para este propósito, revisamos previamente os mecanismos moleculares atualmente conhecidos de neurotoxicidade dos TNPs e descobrimos que processos de morte celular programada (PCD), como apoptose e autofagia, estavam implicados na neurotoxicidade dos TNPs [13].

A necroptose, também chamada de necrose regulada, é outro tipo de DCP. Ao contrário da apoptose, que é dependente da caspase, a necroptose é uma proteína quinase 1/3 (RIP1 / RIP3) dependente do receptor. O RIP1 ativado recruta o RIP3 para formar um necrossomo, que ativa a proteína semelhante ao domínio da quinase de linhagem mista (MLKL) para iniciar a necroptose [14]. A necroptose pode regular a morte celular e a neuroinflamação [15, 16], ambas envolvidas na neurotoxicidade dos TNPs. Portanto, hipotetizamos que a necroptose está implicada na neurotoxicidade causada por TNPs.

Para testar nossa hipótese, realizamos um estudo in vitro para explorar o papel da necroptose na neurotoxicidade dos TNPs. Neste estudo, a viabilidade celular, o vazamento de LDH e as citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8) foram medidos após a exposição aos TNPs. Primeiro, as células SH-SY5Y foram cultivadas com várias concentrações de TNPs. Em segundo lugar, as células foram expostas a TNPs com ou sem Nec-1, que é um potente inibidor da necroptose. Terceiro, a expressão do gene RIP1, que pode ser suprimida por Nec-1, foi silenciada usando siRNA, após o qual células mutantes e de tipo selvagem foram tratadas com TNPs. Este estudo lança luz sobre a compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes à neurotoxicidade dos TNPs.

Resultados

TNPs inibem a viabilidade celular

Para verificar a citotoxicidade de TNPs em células SH-SY5Y, primeiro avaliamos a viabilidade celular usando o ensaio CCK8. As células foram cultivadas com concentrações de TNPs variando de 5 a 160 μg / mL por 24, 48 e 72 h. Conforme mostrado na Fig. 1, a viabilidade celular permaneceu inalterada nas células tratadas com 5, 10, 20 e 40 μg / mL após 24 h de exposição. Quando as células foram tratadas por 48 e 72 h, a viabilidade celular permaneceu inalterada apenas no grupo de 5 μg / mL ( p =0,4507 em 48 h e p =0,1002 em 72 h). Além disso, a viabilidade celular foi dramaticamente menor nas células tratadas com TNPs 80 μg / mL após 48 ( p =0,0007) e 72 h ( p =0,0008). Com base nesses resultados, concluímos que os TNPs diminuíram a viabilidade celular de forma dependente da dose e do tempo (dados não mostrados), indicando que a exposição de longo prazo foi mais tóxica.

Diferentes concentrações de exposição de TiO2-NPs na viabilidade celular de células SH-SY5Y em 24, 48 e 72 h e vazamento de LDH em 72 h. (Comparado com o grupo de controle, ^* p <0,05, ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

TNPs danificam a integridade da membrana

Nest, analisamos os efeitos tóxicos dos TNPs na integridade da membrana após 72 h de exposição. A integridade da membrana foi avaliada medindo o vazamento de LDH. Conforme mostrado na Fig. 1b, os níveis de LDH foram significativamente aumentados em células tratadas com TNPs em doses superiores a 5 μg / mL. Um aumento na produção de LDH foi observado nas células tratadas com 40, 80 e 160 μg / mL ( p <0,0001). Estes resultados sugeriram que os TNPs aumentaram os níveis de LDH de uma forma dependente da dose, o que foi semelhante ao ensaio CCK8.

Exposição a TNPs promove inflamação

A resposta inflamatória após a exposição aos TNPs foi analisada por ELISA. Depois que as células foram tratadas com várias concentrações de TNPs por 72 h, os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 foram medidos. Como mostrado na Fig. 2, a secreção de IL-8 foi regulada positivamente em todas as células tratadas com TNPs; os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 foram uniformemente elevados em células tratadas com doses superiores a 5 μg / mL ( p <0,01). Além disso, a inflamação foi significativamente maior nas células tratadas com doses superiores a 10 μg / mL do grupo ( p <0,0001). Ao todo, os TNPs aumentaram a inflamação de uma forma dependente da dose.

Diferentes concentrações de exposição de TiO2-NPs (μg / mL) na inflamação das células SH-SY5Y em 72 h. (Comparado com o grupo de controle, ^**** p <0,0001)

Nossos resultados indicaram que TNPs induziu lesão inflamatória de forma dose-dependente. Adotamos uma concentração de TNPs de 80 μg / mL e um período de exposição de 72 h nos experimentos a seguir para explorar o papel da necroptose na neurotoxicidade dos TNPs.

