Nanopartículas de Hidróxido de Cobre Dopadas com Ligantes: Estratégia Antimicrobiana Eficaz

Resumo

A resistência bacteriana a terapias antimicrobianas é um problema clínico crescente, tanto para aplicações tópicas quanto sistêmicas. Topicamente, íons de cobre podem ser antimicrobianos eficazes e baratos que atuam através de múltiplas vias, limitando oportunidades de resistência bacteriana. No entanto, a química do cobre não se presta a formulações fáceis que liberem íons de cobre em pHs biologicamente compatíveis. Aqui, desenvolvemos nanopartículas de hidróxido de cobre adipato tartrato (CHAT) como material barato, seguro e prontamente sintetizado que deve permitir liberação antimicrobiana de íons de cobre em ambiente de ferida infectada.

Primeiro, sintetizamos CHAT e demonstramos que este possui tamanhos de partículas aquadas dispersas de 2–5 nm e potencial zeta médio de −40 mV. Em seguida, quando diluído em meio bacteriano, CHAT demonstrou eficácia similar ao cloreto de cobre contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus, com atividade dependente da dose ocorrendo principalmente entre 12,5–50 mg/L de cobre. De fato, nestes níveis, CHAT se dissolveu muito rapidamente e, conforme confirmado por um biossensor bacteriano de cobre, mostrou carregamento intracelular idêntico aos íons de cobre derivados do cloreto de cobre. No entanto, quando formulado a 250 mg/L em uma matriz aplicada topicamente, nomeadamente hidroxietilcelulose, o benefício do CHAT sobre o cloreto de cobre tornou-se aparente. O primeiro proporcionou liberação rápida e sustentada de cobre na faixa bactericida, mas o cloreto de cobre, que formou precipitados insolúveis a tal concentração e pH, atingiu liberação máxima de apenas 10 ± 7 mg/L de cobre em 24 h.

Fornecemos uma formulação prática para terapia antimicrobiana tópica baseada em cobre. Estudos adicionais, especialmente in vivo, são justificados.

Introdução

Infecções microbianas contribuem para milhões de mortes globalmente. Frequentemente, a ineficiência de um tratamento antimicrobiano deve-se à resistência microbiana a antibióticos convencionais. Como tal, novos antimicrobianos são avidamente buscados. O cobre há muito é reconhecido por seus efeitos antimicrobianos e pode ter potencial para maior longevidade clínica que antibióticos padrão, pois parece atuar via multiplicidade de mecanismos contra bactérias, incluindo interação com proteínas e DNA bacterianos, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e ruptura da integridade da membrana. Pela mesma razão, sugere-se que o potencial de resistência antimicrobiana de cepas bacterianas patogênicas ao cobre e outros metais é limitado. Além disso, o cobre é relativamente barato e de baixa toxicidade para humanos, já que sua essencialidade em níveis traço assegurou a evolução de controle homeostático rigoroso. Há, portanto, uso comum deste metal para medidas preventivas de infecção, principalmente para evitar formação de biofilme bacteriano em superfícies em áreas de alto risco como hospitais e asilos. Em contraste, o cobre não encontrou uso terapêutico significativo em formulações antimicrobianas tópicas, ao contrário da prata, amplamente empregada.

Bactérias são suscetíveis ao carregamento de cobre em seu ambiente intracelular, e a eficácia de uma fonte de cobre relaciona-se à sua capacidade de liberar íons de cobre. Neste aspecto, um desafio significativo para antimicrobianos baseados em cobre é atingir uma formulação concentrada que permita liberação sustentada de cobre antimicrobiano em concentrações efetivas em fluidos como exsudato de ferida. Isso ocorre porque o cobre é um íon metálico hidrolítico e, à medida que sua concentração aumenta no pH de formulações tópicas típicas (próximo ao neutro), também aumenta sua tendência a induzir hidrólise e formar oxi-hidróxidos insolúveis. Em pHs fisiológicos, estes oxi-hidróxidos não são bons substratos para liberação de íons de cobre solúveis ou, portanto, potencialmente eficazes.

