Conjugação química de amina-aldeído em uma superfície ELISA de poliestireno tratada com hidróxido de potássio para nanossensibilização de um antígeno HIV-p24

Resumo

O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) tem sido amplamente utilizado para vigilância de doenças e rastreamento de drogas devido à sua precisão e sensibilidade relativamente maiores. O ajuste fino do ELISA é obrigatório para elevar a detecção específica de biomoléculas em uma abundância menor. Para este fim, a captura molecular mais elevada na superfície do ELISA de poliestireno (PS) é crucial para a detecção eficiente, e pode ser obtida através da imobilização das moléculas na orientação correta. É altamente desafiador imobilizar moléculas de proteína de uma maneira bem alinhada em uma superfície de ELISA devido às variações de carga. Empregamos uma estratégia química de superfície de PS acoplada a 3- (aminopropil) trietoxissilano (APTES) e glutaraldeído (GLU) para demonstrar o alto desempenho com ELISA. Um tratamento com hidróxido de potássio seguido por uma proporção igual de APTES a 1% e fixação de GLU foi considerado ideal, e uma incubação mais longa com GLU favoreceu a sensibilidade máxima. O p24 é um antígeno secretor precoce vital para o diagnóstico do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e tem sido usado para detecção eficiente com a química acima. Três procedimentos diferentes foram seguidos, e eles levaram à detecção aprimorada do antígeno HIV-p24 a 1 nM, que é um nível 30 vezes maior em comparação com uma superfície de ELISA convencional. A funcionalização química de superfície mostrada aqui também exibe uma especificidade mais alta com soro humano e HIV-TAT. A abordagem acima com a química da superfície projetada também pode ser recomendada para o diagnóstico de doenças em outras superfícies de detecção envolvendo a interação da sonda e do analito em amostras de teste heterogêneas.

Histórico

A detecção de biomarcadores de doenças e antígenos de superfície em patógenos intactos é necessária no campo do diagnóstico médico para estender a vida humana e apoiar vidas mais saudáveis. Diferentes sistemas de detecção estão disponíveis para diagnosticar patógenos e doenças potencialmente fatais, incluindo cânceres [1,2,3,4]. A gama de sondas e estratégias de detecção tem demonstrado identificar várias doenças [5, 6]. Entre esses resultados, o ensaio imunoenzimático (ELISA) é uma estratégia bem estabelecida para detectar e diagnosticar as principais doenças, incluindo HIV, e o ELISA foi considerado um teste de controle de qualidade [7,8,9,10]. Como um imunoensaio, o ELISA detecta o antígeno usando o anticorpo apropriado. Para cumprir esse papel, o antígeno é imobilizado em uma superfície de poliestireno (PS) e, em seguida, interage com o anticorpo parceiro (anticorpo primário), seguido pelo anticorpo específico do hospedeiro (anticorpo secundário) com a enzima conjugada, que pode se ligar a o anticorpo primário. Finalmente, essas interações moleculares são monitoradas por um substrato adequado. Os pesquisadores usaram diferentes abordagens baseadas em ELISA, incluindo o método sanduíche com anticorpos poli- e monoclonais adequados ou combinações de aptâmero-anticorpo para melhorar as detecções [11,12,13,14].

A sensibilidade de um ELISA depende de parâmetros como a interação entre o antígeno e o anticorpo, a temperatura, o pH e a eficiência da fixação do antígeno na superfície do PS. Dentre esses fatores, a imobilização do antígeno ou anticorpo na placa de PS desempenha um papel crucial na melhoria do limite de detecção. Além disso, a limitação imposta pela ligação e a distribuição não uniforme da proteína na superfície do PS afeta fortemente a sensibilidade do ensaio [5]. Uma quantidade maior com a imobilização adequada de proteínas auxilia na obtenção da orientação correta na superfície do PS para possíveis melhorias na detecção. Diferentes estratégias têm sido empregadas para imobilizar proteínas adequadamente na superfície do PS. Uma proteína ou anticorpo tem a capacidade de se imobilizar na placa PS simplesmente por adsorção química ou física ou interação eletrostática. Bora et al. [15] imobilizaram a proteína na superfície do PS usando fotoquímica e encontraram melhorias de até 1,5 a 2 vezes maiores em comparação com a superfície não tratada. Em outro estudo, foi demonstrada a imobilização eficiente da proteína na placa PS com um polímero denominado polivinil benzil lactonoilamida (PVLA) [16]. Polímeros à base de polietilenoglicol (PEG) também proporcionaram a imobilização eficiente de biomoléculas em superfícies de detecção. Lakshmipriya et al. [17] desenvolveram uma detecção aprimorada do fator de coagulação da proteína IX ao imobilizar seu oligômero tiolado junto com dois polímeros (PEG-b-PAAc e N6-PEG) em uma superfície revestida de ouro.

