Nanopartículas Biogênicas Núcleo-Casca Au@Ag Sintetizadas com Extrato de Rumex hymenosepalus para Aplicações Antimicrobianas

Resumo

Neste trabalho, usamos um método sequencial de síntese para nanopartículas bimetálicas ouro-prata com estrutura núcleo@casca (Au@AgNPs). Extrato de raiz de Rumex hymenosepalus (Rh), que apresenta alto teor de catequinas e estilbenos, foi usado como agente redutor na síntese de nanopartículas. Distribuição de tamanho obtida por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) dá diâmetro médio de 36 ± 11 nm para Au@AgNPs, 24 ± 4 nm para nanopartículas de ouro (AuNPs), e 13 ± 3 nm para nanopartículas de prata (AgNPs). As formas geométricas das NPs eram principalmente quasi-esféricas. A espessura da casca de prata sobre AuNPs é de cerca de 6 nm e coberta por biomoléculas ativas na superfície. Caracterização de nanopartículas incluiu imagens de campo escuro anular de alto ângulo (HAADF) registradas com microscópio eletrônico de transmissão de varredura (STEM), Espectroscopia de Raios X Dispersiva em Energia (EDS), Difração de Raios X (XRD), Espectroscopia UV-Vis, Potencial Zeta, e Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). Espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), e Espectroscopia de Fotoelétrons de Raios X (XPS) mostram que nanopartículas são estabilizadas por moléculas do extrato. Um estudo de cinética de crescimento foi realizado usando o modelo de Gompertz para microrganismos expostos a nanomateriais. Os resultados indicam que AgNPs e Au@AgNPs afetam a fase de latência e taxa de crescimento de Escherichia coli e Candida albicans de maneira dependente da dose, com melhor resposta para Au@AgNPs.

Introdução

Nos últimos 25 anos, vários métodos químicos têm sido estudados para síntese de nanomateriais; no entanto, a maioria desses métodos usa substâncias que são hostis ao meio ambiente e usam altas temperaturas ou equipamentos caros. Neste trabalho, realizamos a síntese de nanoestruturas ouro-prata usando o método de síntese verde. Este método minimiza a poluição desde o início. Usando processos "limpos", evitando a maior parte do resíduo e uso de poluentes perigosos no desenvolvimento de nanomateriais "limpos" que não representam ameaça à saúde ou ao meio ambiente.

A síntese verde de nanopartículas metálicas busca uma influência positiva da interação com sistemas biológicos, o que significa que nanopartículas e sua auto-funcionalização com moléculas de polifenol geram interações biológicas compatíveis com sistemas como células e macromoléculas. Em geral, essas interações biológicas são usadas como nanomedicina para doenças como câncer, diabetes e doenças neurodegenerativas. A síntese de prata (casca) e AuNPs como sistema núcleo-casca tem aplicações como sensores ópticos de diagnóstico, sensor molecular, terapias fototérmicas, antimicrobianos e melhora o processo catalítico comparado com NPs monometálicos.

Em particular, métodos sequenciais ou simultâneos em diferentes reatores, métodos químicos e físicos são usados para síntese bimetálica: pirólise por spray ultrassônico, método sonquímico, chip microfluídico, nanoprecipitação nanofluídica sequencial, microemulsões, lipossomos, agentes redutores usados são tipos químicos ou químicos verdes.

Materiais secos são usados na síntese de nanopartículas como óxidos metálicos, nanotubos de carbono, outros usam dispositivos eletrônicos macios impressos. Nanopartículas úmidas, usadas em sistemas biológicos, transportadores de fármacos, antimicrobianos, aplicação de sensoriamento e nanotecnologia computacional são uma classificação moderna usada para definir usos.

Khatami et al. revisaram a síntese verde usando plantas de nanopartículas tipo núcleo@casca, em particular, foram usadas Antigonon leptopus, Diopyros kaki, Azadirachta indica, Potamogeton pectinatus, Anacadium oceidentale para síntese de nanopartículas Au@Ag com tamanho entre 5 e 500 nm, foram testadas para diferentes aplicações (não antibacterianas), e Extrato de Raiz de Asparagus racemosus foi usado para síntese de nanopartículas de liga Au-Ag encontrando MIC a 480 µg/mL testado em Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, e Staphylococcus aureus. Au@Ag NPs obtidas por síntese química têm aplicações como antibacterianas, e o MIC relatado é em torno de 2,5 µg/mL para conteúdo de prata (casca), Lu et al. relataram uma síntese química de Au/AgNPs@Van preparados usando NaBH₄ e adição de Vancomicina e MIC foi 60 nmol/mL para nanopartículas bimetálicas testadas em bactérias Gram-positivas e negativas.

Propriedades antibacterianas de nanomateriais bimetálicos melhoram como função da concentração de Ag. Em contraste, um incremento na concentração de Au diminui as propriedades antibacterianas mas reduz o efeito citotóxico, ou seja, o material bimetálico torna-se mais biocompatível. Comparando o efeito de materiais monometálicos Au e Ag com materiais bimetálicos, demonstrou-se que um efeito sinérgico ocorre entre materiais bimetálicos, gerando efeitos bifuncionais.

Funcionalização de nanomateriais tem interesse particular desde o ambiente químico (pH, presença de enxofre, moléculas biocompatíveis, etc.) ao redor do sistema terá efeitos na interação com células ou microrganismos; portanto, a ênfase em gerar biomateriais usando química verde.

A composição química das partículas bimetálicas será um fator determinante em suas propriedades ópticas, devido ao efeito sinérgico de nanoestruturas monometálicas.

Neste trabalho, nanopartículas de ouro e prata foram sintetizadas usando como agente redutor um extrato de Rumex hymenosepalus, que é uma planta que contém moléculas de estilbenos e catequinas que atuam como poderosos antioxidantes na redução de íons metálicos. Nanopartículas de ouro foram usadas como núcleos para obter nanopartículas bimetálicas tipo núcleo@casca de Au@Ag através de um método de síntese sequencial. A caracterização de nanomateriais envolve as técnicas de HAADF-STEM, TEM com EDS e HRTEM.