O co-tratamento Nec-1 inibe a neurotoxicidade de TNPs

Para analisar o papel da necroptose na lesão inflamatória, co-tratamos as células com Nec-1 (um inibidor da necroptose) e TNPs. Conforme mostrado na Fig. 3a, as células SH-SY5Y foram expostas a TNPs ou TNPs + Nec-1 (1, 5, 10, 15 ou 20 μM), e descobrimos que Nec-1 melhorou dramaticamente a redução induzida por TNPs em viabilidade celular (10, 15, 20 μM) ( p <0,0001). Como a viabilidade celular nos grupos tratados com 15 μM e 20 μM não foi maior do que nos grupos tratados com 10 μM (p =0,6643 e p =0,6292), nós co-tratamos as células com 10 μM de Nec-1 para analisar o efeito na integridade da membrana.

Os efeitos do Nec-1 na viabilidade celular e LDH após exposição aos TNPs. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Depois de cultivar células com TNPs ou TNPs + Nec-1, descobrimos que os níveis de LDH no grupo TNPs + Nec-1 eram muito mais baixos do que no grupo TNPs sozinho ( p =0,0005). Além disso, o tratamento com Nec-1 sozinho não aumentou o vazamento de LDH ( p =0,9878).

Conclusivamente, 10 μM de Nec-1 poderia inibir efetivamente a citotoxicidade de TNPs e não era tóxico para as células.

Para analisar a capacidade antiinflamatória do Nec-1, as células foram cultivadas com TNPs ou TNPs + Nec-1. Como mostrado na Fig. 4, a produção de TNF-α ( p =0,003), IL-1β ( p =0,0013), IL-6 ( p <0,0001) e IL-8 ( p =0,0004) foi significativamente menor no grupo TNPs + Nec-1 do que no grupo TNPs.

Os efeitos do Nec-1 na inflamação após a exposição aos TNPs. ( ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Esses resultados implicam que o Nec-1 pode mitigar as respostas inflamatórias induzidas pela exposição aos TNPs.

Silenciar RIP1 atenua a lesão inflamatória induzida por TNPs

Para determinar se Nec-1 anulou a lesão inflamatória induzida por TNPs através de RIP1, nós efetivamente silenciamos a expressão de células RIP1 usando siRNA (Fig. 5, p <0,0001). Em seguida, a lesão inflamatória após a exposição a TNPs em células mutantes e de tipo selvagem foi medida. A Figura 6a demonstra que a viabilidade celular no grupo TNPs + si-RIP1 foi notavelmente maior do que no grupo TNPs + si-NC ( p =0,0002). Produção de LDH (Fig. 6b, p <0,0001) e níveis de TNF-α ( p <0,0001), IL-1β ( p =0,0001), IL-6 ( p <0,0001) e IL-8 ( p =0,0001) (Fig. 7) no grupo TNPs + si-RIP1 foram dramaticamente mais baixos do que no grupo TNPs + si-NC. Esses resultados indicaram que os TNPs promoveram lesão inflamatória por meio do RIP1.

A expressão de mRNA após células SH-SY5Y transfectadas com si-RIP1. ( ^**** p <0,0001)

Viabilidade celular e vazamento de LDH após células mutantes e de tipo selvagem serem expostas a TNPs. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Inflamação após células mutantes e de tipo selvagem serem expostas a TNPs. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Discussão

Neste estudo, descobrimos que a exposição aos TNPs induziu citotoxicidade em células SH-SY5Y de uma maneira dependente da dose e que a necroptose estava envolvida na neurotoxicidade dos TNPs. Para explorar o papel da necroptose, expusemos células a TNPs com ou sem Nec-1 (um potente inibidor de necroptose) [17, 18] e medimos a viabilidade celular, o vazamento de LDH e os níveis de citocinas inflamatórias. Nossos dados sugerem que o co-tratamento com Nec-1 pode mitigar a lesão inflamatória induzida por TNPs. Uma vez que estudos mostraram que Nec-1 exerce seus efeitos suprimindo a atividade de RIP1, nós transfectamos células com si-RIP1 para determinar se RIP1 estava envolvido nos efeitos protetores de Nec-1. Células mutantes e de tipo selvagem foram tratadas com TNPs, e a lesão inflamatória foi avaliada. Isso indicou que a viabilidade celular no grupo si-RIP1 foi maior do que no grupo si-NC, e os níveis de vazamento de LDH e citocinas inflamatórias foram menores no grupo si-RIP1 do que no grupo si-NC após a exposição a TNPs . Em conclusão, o presente estudo revelou pela primeira vez que a necroptose está envolvida na lesão inflamatória induzida por TNPs nas células.