Recentemente, com o propósito de encontrar um suplemento de ferro biodisponível, a questão da liberação eficaz de íons férricos de uma fonte concentrada de oxi-hidróxido sob condições fisiológicas foi resolvida através de modificação estrutural das partículas primárias. Naquele trabalho, ferro foi precipitado na presença de ligantes dopantes de cristal GRAS (Generally Recognized As Safe), a saber, ácidos adípico e tartárico, para desestabilizar propositalmente a estrutura final de oxi-hidróxido de ferro. Esta estratégia teve a vantagem de (a) prevenir aglomeração irreversível das partículas de oxi-hidróxido de ferro e (b) aumentar grandemente sua labilidade (facilidade de solubilidade) sob condições fisiológicas apropriadas. Este material foi denominado "ferro [oxi-]hidróxido adipato tartrato" ou IHAT. Por analogia, consideramos aqui se o cobre [oxi-]hidróxido adipato tartrato (CHAT) poderia ser sintetizado e formulado em altas concentrações mas ainda liberar íons de cobre em níveis antimicrobianos efetivos. Em particular, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo sintético barato e escalável que produza nanopartículas de oxi-hidróxido de cobre que, diferentemente de materiais previamente relatados, liberem prontamente concentrações biocidas de íons de cobre em ambiente de ferida simulado.

Assim, neste estudo, sintetizamos CHAT e caracterizamos sua capacidade de entregar cobre biodisponível e, portanto, demonstrar atividade antimicrobiana. Concentramo-nos em cepas de Escherichia coli como espécies "indicadoras" para bactérias Gram-negativas, mas demonstramos adicionalmente efeitos de prova de princípio contra Staphylococcus aureus, como bactérias Gram-positivas que frequentemente adquirem multirresistência. Portanto, o estudo visou avaliar o valor de desenvolver CHAT mais adiante para aplicações clínicas em terapia antimicrobiana tópica.

Métodos

Salvo indicação contrária, todos os experimentos foram realizados usando água de ultra-alta pureza (UHP) (purificação por osmose reversa; 18,2 ΩM/cm), à temperatura ambiente (20 ± 2 °C), e todos os reagentes foram adquiridos da Sigma Aldrich.

Formulações de Cobre e Nanopartículas CHAT

Estoques de cloreto de cobre (40 mM cobre) foram preparados dissolvendo CuCl₂·2H₂O em água. Estoques de nanopartículas de óxido de cobre (CuO NPs; Sigma 544868) foram preparados a partir de pó comercial livre de impurezas, com tamanho de partícula primário de 34 nm (faixa 10–50 nm), e previamente testados como agente antimicrobiano. Estes estoques foram preparados a 1,3 g/L de cobre dispersando o pó em água com agitação vigorosa. Suspensões coloidais de nanopartículas CHAT foram sintetizadas usando método de co-precipitação. Brevemente, cloreto de cobre, ácido tartárico e ácido adípico foram dissolvidos em água para atingir razão molar de cobre/ácido tartárico/ácido adípico na suspensão final de 2:1:1 e concentração de cobre de 2,5 g/L. O pH inicial da mistura estava sempre abaixo de 2,5, e o cobre estava totalmente solubilizado. O pH foi então aumentado lentamente por adição gota a gota de solução concentrada de NaOH (5 M) com agitação constante até pH 8,2 ± 0,2.