Com os diferentes tipos de nanopartículas sintetizadas, um estudo comparativo foi realizado sobre a dinâmica de crescimento das bactérias E. coli e S. aureus e a levedura Candida albicans.

Seção Experimental

Materiais

As raízes de Rumex hymenosepalus foram adquiridas em um estabelecimento comercial da localidade. Ambos precursores HAuCl₄ e AgNO₃ para síntese de nanopartículas foram comprados da Sigma-Aldrich com pureza de 99%. Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo Potato Dextrose (PDB) usados para ensaios de microrganismos foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Etanol (99% puro) usado no processo de limpeza de nanopartículas foi adquirido da Fermont, e água ultrapura (milli-Q) foi usada nos experimentos.

Extrato de Rumex hymenosepalus

Para preparação do extrato, 150 g de raiz cortada em fatias e previamente desidratada foram macerados em 1000 mL de mistura etanol/água 70/30 V/V. A maceração foi realizada a temperatura ambiente em um recipiente de vidro com rolha hermética e protegido da luz. A absorbância da solução obtida foi monitorada por 21 dias até que não houvesse mudanças em seu valor. Neste momento, o processo de maceração foi considerado finalizado. O extrato obtido foi sucessivamente filtrado com filtros de papel Whatman com tamanhos de poro de 8 µm e 2 µm e finalmente com um filtro acrodisc de 0,22 µm. Etanol foi removido por rotaevaporação, e o concentrado de extrato aquoso foi congelado a -80 °C para liofilização (Labconco, FreeZone 1L). Os pós obtidos foram armazenados em recipientes estéreis protegidos da luz a temperatura ambiente até o uso.

Síntese de AuNPs

Primeiramente, solução aquosa de Rumex hymenosepalus foi preparada a 10 mg/mL a partir do extrato liofilizado. Depois 16 mL de solução de Rumex foi misturada com 32 mL de água ultrapura, mantendo agitação a 1000 rpm e foram adicionados lentamente 16 mL de HAuCl₄ (0,01 M). A reação foi mantida por uma hora sob condições de iluminação de laboratório e a temperatura ambiente. A intensidade de ressonância de plasmon de superfície (λSPR = 540 nm) foi avaliada por espectroscopia UV-Vis ao longo do tempo; quando nenhuma mudança foi observada, a síntese foi considerada completa. O produto obtido foi centrifugado a 12.000 rpm, o sobrenadante foi substituído por água ultrapura, e um processo de sonicação foi aplicado por 1 h para redispersar nanopartículas. O procedimento foi repetido três vezes mais. Água foi usada como solvente nas duas primeiras ocasiões e etanol na última. Finalmente, dispersão etanólica foi centrifugada, e precipitados secos em estufa de convecção a 40 °C para preparar dispersão aquosa de AuNPs a 2300 µg/mL.

Síntese de Au@AgNPs

Para síntese de Au@AgNPs, 2 mL de dispersão aquosa de AuNPs (2300 µg/mL), 0,8 mL de AgNO₃ (0,1 M), e 0,8 mL de solução de Rumex hymenosepalus (10 mg/mL) foram depositados em um tubo de cultura de vidro estéril. A mistura foi sonicada por 3 h em banho ultrassônico (Branson, Modelo 2510). Depois, o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm por uma hora, sólidos obtidos foram redispersos em água ultrapura por sonicação para obter concentração de 1000 µg/mL.

Síntese de AgNPs

Para produzir AgNPs, 16 mL de solução de extrato (10 mg/mL) foi misturada com 64 mL de água ultrapura, e 8 mL de AgNO₃ 0,1 M. A reação foi realizada por uma hora sob condições de iluminação de laboratório a 25 °C, e ressonância de plasmon de superfície (λSPR Ag = 440 nm) foi monitorada por espectroscopia UV-Vis ao longo do tempo para avaliar formação. O produto foi centrifugado a 12.000 rpm, o sobrenadante foi substituído por água ultrapura, e sonicação foi aplicada por 1 h. O procedimento foi repetido três vezes mais. Água foi usada como solvente nas duas primeiras ocasiões e etanol na última. Dispersão etanólica foi centrifugada e precipitados secos em estufa de convecção a 40 °C. Finalmente, pó de AgNPs obtido foi redisperso em água ultrapura por sonicação para gerar dispersão coloidal a 2000 µg/mL de concentração.

Caracterizações

Espectros de absorção UV-Vis foram obtidos em um espectrômetro de feixe duplo PerkinElmer Lambda 45. Uma fenda de 0,5 nm foi empregada, e espectros foram registrados a uma velocidade de 480 nm/min em uma faixa entre 200 e 900 nm. Para as nanopartículas, 50 µL de amostra e apenas 5 µL para o extrato foram usados. O volume final foi completado para 3 mL nas cubetas de quartzo usando água ultra-pura como solvente.

Potencial zeta (ζ) de AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs foram medidos usando um Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Cada amostra foi medida a temperatura ambiente (25 °C) em triplicata e como função de concentração a 1, 10, 50, e 100 µg/mL para cada amostra.

DLS para AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs foram medidos usando um Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) equipado com laser He-Ne de 633 nm. Cada amostra foi medida a temperatura ambiente (25 °C) em triplicata e como função de concentração a 1, 10, 50, e 100 µg/mL para cada amostra. Índice de Polidispersidade (PDI) foi determinado a partir de experimentos DLS usando software Malvern através da definição PDI = (σ/D̄)², onde D é o Diâmetro médio e σ é o desvio padrão de D. Valores de PDI com 0,10 ou menos são considerados altamente monodispersos.

O bandgap óptico Eg foi calculado para AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs, usando equação de Tauc determinar um bandgap em materiais pela seguinte relação: α = c/(hυ) (hυ - Eg)^(1/n), onde α é o coeficiente de absorção do material (α = 2,303 A/d onde A é absorbância e d é a largura da cubeta) e onde Eg é a energia de bandgap óptico e hυ é a energia do fóton obtida traçando uma linha entre (αhυ)^n e energia do fóton hυ. O número de índice n é tomado como 2 para transições permitidas diretas banda a banda nas amostras e pode ser prontamente avaliado com um gráfico de ajuste linear. Depende do tipo de transição que pode ter valores 1/2, 2, 3/2, e 3 correspondentes a transições permitidas diretas, permitidas indiretas, proibidas diretas, e proibidas indiretas, respectivamente.