Na superfície da placa ELISA, o PS é composto de uma cadeia de carbono alifática com anéis de benzeno pendentes em cada carbono e fornece uma superfície hidrofóbica. O grupo carboxila na superfície do PS liga-se ao antígeno ou anticorpo por meio de uma interação eletrostática com seus grupos amina expostos. No entanto, essa estratégia de ligação apresenta desvantagens, como a menor ligação de proteínas e o posicionamento irregular das moléculas. As proteínas e peptídeos de menor tamanho com um menor número de composições de aminoácidos são especialmente difíceis de ligar na superfície de PS devido à disponibilidade de menos epítopos. Além disso, foi demonstrado que, se as moléculas no substrato de detecção estiverem aglomeradas, a distância entre as sondas é muito perturbada para se envolver em uma interação genuína. Por esse motivo, aumentar a ligação de uma proteína ou anticorpo na placa de PS com a orientação adequada melhora o limite de detecção. Em geral, as proteínas são imobilizadas diretamente na superfície do ELISA e os pesquisadores estão focados em melhorar a imobilização da proteína na superfície do ELISA para desenvolver a detecção de alto desempenho. Em particular, a imobilização de proteínas por funcionalização química na superfície do PS tem sido observada por vários pesquisadores para melhorar esta estratégia. A modificação química à base de amina é eficaz na imobilização de diferentes anticorpos por meio do reticulador apropriado. 3- (Aminopropil) trietoxissilano (APTES) é comumente usado para modificar a superfície de detecção para uso com aminas. O anticorpo pode ser imobilizado na superfície de APTES modificados por amina por meio de seu grupo COOH. No entanto, a imobilização da proteína não pode ser ligada diretamente na superfície da amina como o anticorpo; em particular, proteínas de menor tamanho requerem um agente de reticulação adequado. Aqui, introduzimos uma imobilização de etapa simples para proteína usando uma modificação química com APTES e glutaraldeído (GLU). Imobilizamos as proteínas covalentemente na superfície modificada com amina e ligamos usando GLU. GLU é um composto orgânico com a fórmula CH ₂ (CH ₂ CHO) ₂ , e verificou-se que é um dos agentes de reticulação de proteínas mais eficazes [4, 18,19,20]. Possui dois grupos aldeído em suas extremidades; uma extremidade liga-se à superfície ELISA modificada por amina e a outra extremidade está livre para se ligar à proteína ou ao anticorpo. Em geral, a imobilização de proteínas ou peptídeos de menor tamanho na superfície do ELISA é realmente um desafio devido à presença de menos aminas em sua superfície. Com a estratégia de funcionalização química, existe a possibilidade de utilizar proteínas ou peptídeos de menor porte para imobilizar fortemente o material na placa de ELISA PS. Para nosso método, usamos APTES-GLU como o linker; usando essa modificação, podemos imobilizar qualquer tipo de anticorpos, proteínas e peptídeos. Os aumentos de sinal e sensibilidade sob esta estratégia são maiores em comparação com outras estratégias químicas exploradas no passado [3, 4].

Para demonstrar a vantagem dessas químicas, escolhemos a detecção de uma das principais proteínas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (p24), que é expressa no estágio inicial da infecção pelo HIV. O antígeno p24 é composto do núcleo viral e está presente em um nível mais elevado durante a primeira semana de infecção. Portanto, é ideal para gerar um sistema sensível usando p24 para detecção precoce de HIV. Aqui, a detecção de p24 foi gerada usando a superfície ELISA quimicamente modificada acima mencionada. Esta estratégia de funcionalização química melhorou a detecção de p24 na superfície PS ELISA em várias dobras e pode ser recomendada para a detecção de outros biomarcadores clínicos importantes.

Materiais e métodos

Reagentes e biomoléculas

As proteínas HIV-p24 e Tat recombinantes e o anticorpo p24 foram adquiridos na Abcam (Malásia). 3- (Aminopropil) trietoxissilano (APTES), glutaraldeído (GLU) e soro humano foram adquiridos na Sigma-Aldrich (EUA). A peroxidase de rábano conjugada com IgG anti-camundongo (imunoglobulina anti-camundongo HRP) foi obtida da Thermo Scientific (EUA). Uma placa ELISA foi adquirida da Becton Dickinson (França). Um tampão de revestimento ELISA 5X foi obtido da Biolegend (UK). A albumina de soro bovino (BSA) e o substrato HRP [3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)] foram obtidos da Promega (EUA). O leitor de ELISA analítico foi obtido na Fisher Scientific (Malásia).

Níveis ideais de APTES e GLU para funcionalização na superfície do PS

A otimização dos níveis de APTES e GLU para uso na superfície de PS foi realizada com o antígeno p24 do HIV direcionado. Para decidir as concentrações adequadas de APTES e GLU, a superfície do ELISA foi primeiro ativada por hidróxido de potássio a 1% por 10 min. Em seguida, três quantidades diferentes de APTES (0,5, 1 e 2%) foram permitidas a se ligar na superfície do ELISA e foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente (TA). Em seguida, duas quantidades diferentes de GLU (1 e 2%) foram aplicadas na superfície do PS modificado com amina. Nesse ponto, HIV-p24 a uma concentração de 250 nM foi permitido ligar na superfície modificada com GLU, e a superfície de GLU restante foi bloqueada com BSA a 2%. O anticorpo p24 foi introduzido a uma diluição de 1:1000 e, em seguida, IgG-HRP anti-rato foi permitido ligar ao anticorpo p24. Finalmente, essas interações foram monitoradas pela adição do substrato (3,3 ′, 5,5′-tetrametilbenzidina, TMB) para HRP. Após a adição da quantidade ideal de substrato (100 mM), a absorbância foi lida com um leitor de ELISA a 405 nm. Os experimentos de controle foram realizados na ausência do HIV-p24 alvo.