Teor de Cobre e Distribuição de Fase das Suspensões CHAT

Teor de cobre em suspensões coloidais foi determinado por espectrometria de emissão óptica de plasma indutivamente acoplado (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Todas as amostras foram diluídas a concentrações abaixo de 100 mg/L em 5% HNO₃ (v/v) pelo menos 24 h antes da análise para garantir solubilidade total do cobre. Padrões de calibração (0,1 a 100 mg/L cobre) foram casados à matriz em 5% HNO₃, e quantificação de cobre foi realizada a 324,754 nm. Fracionamento do cobre em porcentagens de cobre aglomerado, nanoparticulado e solúvel foi alcançado por filtração e ultrafiltração de estoques CHAT. Suspensões foram filtradas (corte de 200 nm), e o retido foi considerado fração aglomerada. Para isolar o cobre solúvel e distingui-lo do nanoparticulado, a suspensão coloidal foi ultrafiltrada através de filtro de 3 KDa (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000×g, 5 min) pois isso corresponde a corte abaixo de 1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). O teor de cobre de todas as frações (total, filtrado 200 nm, ultrafiltrado 3 KDa) foi determinado por ICP-OES, e frações expressas como porcentagem em relação ao teor total de cobre.

Determinação do Teor de Cobre e Razões Cobre-Ligante em Nanopartículas CHAT Secas

Nanopartículas CHAT foram aglomeradas e precipitadas para permitir recuperação e remoção de componentes não ligados. Para isso, etanol foi adicionado a suspensões coloidais de CHAT (2,5 g/L cobre) na razão 2:1 etanol/suspensão (v/v), e os aglomerados CHAT resultantes foram recuperados por centrifugação (4500×g × 15 min em Mistral 6000). A fase de solução, contendo espécies de ligante não ligadas, foi descartada. Determinação do teor de cobre em CHAT de fase sólida: um pó foi produzido secando o pellet precipitado em etanol em estufa até peso constante a 45 °C. Este foi então moído e 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) foi digerido em 11 ± 1 g de HNO₃ 70%, com pesos registrados com precisão. Uma vez totalmente digerido, esta solução foi diluída 20 vezes em água e a concentração de cobre determinada por ICP-OES. Razões ligante-cobre foram determinadas diretamente de aglomerados CHAT precipitados em etanol e secos. Os aglomerados foram primeiro ressuspensos em água até seu volume original para facilitar dissolução com menores quantidades de HCl — requisito para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Aliquotas foram dissolvidas em 5% HNO₃ para análise ICP-OES de cobre (como descrito acima) ou em HCl 80 mM para análise HPLC de ligantes (ácidos tartárico e adípico). Análise de ligantes foi realizada em sistema de cromatografia de fase reversa padrão (coluna C18 em Waters Alliance 2690/5 equipado com detector PDA 2998; detalhes adicionais no Arquivo Adicional 1).

Caracterização Físico-Química das Suspensões CHAT

Distribuição de tamanho hidrodinâmico de partícula foi determinada por espalhamento dinâmico de luz (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Aliquotas de suspensões coloidais CHAT (2,5 g/L cobre) foram transferidas para cubeta descartável de 1 mL, e medições (n = 3) realizadas a 25 ± 2 °C. O potencial zeta de suspensões CHAT foi determinado por microeletroforese Doppler a laser (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) usando células capilares dobradas descartáveis (DTS1070) e assumindo constante dielétrica de 78,5 e viscosidade de 0,89 cP. Caracterização por microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada aplicando gota de suspensão CHAT em grades de carbono perfurado e secando a 50 °C durante a noite. Grades foram então imageadas no MET (FEI-Philips CM100) a 120 kV em modo de campo claro.