Amostras AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs, e Rh foram analisadas através de absorção infravermelha usando um FTIR (PerkinElmer, Inc., Waltham, Spectrum Two). Os parâmetros de aquisição foram: resolução 4 cm⁻¹, 16 varreduras, e faixa de comprimento de onda entre 4000 e 900 cm⁻¹.

Ensaios de espectroscopia de fotoelétrons de raios X foram realizados em um modelo PerkinElmer PHI 5100, que contém fonte dual de Mg/Al, 300 W, 15 kV. A linha de emissão Mg Kα com energia de 1253,6 eV foi usada para AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs, e Rh. Todos os experimentos foram realizados sob condições de vácuo de 2 × 10⁻⁹ Torr. Dados foram analisados usando software Multipak. Para caracterização XPS, as diferentes dispersões de nanopartículas e a solução de extrato de Rumex hymenosepalus foram depositadas em lamínulas limpas da seguinte forma. 30 µL da amostra foi adicionado à lamínula permitindo secar completamente para o próximo depósito. O processo foi repetido pelo menos 5 vezes até que um filme fino foi formado e então caracterizado por XPS.

Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura de Campo Escuro Anular de Alto Ângulo (HAADF-STEM) pode ser considerada um modo de operação poderoso em microscopia eletrônica, que fornece grande quantidade de informação complementar elucida a estrutura de um nanomaterial. HAADF-STEM com correção de aberração pode determinar com resolução atômica as posições de átomos de diferentes naturezas químicas. Isso é devido ao HAADF-STEM com correção de aberração, conhecido por sua sensibilidade química e alta resolução espacial. Neste modo de operação, a imagem incoerente é dominante com contribuição negligenciável de contraste de difração. Assim, contraste de número atômico (contraste Z) em HAADF-STEM com correção de aberração nos permite determinar detalhes estruturais de nanoestruturas com grande precisão.

Para análise STEM, amostras foram analisadas em um microscópio eletrônico JEOL-JEMARM200 operando a 200 kV, com corretor CEOS para lente condensadora. Imagens STEM de contraste Z foram registradas simultaneamente nos modos BF e HAADF. Imagens foram registradas com abertura de lente condensadora de 40 mícron (ângulo de convergência 32-36 mrad) e tamanho de ponto de 9 pA.

Para análise de microscopia eletrônica, uma gota (10 µL) de suspensão de Au@AgNPs foi depositada em uma grade de carbono grosso de 300-mesh, seca a temperatura ambiente, e colocada em câmara de vácuo por 24 h.

Nanopartículas foram analisadas por TEM em aparelho Jeol 2010F (resolução 1,9 Å) a 200 kV. Análise EDS foi realizada usando um espectrômetro de raios X QUANTAX 200-TEM (Bruker) com detector XFlash 4010. Para análise HRTEM, micrografias TEM foram registradas em ampliações maiores que 100.000X. Espaçamentos interplanares de planos cristalinos foram determinados por análise de micrografia digital (3.0 Gatan Version). Preparação de amostra foi similar à descrita acima para análise STEM.

Dados foram coletados usando um sistema de difratômetro Bruker D8 QUEST equipado com monocromador de espelhos multicamadas e tubo selado Microfocus Cu Kα (λ = 1,54178 Å). Quadros foram coletados a T = 300 K via varreduras ω/φ e então processados para obter difratogramas de Intensidade vs. 2Theta. Software High Score Plus foi usado para tratamento de dados brutos e banco de dados de difração de pó ICSD associado com software foi implementado para análises de identificação de fase search-match.

Ensaio de Atividade Antibacteriana

Microrganismos testados foram bactérias Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 5538P), e levedura Candida albicans isolada de urina infectada coletada de um paciente adulto do sexo masculino com infecção do trato urinário (nosso estudo segue os princípios da Declaração de Helsinki). Brain Heart Infusion (BHI) e Potato Dextrose Broth (PDB) foram usados para preparar inóculo de bactérias e levedura, respectivamente. Culturas foram incubadas a 37 ºC durante a noite. A concentração em unidades formadoras de colônia (UFC/mL) por mililitro de suspensão foi determinada medindo a densidade óptica por UV-Vis a 540 nm para bactérias, 600 nm para levedura. Suspensões contendo 4 × 10⁸, 7,8 × 10⁸, e 2,5 × 10⁶ UFC/mL foram usadas para E. coli, S. aureus, e C. albicans, respectivamente. Atividade antimicrobiana foi testada em placas de 96 poços, usando meio de cultura líquido adicionado com nanopartículas e microrganismo a 37 ºC. Todos os testes foram realizados por triplicata. Absorbância foi medida em um leitor de placas multimodo Synergy HTX Biotek, usando software Gen 5. Todas as curvas de crescimento microbiano foram realizadas usando software Origin Lab 8.0. Como primeiro passo, 70 µL de meio de caldo fresco (BHI ou PDB, de acordo com os microrganismos estudados) misturado com nanopartículas na concentração requerida foram adicionados aos poços. Depois, 30 µL de suspensão de microrganismo foi adicionada aos poços e homogeneizada com o meio. O volume final em cada poço foi 100 µL. Após dispensar o inóculo, as placas de 96 poços foram lidas no espectrofotômetro descrito acima. Placas foram mantidas a 37 °C por 24 h, com modo de agitação circular antes de cada leitura com período de 15 min cada. A taxa de crescimento de microrganismos foi determinada por medição de densidade óptica (OD) no comprimento de onda mencionado.

Curvas de Crescimento Analisadas pelo Modelo de Gompertz

É bem conhecido na literatura que o modelo de crescimento de Gompertz descreve bem o crescimento de populações de microrganismos. Este modelo nos permite entender dois parâmetros críticos na descrição do crescimento da população de microrganismos: a fase adaptativa (fase de latência) e a taxa de crescimento da população. Em particular, estudar o comportamento da fase de latência em tratamentos inibitórios de microrganismos é relevante porque fornece informações sobre as respostas adaptativas do microrganismo ao tratamento e pode até dar indicações sobre o desenvolvimento de resistência do microrganismo ao tratamento avaliado.