Reconfirmamos a neurotoxicidade dos TNPs em nosso estudo in vitro. Após as células SH-SY5Y terem sido expostas a várias concentrações de TNPs por vários tempos de incubação, a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio CCK8. Como mostrado na Fig. 1a, a exposição a TNPs reduziu a viabilidade celular de uma forma dependente da dose; após 48 h e 72 h de exposição, a viabilidade celular nos grupos de 80 e 160 TNPs diminuiu drasticamente em comparação com o grupo de controle ( p <0,001). Para confirmar ainda mais a citotoxicidade, também medimos o vazamento de LDH. Os dados na Fig. 1b revelaram que a produção de LDH aumentou de forma dependente da dose após 72 h de exposição, e os níveis de LDH nos grupos 40, 80 e 160 foram notavelmente maiores do que no grupo de controle ( p <0,0001). Como estudos anteriores mostraram que a neuroinflamação pode ser promovida pela exposição a TNPs [19], os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 também foram medidos. A Figura 2 ilustra que os níveis dessas quatro citocinas inflamatórias foram significativamente regulados positivamente em comparação com o grupo de controle e foram dramaticamente maiores nos grupos tratados com 20 a 160 μg / mL ( p <0,0001). Em conjunto, nossos resultados indicaram que os TNPs podem induzir neurotoxicidade de forma dose-dependente, o que é consistente com estudos anteriores. Os TNPs podem ser absorvidos pelas células neuronais e inibir a proliferação [20,21,22]. Além disso, a exposição aos TNPs pode diminuir a viabilidade celular e promover o vazamento de LDH de uma forma dependente da dose [23,24,25,26,27].

Nós co-tratamos as células com Nec-1 para esclarecer se a necroptose estava envolvida na neurotoxicidade causada por TNPs. Depois que as células foram tratadas com as concentrações indicadas de TNPs com ou sem Nec-1, a viabilidade celular, o vazamento de LDH e a inflamação foram avaliados. A Figura 3a mostra que a redução na viabilidade celular após a exposição aos TNPs foi significativamente inibida pelo co-tratamento com 10 μM Nec-1. Enquanto isso, a Fig. 3b revelou que o tratamento com 10 μM Nec-1 não aumentou os níveis de LDH, e os níveis de LDH em células tratadas com TNPs + Nec-1 grupo foram dramaticamente mais baixos do que no grupo TNPs sozinho. Em seguida, medimos os efeitos do co-tratamento com Nec-1 na inflamação induzida por TNPs. A Figura 4 ilustra que os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 foram notavelmente mais baixos nas células tratadas com TNPs + Nec-1. Esses resultados confirmaram que o Nec-1 poderia proteger as células da morte e processos inflamatórios [28, 29].

Finalmente, uma vez que RIP1 é o alvo de Nec-1, avaliamos se RIP1 poderia regular a neurotoxicidade de TNPs. Construímos células mutantes silenciando a expressão de RIP1 (Fig. 5). Os dados da Fig. 6 e Fig. 7 revelaram que após a exposição a TNPs, a viabilidade celular foi maior, e os níveis de LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 foram menores no grupo si-RIP1 do que aquele no si-NC, o que sugere que os TNPs promovem citotoxicidade por meio de RIP1. Da mesma forma, vários estudos descobriram que RIP1 pode regular a morte celular e processos inflamatórios [30, 31].

Embora relatemos pela primeira vez que o Nec-1 pode mitigar a neurotoxicidade dos TNPs suprimindo a via de sinalização da necroptose, nosso estudo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, a citotoxicidade de materiais nanométricos difere de seus materiais volumosos e pode ser amplamente influenciada pelas propriedades de superfície [32], o que pode explicar o resultado contrário do aumento da viabilidade celular encontrado por Sebastián et al. [33]. Portanto, é essencial avaliar de forma abrangente a nanotoxicidade em indivíduos de vários aspectos, como proliferação celular, integridade da membrana, estresse oxidativo, inflamação, função mitocondrial, ciclo celular, citoesqueleto e epigenética. Em segundo lugar, RIP1 pode recrutar RIP3 para formar um necrossomo funcional, um ativador vital de MLKL, para iniciar a necroptose [34]. Nossa hipótese é que RIP3 / MLKL pode estar envolvido na neurotoxicidade de TNPs, o que deve ser explorado em trabalhos futuros. Além disso, as associações de RIP3 / MLKL com a neurotoxicidade de TNPs também devem ser avaliadas. Em terceiro lugar, as espécies reativas de oxigênio (ROS), como os principais mecanismos subjacentes à neurotoxicidade dos TNPs [35, 36], foram relatados como o sinal a montante do RIP1 [37]. Portanto, se ROS estão a montante de RIP1 na neurotoxicidade de TNPs deve ser discutido mais adiante. Em quarto lugar, as células devem ser expostas a concentrações não tóxicas (TNPs <5 μg / mL) por um período de longo prazo (mais de 72 h) para avaliar a citotoxicidade crônica. Em quinto lugar, devemos avaliar o papel da necroptose na neurotoxicidade dos TNPs em mais linhas celulares neuronais e células neuronais primárias humanas e animais.