Atividade Antimicrobiana das Formulações de Cobre

Ensaios foram realizados em meio MOPS para metais pesados (HMM), meio reconhecido como compatível com íons metálicos (Arquivo Adicional 3), suplementado com 0,4% glicose e 0,1% hidrolisado ácido de caseína, e pH ajustado a 7,2 ± 0,2. Antes da adição de compostos de cobre, Escherichia coli (NCTC11100) e Staphylococcus aureus RN4220 foram cultivados durante a noite a 30 °C sob agitação constante em incubadora Infors HT Minitron a 80 rpm. Após isso, as suspensões bacterianas foram diluídas para densidade óptica de 0,05–0,1 (ca. 10⁶ células/mL) a 595 nm para E. coli (Multiskan RC 351 Labsystem) ou 600 nm para S. aureus (Multiskan plate reader, ThermoFisher Scientific). Em seguida, estoques de cloreto de cobre e CHAT coloidal foram diluídos em HMM e adicionados às suspensões bacterianas para obter concentrações finais de cobre entre 0,4 e 100 mg/L. Incubação ocorreu por 6 a 9 h, e crescimento bacteriano foi determinado monitorando densidade óptica como medida de biomassa bacteriana.

Solubilidade de cobre ao longo do tempo em meio de crescimento bacteriano foi determinada diluindo estoques de cloreto de cobre e CHAT coloidal em HMM a 12,5, 25 e 50 mg/L cobre e determinando fração de cobre solúvel a 0, 2, 4 e 8 h através de ultrafiltração (3 KDa) e análise ICP-OES, como descrito acima.

Biodisponibilidade Intracelular das Formulações de Cobre

Bactérias recombinantes bioluminescentes sensoras de Cu, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), que respondem a quantidades sub-tóxicas de cobre intracelular biodisponível aumentando sua bioluminescência, foram usadas para quantificar biodisponibilidade de compostos de cobre. Suspensões bacterianas foram preparadas como descrito para o ensaio de atividade antimicrobiana e incubadas com série de diluições de cloreto de cobre e CHAT (0 a 50 mg/L cobre) em microplacas de 96 poços por 4 h. Bioluminescência foi medida com Luminômetro de Placa Orion II (Berthold Detection Systems), e indução de bioluminescência calculada como:

Indução de Bioluminescência, Mudança de Dobra = Bioluminescência em exposição a Cu / Bioluminescência sem Cu

Estresse Intracelular Induzido pelas Formulações de Cobre

A capacidade de compostos de cobre de induzir ânions superóxido intracelulares e quebras de fita simples de DNA foi avaliada com bactérias recombinantes bioluminescentes, E. coli K12::soxRSsodAlux e E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivamente. Culturas bacterianas foram preparadas como descrito para o ensaio antimicrobiano, e bactérias expostas a série de diluições de cloreto de cobre e CHAT (0 a 50 mg/L cobre) em microplacas brancas de 96 poços por 4 h. O desempenho dos biossensores foi controlado expondo bactérias ao químico indutor de ânion superóxido menadiona (0,04–30 µg/L), ou peróxido de hidrogênio (0,1–150 mg/L), como controles positivos para E. coli K12::soxRSsodAlux ou E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivamente. Novamente, bactérias foram incubadas em microplacas brancas de 96 poços e bioluminescência medida com Luminômetro de Placa Orion II e indução de bioluminescência calculada como na equação anterior.

Incorporação das Formulações de Cobre em Géis de Hidroxietilcelulose

Estoques de cloreto de cobre, CHAT e nanopartículas comerciais de óxido de cobre não modificadas (CuO NPs) foram diluídos em água UHP a 250 mg/L cobre. As suspensões resultantes de CHAT e CuO NPs estavam em pH próximo ao neutro e puderam ser incorporadas diretamente no gel, mas a solução de cloreto de cobre ainda estava ácida após diluição e foi portanto ajustada a pH 7,0 ± 0,2. Hidroxietilcelulose (HEC) foi então dissolvida diretamente (2% p/v) nos vários estoques diluídos usando misturador de rolo (Denley Spiramix 5) até formação de géis homogêneos. Dez gramas de cada gel foram transferidos para tubos Falcon e deixados assentar durante a noite. Em seguida, 10 mL de tampão bicarbonato de sódio 50 mM recém-preparado (dissolvido de pó NaHCO₃ e ajustado a pH 7,0 ± 0,2) foram transferidos para cada tubo com cuidado para minimizar perturbações na interface gel-líquido (área superficial específica de 7,1 cm²). Aliquotas foram então coletadas e analisadas por ICP-OES para determinar liberação de cobre ao longo do tempo.