O modelo de Gompertz modificado foi descrito por Zwietering et al. e adaptado por Li et al. e outros autores como um modelo que ajusta as curvas de crescimento e y = A exp { - exp [ (μe/A)(λ - t) + 1 ] }, onde A é o número de células expresso como OD₅₄₀ (S. aureus e E. coli) e OD₆₀₀ (C. albicans), μ é a taxa de crescimento na fase exponencial e e é o exponencial e¹, λ é a fase de latência. Ajustamos nossa cinética de crescimento usando software Origin 9.1 para analisar os efeitos sobre S. aureus, E. coli, e C. albicans dos três agentes AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs.

Efeito de Nanopartículas sobre Crescimento de E. coli, S. aureus, e C. albicans

Escherichia coli e Staphylococcus aureus foram inoculados em meio BHI, e C. albicans foi inoculado em caldo PD. Todas as culturas foram incubadas durante a noite a 36° C. Após incubação, as três culturas foram ajustadas a absorbância de 1, 0,7, e 1, respectivamente (λ = 540 nm). AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs foram ajustados a uma concentração de 50 µg/mL. Em uma placa de 96 microwells, culturas ajustadas foram expostas a nanopartículas em uma relação 7:3, atingindo um volume final de 200 µL cada microwell. Também, culturas ajustadas foram expostas a água esterilizada como condição de controle nas mesmas condições previamente descritas. Outros controles usados para este experimento foram meio fresco e cada solução de nanopartículas sem microrganismos. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, e Candida albicans foram expostos a AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs, respectivamente. Placa de microwell foi incubada a 36° C, e uma amostra de cada microrganismo em condições de tratamento e controle foi obtida a 1, 7, 13, e 19 h. Amostras coletadas foram diluidas em série 1:10 em solução salina e espalhadas sobre superfície de placas Müeller-Hinton. Placas inoculadas foram incubadas a 36 °C por 24 h. Após incubação, UFC/mL foram calculados usando contagem direta.

Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e Candida albicans foram inoculados cada um em caldo Müeller-Hinton incubado durante a noite a 36° C e ajustados a 0,5 Nefelômetro McFarland. Uma vez que inóculos foram ajustados para determinação da concentração inibitória mínima (MIC), um teste de microdiluição foi realizado. Brevemente, uma placa de 96 poços foi usada para este propósito. 160 µL de uma cultura ajustada de cada microrganismo foi vertida em 5 poços. Soluções de AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs de 1000 µg/mL foram preparadas. Soluções anteriores foram usadas para preparar soluções de 750, 500, e 250 µg/mL. Água esterilizada pura foi usada como 0 µg/mL de nanopartículas, e 40 µL de cada solução anterior foi adicionado a 160 µL de culturas ajustadas. Desta forma, cada cultura foi exposta a uma concentração final de 200, 150, 100, 50, e 0 µg/mL de cada nanopartícula testada. A microplaca foi incubada a 36° C por 24 h. Após isso, uma amostra de cada poço foi inoculada em uma superfície de Müeller-Hinton e incubada nas mesmas condições previamente descritas. Após incubação, placas Müeller-Hinton foram observadas procurando qualquer sinal de crescimento. A concentração onde nenhum sinal de crescimento foi observado foi registrada como valor de CBM.

Resultados e Discussões

Caracterização

A Figura 1a mostra os espectros de absorção UV-vis dos nanomateriais sintetizados. As absorbâncias foram normalizadas para o máximo de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) correspondente a cada sistema de nanopartículas.

Espectro de absorção de Au@AgNPs na Fig. 1a tem uma única banda centrada a 474 nm, que está localizada entre o LSPR de AgNPs (445 nm) e o LSPR de AuNPs (544 nm). A ausência de um pico de absorção semelhante a ouro em Au@AgNPs sugere que os nanomateriais obtidos por síntese sequencial são estruturas núcleo@casca. Não é possível detectar qualquer banda de absorção associada a Au pertencente ao núcleo. Alguns autores assumem que para sistemas núcleo@casca, os espectros de absorção são compostos de duas bandas associadas a cada um dos metais para espessuras de casca entre 3 e 4 nm. A absorção associada ao metal do núcleo desaparece para espessuras maiores, obtendo uma única banda de absorção onde a localização do máximo depende da razão espessura/tamanho do núcleo da partícula bimetálica.

Samal et al. sintetizaram nanopartículas núcleo@casca (Au@Ag) controlando tamanhos de núcleos e adicionando diferentes espessuras de cascas. Em particular, nosso resultado UV-vis para Au@AgNPs coincide com o relatado por Samal et al. para núcleos de ouro de 32 nm e espessura de prata maior que 15 nm, onde espectros são caracterizados por uma única banda de absorção (~ 450 nm), e a supressão de plasmons de superfície de Au é observada.

Adicionalmente, na Fig. 1a, absorção centrada a 280 nm (região destacada em azul) pode ser observada, correspondendo a moléculas do extrato de Rumex hymenosepalus usado como agente redutor em nossa síntese de nanopartículas. Arquivo adicional 1: Figura S1 corresponde ao espectro de absorção de solução aquosa de Rumex hymenosepalus. Uma banda característica centrada a 278 nm é observada, associada com transições eletrônicas de anéis aromáticos conjugados com grupos carbonila de compostos polifenólicos. Esta banda de absorção nos espectros UV-Vis das nanopartículas indica que os produtos finais contêm moléculas do extrato que permanecem neles. Rivero-Cruz et al. relataram quatro estilbenoides, dois flavan-3-óis, e três antraquinonas isolados de R. hymenosepalus e Rodríguez-León et al. realizaram um estudo de ressonância magnética nuclear para determinar que Rumex hymenosepalus contém moléculas importantes como glicosídeo de estilbeno e epicatequina galato e epigalocatequina galato. Estas moléculas participam como agentes redutores na síntese de nanopartículas. O processo envolve a desprotonação de alguns grupos -OH de anéis fenólicos para formar grupos =CO. Moléculas polifenólicas são oxidadas, e os elétrons liberados são transferidos para íons Ag⁺ e Au³⁺ para formar Au⁰ e Ag⁰.