Conclusões

Nosso estudo revelou a necroptose como outro mecanismo de morte celular programada envolvido na neurotoxicidade causada pelos TNPs. Neste estudo, descobrimos que os TNPs podem induzir lesão inflamatória em células SH-SY5Y de forma dose-dependente e que o co-tratamento com Nec-1 (um potente inibidor da necroptose) pode amenizar esses efeitos prejudiciais. RIP1, o alvo do Nec-1, foi silenciado pelo si-RNA, que efetivamente mitigou a lesão inflamatória induzida pela exposição a TNPs. Em conclusão, o Nec-1 inibiu a lesão inflamatória das células SH-SY5Y induzida pela exposição aos TNPs ao direcionar a via RIP1. As vias de sinalização a montante e a jusante de RIP1 envolvidas na neurotoxicidade de TNPs devem ser avaliadas posteriormente.

Materiais e métodos

Preparação de TNPs e cultura celular

Nós previamente caracterizamos os TNPs e os preparamos de acordo com nosso procedimento publicado anteriormente [38]. Resumidamente, os TNPs foram dissolvidos em RPMI 1640 em várias concentrações de 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μg / mL. A solução TNP foi esterilizada e sonicada (300 W, 10 min) à temperatura ambiente para evitar que as partículas se agregassem antes do tratamento. As células em meio de cultura não exposto a TNPs serviram como grupo de controle. As células SH-SY5Y, compradas do Cell Bank do Shanghai Institute of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences, foram cultivadas em meio RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco, um produto linha da Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO ₂ .

Ensaio de Viabilidade Celular e Vazamento de LDH

A viabilidade celular foi medida usando um kit de contagem de células-8 (CCK8. Dojindo, cat no.CK04). Em resumo, 1 × 10 ⁴ As células SH-SY5Y foram colocadas em uma placa de 96 poços e cultivadas em uma incubadora a 37 ° C (5% CO ₂ ) por 24 horas antes da exposição a TNPs. As células foram então incubadas com TNPs em várias concentrações (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 μg / mL) por mais 24 h. Após o tratamento, as células foram incubadas com CCK-8 por mais 2 h. Em seguida, a densidade óptica (DO) foi medida a 450 nm, colocando a placa de 96 poços em um leitor de microplaca (BioTek, Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular de cada grupo, expressa como uma porcentagem, foi calculada como (ODtreated-ODblank) / (ODcontrol - ODblank) × 100%.

A integridade da membrana foi medida por um kit comercial (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Depois que as células SH-SY5Y foram expostas a várias concentrações de TNPs por 72 h, a secreção de LDH foi analisada de acordo com as instruções do fabricante.

Resposta inflamatória

O ELISA foi aplicado para medir os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 produzidos por células SH-SY5Y. Resumidamente, as células SH-SY5Y foram expostas a TNPs por 72 h, e o sobrenadante foi coletado para análise de acordo com as instruções do fabricante (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

Transfecção de siRNA

Seguindo o protocolo do fabricante, a concentração de 100 nM de si-RIP1 ou siRNA de controle negativo (si-NC) foi transfectada em células usando Lipofectamine 2000. A eficiência do silenciamento de genes por siRNA foi estimada com PCR em tempo real.

PCR em tempo real

O RNA de células expostas a várias concentrações de TNPs foi isolado usando o kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, EUA) com base nas instruções do fabricante. A expressão relativa de RIP1 foi medida por PCR em tempo real. Os níveis relativos de mRNA de RIP1 foram normalizados para expressões de β-actina.

Análise estatística

O software SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi usado para analisar os dados. A análise de variância unilateral foi usada para comparar as médias dos grupos. p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Disponibilidade de dados e materiais

Disponível no manuscrito.

Abreviações

TNPs:

Nanopartículas de dióxido de titânio

Nec-1:

Necrostatina-1

RIP:

Proteína quinase de interação com receptor

MLKL:

Proteína de linhagem mista semelhante a domínio de quinase

ROS:

Espécies que reagem ao oxigênio

Análise de espectro total de nanolasers de plasma de superfície à base de perovskita Construção da heterojunção ZnTiO3 / Bi4NbO8Cl com desempenho fotocatalítico aprimorado