Resultados

Conforme descrito na seção "Métodos", CHAT foi sintetizado de forma similar ao seu análogo de ferro, IHAT, dopando oxi-hidróxido de cobre (2,5 g/L cobre) com ácidos tartárico e adípico. Isso produziu suspensões coloidais estáveis nas quais todo o cobre passou por filtro de 200 nm mas muito pouco (5%) passou filtro de 3 KDa. Isso indicou que a maior parte do cobre era nanoparticulada (95%; Fig. 1a) com pouco cobre "livre" e nenhum aglomerado grande detectável — novamente como o análogo IHAT. Quando precipitado em etanol, para remover espécies de ligante não ligadas, e então seco, CHAT continha 31 ± 1% cobre (p/p) por análise ICP-OES. Razões molares cobre-ligante, estas determinadas por HPLC, foram 2:1 para cobre-tartrato e 2:0,3 para cobre-adipato. Partículas CHAT apareceram quase monodispersas com diâmetros de 2–3 nm por imagem MET (Fig. 1b). Estes achados foram consistentes com dados de tamanho hidrodinâmico para CHAT mais uma camada de hidratação, já que o diâmetro mediano por volume em água UHP foi 3,4 nm (Fig. 1c) e a distribuição de tamanho foi estreita (2,4–5,6 nm para 80% do volume) quando avaliada com espalhamento dinâmico de luz. O potencial zeta médio foi −39 mV (Fig. 1d), consistente com nanopartículas que formam dispersão aquada estável, e, de fato, a suspensão estoque CHAT mostrou-se estável por vários anos (Arquivo Adicional 4).

Em seguida, consideramos a atividade antimicrobiana de CHAT quando estoques de suspensão foram diluídos em meios de crescimento bacteriano a concentrações associadas à atividade antimicrobiana de sais de cobre. Para CHAT e cloreto de cobre, a curva de inibição de crescimento foi muito similar para ambos E. coli e S. aureus com a maior atividade ocorrendo em concentrações totais de cobre entre 12,5 e 50 mg/L (Fig. 2). Inibição completa de crescimento de E. coli foi observada na incubação com 18,8 (CuCl₂) e 25 (CHAT) mg/L cobre, enquanto para S. aureus, inibição completa de crescimento foi obtida a 75 (CuCl₂) e 100 (CHAT) mg/L cobre (Fig. 2; Porcentagem de inibição de crescimento vs concentração de cobre no Arquivo Adicional 5).

De fato, nestas concentrações antimicrobianas, pelo menos 94% do CHAT foi rapidamente solubilizado (dentro de 15 min), novamente julgado por ultrafiltração e análise ICP-OES (Fig. 3a). Antecipamos portanto que a eficácia antimicrobiana do CHAT estava ligada a esta labilidade química, com dissolução rápida das nanopartículas permitindo aquisição intracelular bacteriana de íons de cobre. Para testar isso, desafiamos o E. coli sensor de Cu, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), no qual a bioluminescência aumenta em resposta a concentrações sub-tóxicas de íons de cobre intracelulares, com 0 a 50 mg/L cobre como CHAT ou cloreto de cobre. Concentrações crescentes no meio de cultura de ambas as fontes de cobre levaram a aumento de bioluminescência na cepa sensor de cobre E. coli (Fig. 3b), consistente com elevações de cobre intracelular. A inclinação da curva dose-resposta foi idêntica até 6,25 mg/L para ambas as fontes de cobre confirmando que cobre biodisponível do CHAT era comparável a uma fonte totalmente solubilizada. A partir daí, em concentrações até 50 mg/L cobre, a luminescência não aumentou devido à toxicidade de ambos os compostos de cobre (Fig. 3b).