A Figura 1b mostra os valores de potenciais Zeta correspondentes a AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs em concentrações de 1, 10, 50, e 100 µg/mL. Nanopartículas são dispersas em água ultrapura, e medição foi realizada por triplicata a 25 ℃. Em geral, ao longo da faixa de concentração, nanopartículas exibem valores de potencial zeta mais negativos que -30 mV, atingindo valores de -40 mV na concentração de 100 µg/mL para AuNPs e Au@AgNPs e -38 mV para AgNPs. Estes valores altamente negativos de potencial zeta indicam que nanopartículas experimentam interações repulsivas entre elas que previnem sua agregação e permitem a estabilidade a longo prazo de coloides metálicos. Correlacionando os resultados de espectroscopia UV-Vis com os valores de potencial zeta obtidos, podemos estabelecer que os valores altamente negativos podem ser devidos ao complexamento de moléculas polifenólicas do extrato na superfície da nanopartícula.

Para aplicações biológicas, é valioso obter população de nanopartículas com tamanhos monodispersos, então Fig. 1c e d mostram os valores de DLS correspondentes a diâmetro médio e índice de polidispersidade (PDI) para AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs em concentrações de 1, 10, 50, e 100 µg/mL. O diâmetro médio de Au@AgNPs é em torno de 250 nm e mantido constante como função de concentração, de maneira similar para nanopartículas monometálicas com diâmetro médio em torno de 122 e 135 nm para AuNPs e AgNPs, respectivamente. No mesmo caso observa-se que valores PDI é em torno de 0,3 para nanopartículas monometálicas e 0,2 para Au@AgNPs. Estes resultados, onde os tamanhos não variam com a concentração, indicam que os diferentes sistemas de nanopartículas têm boa estabilidade apresentando uma polidispersidade moderada de tamanhos (0,3 ≥ PDI ≥ 0,2).

O bandgap óptico do gráfico de Tauc foi computado (Arquivo adicional 1: Figura S2). Banda de condução por materiais semicondutores têm valores Eg < 3 eV, como referência germânio tem Eg < 0,7 eV e silício é Eg = 1,1 eV. No nosso caso, o bandgap para Au@AgNPs, AuNPs, e AgNPs é 1,93 eV, 2,03 eV, e 2,33 eV, respectivamente. Isso significa que esses materiais são considerados como semicondutores, e esta característica foi obtida para efeitos de confinamento quântico que produzem um bandgap de energia aumentado, então nanomateriais podem ser usados como sensores, baterias, e dispositivos optoeletrônicos.

Para estabelecer se compostos orgânicos estão presentes nas nanopartículas, esses nanomateriais foram caracterizados por XPS e FTIR. Figura 2a mostra os espectros de survey do extrato da planta e nanopartículas. Como pode ser visto, todos os sistemas de nanopartículas apresentam os sinais característicos associados aos elementos carbono (C 1s, 284,6 eV) e oxigênio (O 1s, 532,2 eV) do extrato de Rumex hymenosepalus. Este resultado confirma que moléculas orgânicas do extrato estão presentes nos nanomateriais obtidos. Adicionalmente, espectros XPS de alta resolução foram obtidos para analisar os estados de oxidação de prata e ouro nas nanopartículas (Arquivo adicional 1: Figura S3). Para AgNPs (Arquivo adicional 1: Figura S3A), os sinais em energias de ligação de 373,76 eV e 367,76 eV (ΔBE = 6,0 eV) correspondentes às linhas espectrais 3d3/2 e 3d5/2 podem ser associados com Ag⁰ (prata metálica). Para AuNPs (Arquivo adicional 1: Figura S3B), o pico associado com acoplamento spin-orbital 4f5/2 está localizado em energia de ligação 87,65 eV. Para 4f7/2, pico de acoplamento spin-orbital está localizado a 83,98 eV. A razão de intensidades (I4f7/2 > I4f5/2), localização, e separação entre picos (ΔBE = 3,67 eV) confirmam que íons de ouro (Au³⁺) são reduzidos completamente a ouro metálico Au⁰. Para Au@AgNPs, espectros XPS de alta resolução correspondentes a prata e ouro são mostrados no Arquivo adicional 1: Figura S3C e Figura S3-D, respectivamente. Estes espectros mostram o mesmo comportamento que seus contrapartes monometálicos. Isso indica que tanto prata quanto ouro são zero-valentes na apresentação núcleo@casca.

FTIR na Fig. 2e mostra a 3296 cm⁻¹ grupos hidroxila, 2974 cm⁻¹ (C-H) ligação do anel aromático, 1689 cm⁻¹ associado com estiramento de grupo carbonila (C=O), e 1689-1400 cm⁻¹ devido a ligação carboxilato (C-O) e estiramento de ligação carbono-carbono e 1212 cm⁻¹ associado com estiramento de fenol C-O conjugado com AuNPs, 1049 cm⁻¹ modo de estiramento C-O do grupo éster de catequina e 799 cm⁻¹ a flexão fora do plano no fenol, flexão C-H reportada a 964,4, e 829,39 cm⁻¹ característica de resveratrol deslocada no extrato Rh para 1031 e 867 cm⁻¹, respectivamente, e AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs são deslocados também o que é indicativo de complexação de moléculas polifenólicas do extrato Rh com nanopartículas.

Figura 3a corresponde a uma micrografia STEM de campo claro representativa do sistema Au@AgNPs em baixa ampliação (barra de escala 100 nm). Um conjunto de nanopartículas sem aglomeração e com geometria principalmente quasi-esférica pode ser visto. A mesma região é mostrada em campo escuro (HAADF) na Fig. 3b, e a estrutura núcleo@casca pode ser observada, onde podemos distinguir núcleo-Au parece mais intenso que casca-Ag, devido à diferença no número atômico. Figura 3c e d correspondem a micrografia STEM de maior ampliação (barra de escala 20 nm) de um grupo de nanopartículas do sistema núcleo@casca em campo claro e campo escuro, respectivamente. Pode ser apreciado com clareza núcleo Au brilhante e casca Ag levemente contrastada. Estas imagens mostram que a espessura da casca Ag varia entre 3 e 5 nm. Arquivo adicional 1: Figura S4 corresponde a uma galeria de imagens individuais onde pode ser observada uniformidade da casca Ag.

Figura 4a, c, e correspondem a micrografia TEM de sistemas representativos de nanopartículas AuNPs, AgNPs, e Au@AgNPs, respectivamente. Em todos os casos, nanopartículas têm morfologia tipo-esfera e são mostradas bem separadas umas das outras. Isso pode ser explicado pelas moléculas do extrato nas superfícies das nanopartículas, atuando como espaçadores entre elas. Figura 4b, d, f mostram histogramas correspondentes à distribuição de tamanho obtida por TEM e realizada com 500 nanopartículas coletadas de 15 a 20 micrografias para cada nanomaterial. O histograma apresenta distribuição Gaussiana com tamanho médio de 24 ± 4 nm (AuNPs), 13 ± 3 nm (AgNPs), e 36 ± 11 nm (Au@AgNPs). A discrepância em valores entre medições DLS e TEM com gráfico de distribuição de tamanho é devida a condições microambientais ao redor das nanopartículas, enquanto DLS mostra um diâmetro para um sistema que inclui metal, revestimento hidratado, e solvente por comparação em medições TEM é um sistema seco onde medição é sobre metal apenas, em particular, em DLS as moléculas usadas para complexação de nanopartículas (agentes redutores e estabilizadores) são dispersantes que induzem erros em medição de tamanho e deslocam seus resultados para valores maiores.

Figura 5 corresponde às micrografias HAADF-STEM de Au@AgNPs. Uma única nanopartícula é mostrada na Fig. 5a com núcleo de ouro e cobertura de prata perfeitamente delimitada, o número atômico (Z) muda através da interface Au@Ag, variações de intensidade podem ser quantificadas por HAADF-STEM.

A região de quadrado vermelho é amplificada para obter micrografia HRTEM da porção da casca (Fig. 5b), e então para verificar a estrutura cristalina da casca, a região periférica da nanopartícula foi analisada (quadrado descontínuo) com o software Digital Micrograph 3.0 (Gatan). Imagem de Transformada Rápida de Fourier (FFT) da área selecionada foi obtida (Fig. 5c). Usando a Transformada Rápida de Fourier Inversa foi possível estimar distâncias interplanares de 2,3 Å, 2,0 Å, e 1,4 Å na Fig. 5d. Estas distâncias podem ser atribuídas, respectivamente, aos planos cristalinos (111), (200), e (220) de prata cúbica de faces centradas (fcc) de acordo com Banco de Dados de Estrutura Cristalina Inorgânica (ICSD) no FIZ Karlsruhe-Instituto Leibniz para Infraestrutura de Informação, Alemanha ou software de cristalografia eletrônica Jems (V 4-5430, JEMS-SAAS, Suíça). Uma análise similar de estrutura cristalina por HRTEM foi realizada para nanopartículas monometálicas como ilustrado no Arquivo adicional 1: Figuras S5 (para AuNPs) e S6 (AgNPs). Em ambos os casos, estrutura cristalina corresponde a cúbica de faces centradas (fcc).

Análise química EDS mostra a presença de ambos os metais para um grupo de Au@AgNPs bimetálicos observados por TEM (Fig. 6a) em proporções de porcentagem de peso atômico 77% de Ag (casca) e 23% de Au (núcleos) (Fig. 6b). Em comparação, um único bimetálico (Fig. 6c) Au@AgNPs tem proporções em torno de 80% de Ag (casca) e 20% de Au (núcleo) (Fig. 6d). Para estimar a porcentagem atômica de ouro e prata em nanopartículas núcleo@casca (Au@Ag), uma aproximação de geometria quasi-esférica da morfologia de nanopartículas foi considerada. O diâmetro médio de AuNPs obtido da distribuição de tamanho TEM (D̄Au = 24 nm) foi usado para estimativa de volume do núcleo (VAu), e diâmetro médio de Au@AgNPs (D̄Au@Ag = 36 nm) para estimativa de volume núcleo@casca (VAu@Ag). Então, volume da casca é determinado como VAg = VAu@Ag - VAu. Conteúdo atômico total de Au e Ag foi calculado considerando uma estrutura cristalina fcc (4 átomos por célula unitária) para ambos os metais onde os parâmetros de rede de Au e Ag são 4,0783 Å e 4,0862 Å, respectivamente. Estimativa de conteúdo atômico por este procedimento é 70% para Ag (Casca) e 30% Au (Núcleo), que difere em 10% concernente a medição obtida por EDS. Figura 7 mostra uma estimativa teórica de conteúdo de prata e ouro e como varia conforme a espessura da casca aumenta e o tamanho do núcleo é mantido constante (D̄Au = 24 nm). Observa-se que para Au@AgNPs com diâmetro maior que 30,2 nm, o conteúdo atômico de prata excede o conteúdo de ouro. No Material Suplementar, uma descrição detalhada do cálculo é realizada para obter porcentagens de conteúdo atômico. Estimativas similares de porcentagens atômicas foram realizadas considerando outros diâmetros de núcleo Au e variando diâmetro de Au@AgNPs (Arquivo adicional 1: Figura S7A-B).

Figura 8 corresponde a padrões de DRX para AuNPs e AgNPs bem como Au@AgNPs bimetálicos. Todos os produtos sintetizados têm estrutura cristalina fcc como previamente reportado na caracterização por microscopia eletrônica. Picos para Au@AgNPs estão localizados em ângulos de difração 2θ de 38,25°, 44,4°, 64,9°, 77,85°, e 81,25°. Como pode ser apreciado na figura, os picos de difração de AgNPs e AuNPs são encontrados nas mesmas posições mencionadas com diferença de ± 0,5°. Isso é porque Au e Ag têm constantes de rede muito similares, então seus padrões de difração para estrutura cristalina fcc são quase idênticos. Desta forma, os picos de difração na Fig. 8 são atribuídos, respectivamente, aos planos cristalinos (111), (200), (220), (311), e (222) da estrutura fcc de ouro e prata por JCPDS: 4-0783 e 4-0784.