Em paralelo ao estudo de cobre intracelular em E. coli exposto a soluções preparadas com CHAT ou cloreto de cobre, também testamos a capacidade destas soluções de desencadear ânions superóxido intracelulares ou causar dano de DNA bacteriano em diferentes biossensores baseados em E. coli. Em nenhum caso houve efeito significativamente observável, apesar dos sensores responderem aos controles positivos relevantes, a saber, peróxido de hidrogênio e menadiona, respectivamente (Fig. 3c, d). Juntas, as respostas equivalentes dos três biossensores bacterianos a soluções preparadas a partir de diferentes formas químicas de cobre suportam fortemente a noção de que, em ambos os casos, bactérias estavam sendo expostas ao mesmo cobre solúvel, apesar de uma formulação começar como nanoparticulada.

Finalmente, como observado acima, a vantagem do CHAT sobre sais de cobre solúveis só seria aparente se uma formulação concentrada permitisse ao primeiro reter sua labilidade química ao contrário do último. Usando hidroxietilcelulose (HEC), base aquosa comum para formulações tópicas, incorporamos 250 mg/L cobre como cloreto de cobre, CHAT, ou como CuO NPs comerciais. Quando 10 mL de tampão NaHCO₃ 50 mM, como exsudato de ferida simplificado, foram adicionados a 10 g de cada um dos géis HEC incorporados com cobre (ou seja, 2,5 mg cobre), houve liberação sustentada de cobre da preparação contendo CHAT, para mais de 60 mg/L em 24 h (Fig. 4). Além disso, a liberação foi relativamente rápida com concentrações antimicrobianamente ativas sendo atingidas em 2–4 h. Em contraste, cloreto de cobre neutralizado em pH foi substrato pobre para liberação de cobre, como antecipado por sua tendência a hidrolisar e formar aglomerados de oxi-hidróxidos de cobre, então em 24 h, apenas 10 ± 7 mg/L cobre foram alcançados em solução (Fig. 4). CuO NPs comerciais não renderam liberação discernível de cobre (Fig. 4).

Discussão

Mostramos aqui que um nanomaterial baseado em cobre, a saber CHAT, pode ser formulado em altas concentrações, diferentemente de nanopartículas baseadas em cobre previamente descritas, enquanto retém suas propriedades como fonte lábil de cobre biodisponível com eficácia antimicrobiana. Como observado acima, a síntese de CHAT foi inspirada após muitos anos de trabalho prévio no análogo de ferro, IHAT. Este, por sua vez, foi inspirado pela solução da natureza para renovação mineral rápida in vivo, para reciclagem eficiente de íons metálicos essenciais, onde moléculas orgânicas são usadas para desestabilizar a estrutura cristalina de partículas minerais primárias. Nas versões sintéticas, ligantes GRAS são incorporados em oxi-hidróxidos metálicos conforme se formam em solução a partir de polímeros de entrelaçamento. Através de desestabilização estrutural, isso assegura labilidade da fase mineral final e também gera nanopartículas altamente negativas — como demonstrado pela medição de potencial zeta — que repelem aglomeração e agregação, produzindo suspensões de nanopartículas estáveis por anos. Aqui, e como previamente mostrado para IHAT, tartrato foi o ligante dominante para alcançar estas mudanças físico-químicas na estrutura de oxi-hidróxido de cobre, pois sua incorporação foi ca. 3 vezes maior que a de adipato — este comportando-se mais como tampão durante a síntese.