Atividade Antimicrobiana

Materiais monometálicos (AgNPs, AuNPs) e bimetálicos (Au@AgNPs) foram testados em quatro concentrações diferentes: 1, 10, 50, e 100 µg/mL. Microrganismos selecionados para avaliar atividade antimicrobiana foram levedura Candida albicans, bactéria Gram-positiva S. aureus, e bactéria Gram-negativa E. coli. Curvas de cinética de crescimento em um lapso de tempo de 24 h são mostradas na Fig. 9.

Candida albicans

AuNPs não mostram efeito na cinética de crescimento até 10 h (Fig. 9a), variando de maneira dependente da dose a absorbância atingida a 24 h. Curiosamente, com 50 µg/mL ou mais, a cinética de crescimento mostra uma inclinação negativa íngreme de 10 h até atingir redução de 45% a 24 h, o que sugere um efeito antifúngico destes materiais. Isso pode ser atribuído à habilidade de nanopartículas de ouro de interagir com proteínas relevantes presentes no fungo como H⁺-ATPase, afetando atividade de bomba de prótons. Isso atrofiando a habilidade da levedura de incorporar nutrientes causando sua morte. Na Fig. 9b e c foi observado que AgNPs e Au@AgNPs inibem o crescimento da levedura Candida albicans a partir de 10 µg/mL. A determinação da concentração MIC₅₀ para ambos materiais foi estimada a partir da curva dose-resposta mostrada no Arquivo adicional 1: Figura S8. MIC₅₀ é definida como a concentração de nanopartículas que produz uma diminuição de 50% na absorbância concernente ao controle (levedura sem tratamento). Para AgNPs e Au@AgNPs, MIC₅₀ foram 2,21 µg/mL e 2,37 µg/mL, respectivamente.

No entanto, de acordo com resultados de EDS (Fig. 9b), o conteúdo de prata em Au@AgNPs é 64,85% em massa. Assim, a concentração de prata em Au@AgNPs para MIC₅₀ é 1,53 µg/mL, 30% menor que no caso de AgNPs. Padmos et al. demonstraram que nanopartículas de prata possuem importantes características antibacterianas, mas são citotóxicas por células de mamíferos este efeito tem reduzido usando nanopartículas bimetálicas especialmente usando ouro no núcleo de nanopartículas bimetálicas.

Escherichia coli

Na Fig. 9d, AuNPs não mostram inibição significativa (< 15%) ou afetam a cinética de crescimento de E. coli. Para AgNPs (Fig. 9e) em baixas concentrações, a fase de latência permanece inalterada, mas há uma diminuição marcada na taxa de crescimento indicada pelo decremento da inclinação. A 50 µg/mL fase de latência dura até 16 h e viabilidade atinge máximo de 20% a 24 h. Para 100 µg/mL, um desprendimento aparente da fase de crescimento do microrganismo não é observado. Em Au@AgNPs (Fig. 9f), as duas primeiras concentrações não mostram mudanças em sua fase de crescimento, mas um atraso de fase de até 2 h é observado comparado ao controle. É interessante notar que a fase de latência dura até 21 h para a concentração de 50 µg/mL, finalmente não há comportamento de crescimento explícito para a concentração de 100 µg/mL.

Staphylococcus aureus

Uma análise comparativa de regeneração de fase de latência ocorreu após 12 h para Au (Fig. 9g), Ag (Fig. 9h), e Au@AgNPs (Fig. 9i) no caso de S. aureus a 50 µg/mL. Para a maior concentração a 100 µg/mL, não há crescimento da bactéria. Adicionalmente, observamos mudanças na inclinação em relação ao controle para Au, Ag, e Au@AgNPs a 1 e 10 µg/mL.

A interação de AuNPs com estas bactérias Gram-positivas poderia ser devida à superfície carregada que causa uma interação eletrostática, desestabilizando estrutura de membrana. Resultados similares, mas com maiores concentrações de NPs, são reportados para AuNPs sintetizadas usando extrato de fruta Ananas comosus como agente redutor e proteína de alga azul-verde Spirulina platensis. Yang et al. mostram MIC > 500 µg/mL para S. aureus (CMCC(B)26003), nossos AuNPs mostraram inibição com 10 vezes menor concentração; neste caso, uma sinergia crítica existe com moléculas de polifenóis no revestimento e estabilização da superfície de nanopartícula. ROS é gerado de menor a maior intensidade por AuNPs, polifenóis (extratos de plantas), e AgNPs, então AuNPs em sinergia com resveratrol e epigalocatequina galato (EGCG) promovem resposta antibacteriana sobre S. aureus teve o mecanismo mais viável neste caso. Penders et al. reportaram 250 e 500 µg/mL de AuNPs-como agentes antibacterianos sobre S. aureus aumentam tempo de latência de crescimento bacteriano e efeito antibacteriano.

Acreditamos que inibição é causada por AgNPs acumulação e difusão em bactérias relacionadas a cargas de superfície de NPs que promovem interações eletrostáticas com a membrana da bactéria levando a maior penetração e dano. Pensamos que este é um mecanismo similar descrito para interações entre biofilmes de E. coli e AgNPs.

Para Au@AgNPs, os resultados obtidos são comparáveis aos reportados por outros grupos de trabalho; no entanto, diferentes autores sugerem que a inibição do crescimento dos microrganismos está diretamente relacionada à espessura da casca. NPs núcleo-casca mostraram baixa citotoxicidade quando testadas em células de fibroblastos NIH-3T3 (células de mamíferos normais). Uma menor proporção de prata na casca de Au@AgNPs mostra resultados similares a AgNPs, e núcleo Au potencializa efeito antibacteriano, e minimiza citotoxicidade.

Curvas de Crescimento Analisadas pelo Modelo de Gompertz Modificado

Para saber como as taxas de crescimento (µ) e fase de latência (λ) são quantitativamente modificadas, as curvas de crescimento de microrganismos expostos a diferentes concentrações de nanomateriais (Fig. 10) foram ajustadas pelo modelo de Gompertz (Eq. 2).

Na Fig. 10a, pode-se ver que todos os nanomateriais produzem uma diminuição na taxa de replicação de populações de S. aureus quando a concentração de nanopartículas aumenta. Este efeito resulta em sensibilidade ligeiramente maior para AuNPs. Na concentração de 50 µg/mL, a taxa de crescimento é apenas 30% concernente ao controle (Arquivo adicional 1: Tabelas S1-S24); na concentração de 100 µg/mL, todos os materiais inibem o crescimento da população de S. aureus. O comportamento da fase adaptativa para S. aureus com os diferentes tratamentos é mostrado na Fig. 10b. Observa-se que não há diferenças significativas no material usado, e a 50 µg/mL, a fase de latência aumentou quase 5 vezes comparada à fase adaptativa de S. aureus (Arquivo adicional 1: Tabelas S1-S24). Em geral, podemos estabelecer que os diferentes nanomateriais avaliados em S. aureus reduzem a taxa de replicação e adiam a fase adaptativa de maneira dependente da dose até sua inibição a 100 µg/mL.

A Figura 10c mostra claramente que AuNPs não afetam a taxa de crescimento µ de bactérias E. coli. Enquanto isso, AgNPs produzem uma diminuição sobre µ, atingindo valor mínimo correspondente a 19% do controle (µ para E. coli sem tratamento) para 50 µg/mL (ver Arquivo adicional 1: Tabela S52). Em contraste, Au@AgNPs inibem completamente o crescimento de E. coli a 100 µg/mL. Análise do comportamento de fase de latência de E. coli exposto a diferentes materiais é mostrada na Fig. 10d. Neste caso, diferente da Fig. 10b, cada material tem uma resposta característica. Assim, AuNPs não geram nenhuma modificação na fase adaptativa de E. coli, enquanto AgNPs e Au@AgNPs têm efeito dependente da dose na fase de latência, o último material se destacando. Assim, podemos estabelecer que AuNPs não têm efeito apreciável em bactérias E. coli, e Au@AgNPs podem inibir replicação e, portanto, adiar indefinidamente a fase de latência de E. coli. Curiosamente, este efeito não é alcançado para AgNPs mesmo que o conteúdo líquido de prata seja maior que em Au@AgNPs. Isso sugere que a apresentação núcleo@casca de ambos os metais produz uma sinergia que favorece atividade antimicrobiana. Feng et al. reportaram um fenômeno de compensação eletrônica de Au para Ag em estruturas núcleo-casca e liga, que derivam em aumentar citotoxicidade de nanopartículas mas mantê-la as propriedades antibacterianas, isso significa, uma sinergia entre Au e Ag é assumida, devido a diferenças observadas entre materiais monometálicos e bimetálicos, mas mais pesquisa é necessária.

Figura 11 mostra os resultados do estudo de contagem direta de colônias de microrganismos expostos a nanomateriais. Em geral, o comportamento das populações de microrganismos reproduz os resultados obtidos do estudo de cinética de crescimento (Fig. 7a, e, i). Por exemplo, na Fig. 11a, a população de microrganismos (representada logaritmicamente) diminui significativamente apenas a 19 h onde AuNPs mataram 92% de C. albicans. Curiosamente, para nanopartículas contendo prata (Fig. 11b, c) um declínio populacional mais pronunciado é observado. Sistema Au@AgNPs a 50 µg/mL, inibe quase inteiramente S. aureus a 7 h (99,5% de bactérias mortas) embora microrganismo reative seu crescimento para tempos posteriores. Determinação de CBM não foi possível obter para concentrações testadas (Arquivo adicional 1: Figura S9-11), de acordo com observação experimental concentrações maiores são requeridas para mostrar este efeito. No entanto, para C. albicans, AgNPs mostraram valor de CBM de 50 µg/mL (Arquivo adicional 1: Tabela S55).

Conclusões

Pela primeira vez, a produção de nanopartículas de ouro e núcleo@casca (Au@Ag) é reportada usando extrato de raiz de Rumex hymenosepalus como agente redutor. Para obter Au@AgNPs é proposto um método sequencial de duas etapas que produz partículas com polidispersidade moderada e casca de prata homogênea. Determinação das curvas de crescimento e seus parâmetros obtidos através do modelo de Gompertz indicam diferentes efeitos dos nanomateriais sobre microrganismos avaliados. Efeitos inibitórios de AuNPs sobre S. aureus são atingidos a uma concentração de 5 vezes menor que reportado para outros AuNPs sintetizados por diferentes processos. Isso revela a importância do processo de síntese seguido e do ambiente na superfície das nanopartículas. Por outro lado, AgNPs e Au@AgNPs produzem um grande crescimento da fase de latência (> 12 h). No entanto, bactérias podem se adaptar e iniciar seu crescimento nestas concentrações sub-inibitórias com o consequente risco de gerar resistência a estes nanomateriais. Isso destaca a importância de realizar estudos de cinética de crescimento que cubram um período apropriado para descartar crescimento retardado. Curiosamente, análise de Gompertz indica que Au@AgNPs apresentam um efeito maior na cinética de crescimento de microrganismos que mostrado por nanopartículas monometálicas, o que pode ser atribuído a um efeito sinérgico de ambos os metais na estrutura núcleo@casca. Efeitos bactericidas são apenas alcançados em C. albicans exposto a AgNPs. Mais experimentos devem ser realizados em faixas de concentração maiores destes nanomateriais (> 200 µg/mL) para determinar seu CBM nos microrganismos estudados.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo e seu arquivo de informação suplementar.

Abreviações

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

AgNPs:

Nanopartículas de prata

Au@AgNPs:

Nanopartículas bimetálicas ouro-prata com estrutura núcleo@casca

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

EDS:

Espectroscopia de raios X dispersiva em energia

EGCG:

Epigalocatequina galato

FTIR:

Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier

HAADF:

Imagens de campo escuro anular de alto ângulo

MBC:

Concentração bactericida mínima

MIC:

Concentração inibitória mínima

Rh:

Extrato de raiz de Rumex hymenosepalus

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

STEM:

Microscópio eletrônico de transmissão de varredura

UV-Vis:

Espectroscopia ultravioleta-visível

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X

XRD:

Difração de raios X