Na ausência de modificação, oxi-hidróxidos metálicos recém-precipitados aglomerarão e agregarão e começarão a envelhecer, condensando e aumentando gradualmente sua cristalinidade. Estas transições de tamanho e fase mineral reduzem a capacidade das estruturas de participar da reação reversa, ou seja, de re-dissolver. Portanto, não foi surpreendente que quando oxi-hidróxido de cobre foi recém-formado, da neutralização de pH de solução de cloreto de cobre, pelo menos algum cobre solúvel foi liberado em nosso ensaio de liberação em gel (Fig. 4), enquanto para CuO NPs comerciais, que eram aglomerados e compunham fase mineral mais condensada (óxido de cobre), cobre indetectável foi liberado. A falta de dissolução de nanopartículas comerciais de 30 nm — que, independentemente de seu estado de agregação, apresentariam grande área superficial para dissolução — mostra que fase mineral é um fator chave na liberação de íons de cobre e que, como observado acima, modificação das partículas primárias do mineral, alcançada aqui através de dopagem com ligantes, é realmente necessária para provocar mudança marcada nas características de dissolução. Além disso, a síntese de CHAT foi realizada à temperatura ambiente, já que temperatura sintética alta favorece fases menos amorfas que consequentemente podem reduzir taxas de dissolução. Também, síntese à temperatura ambiente tem benefício de reduzir custos energéticos na manufatura em escala.

Embora possa haver outras formas de formular altas concentrações estáveis de cobre que permitam liberação sustentada e dissolução rápida de íons quando requerido, não vislumbramos outra síntese tão direta e com custo de bens (para reagentes) tão baixo. Estes são fatores importantes pois a questão de infecções tópicas e resistência bacteriana não se restringe a países desenvolvidos. Países em desenvolvimento são cada vez mais assolados por questões de resistência bacteriana e soluções eficazes e acessíveis são urgentemente necessárias. Embora haja estudos insuficientes para alcançar soluções concretas, há evidências de que resistência a íons metálicos tóxicos é mais difícil para bactérias alcançar que resistência a antibióticos convencionais. A teoria baseia-se na ideia de que cobre e prata provavelmente não têm vias discretas de atividade antimicrobiana mas, sim, podem impactar múltiplos alvos incluindo vários sistemas enzimáticos e assim desestabilizar a estrutura celular bacteriana global. De fato, mostrou-se que bactérias permanecem suscetíveis a cobre e certos outros íons metálicos apesar de exposições ao longo de séculos. Curiosamente, há evidência recente de que antimicrobianos baseados em metal podem até restaurar sensibilidade bacteriana a antibióticos convencionais apesar de resistência prévia.

Conclusões

Demonstramos aqui que a questão de íons de cobre biodisponíveis, em pHs fisiológicos e altas concentrações, pode ser resolvida dopando um nanomineral de cobre com ácidos orgânicos, em estratégia similar à utilizada anteriormente para análogos de ferro. Estas nanopartículas baseadas em cobre (termedas CHAT) dissolveram-se prontamente no meio bacteriano, mostrando captação intracelular de cobre equivalente e atividade antibacteriana a sais de cobre solúveis. Criticamente, porém, e diferentemente de sais de cobre simples, CHAT pode ser concentrado em formulação de pH neutro e reter sua labilidade em termos de liberação de íons de cobre. De fato, CHAT liberou íons de cobre na faixa bactericida e poderia assim ser base para novo agente antimicrobiano tópico, seja sozinho ou aumentando eficácia de antibióticos resistentes. Com resistência a antibióticos aumentando, novos antimicrobianos tópicos são necessários e CHAT é barato, prontamente sintetizado, e usa componentes geralmente reconhecidos como seguros (GRAS). Estudos in vivo são justificados.

Abreviações

CHAT

Nanopartículas de hidróxido de cobre adipato tartrato

CuO NPs

Nanopartículas de óxido de cobre

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

Escherichia coli

E. coli

GRAS

Geralmente reconhecido como seguro

HEC

Hidroxietilcelulose

HMM

Meio MOPS para metais pesados

HPLC

Cromatografia líquida de alta eficiência

ICP-OES

Espectrometria de emissão óptica de plasma indutivamente acoplado

IHAT

Nanopartículas de hidróxido de ferro adipato tartrato

MOPS

Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico

Staphylococcus aureus

S. aureus

UHP

Ultra-alta pureza