Otimização da ligação do aldeído ao grupo amina

Para determinar o tempo de incubação adequado para o GLU ligar as superfícies modificadas com amina, foram observados dois tempos de incubação diferentes. Após a superfície ELISA PS ter sido modificada com APTES, o GLU foi imobilizado por 3 h e incubado independentemente durante a noite, e então o antígeno 250 nM HIV-p24 foi imobilizado nas superfícies modificadas com GLU. As etapas restantes foram seguidas conforme mostrado no experimento anterior.

Detecções comparativas entre o antígeno HIV-p24 na superfície modificada por GLU e os anexos do antígeno GLU pré-misturado HIV-p24

Para detectar o antígeno HIV-p24 na superfície de ELISA, comparamos duas abordagens diferentes de modificação de superfície usando GLU. No primeiro (método 1:amina-GLU-p24), a superfície do PS foi inicialmente modificada por uma amina usando 2% de APTES, 2% de GLU foi adicionado à superfície para amarrar a superfície da placa com um grupo aldeído e, em seguida, 100 O antígeno nM HIV-p24 foi adicionado. Na segunda abordagem (método 2:amina-GLU pré-misturado com p24), depois que a superfície foi modificada por uma amina, GLU-p24 (2% de GLU foi misturado com 100 nM de antígeno HIV-p24 e mantido em temperatura ambiente por 30 min) foi adicionado. Finalmente, a detecção foi realizada usando o anticorpo p24. As outras etapas foram realizadas conforme explicado acima. Os experimentos de controle foram realizados na ausência do HIV-p24 alvo.

Limite de detecção:ELISA convencional x ELISA quimicamente modificado

Para verificar o limite de detecção, diferentes concentrações de p24 foram tituladas de 0,5 a 500 nM, e foram avaliadas usando os métodos convencionais e os métodos 1 e 2.

Método convencional

O antígeno HIV-p24 foi inicialmente diluído com tampão de revestimento de ELISA a 1%, adicionado à superfície de ELISA e mantido a 4 ° C durante a noite e, em seguida, as áreas restantes foram bloqueadas com BSA a 2% por 1 h em temperatura ambiente. Depois disso, uma diluição de 1:1000 de anticorpo p24 foi adicionada e incubada por 1 h, e então uma diluição de 1:1000 de anti-IgG de camundongo-HRP foi adicionada à superfície de ELISA e deixada em repouso por 1 h. Finalmente, o substrato HRP (TMB) foi adicionado e medido em um comprimento de onda de 405 nm usando o leitor de ELISA.

Método 1

Diferentes concentrações de antígeno HIV-p24 foram adicionadas às superfícies modificadas por APTES e GLU. Após a imobilização do antígeno, as etapas restantes foram seguidas conforme estabelecido no ELISA convencional. As lavagens foram realizadas cinco vezes entre cada etapa de imobilização. A absorbância foi registrada em um comprimento de onda de 405 nm usando o leitor de ELISA, e as fotografias foram tiradas.

Método 2

Na placa de ELISA modificada por APTES, diferentes concentrações de p24 pré-misturado com GLU foram imobilizadas. Todas as outras etapas utilizadas para o ELISA convencional foram seguidas. As lavagens foram realizadas cinco vezes entre cada etapa de imobilização. A absorbância foi registrada em um comprimento de onda de 405 nm usando o leitor de ELISA, e as fotografias foram registradas. Os experimentos de controle foram realizados na ausência do HIV-p24 alvo.

Detecção específica do antígeno HIV-p24 na superfície modificada por APTES

Para verificar a especificidade do ensaio, realizamos dois experimentos de controle diferentes. Em vez do antígeno HIV-p24, usamos soro humano ou proteína HIV-TAT pré-misturada com 1% de GLU e os adicionamos à superfície modificada por APTES. Todas as outras etapas foram seguidas conforme explicado acima. Os experimentos de controle foram realizados na ausência do HIV-p24 alvo.

Resultados e discussão

O ensaio imunoenzimático (ELISA) é um imunoensaio eficaz que ajuda os pesquisadores a identificar diferentes biomoléculas usando anticorpos apropriados. Uma alta imobilização de analitos (proteínas, peptídeos, anticorpos e aptâmeros) [21,22,23] e a capacidade de capturar moléculas (anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e regiões Fc de anticorpos) [24, 25] podem melhorar drasticamente o limite de detecção e auxiliar no suporte à especificidade da análise. Com isso em mente, vários tipos de pesquisa estão focados na modificação química da superfície do ELISA para capturar a sonda ou analito devidamente orientada em uma quantidade maior. Em geral, um anticorpo ou proteína é imobilizado na superfície de ELISA PS por meio de uma interação eletrostática entre o grupo carboxila no PS e os grupos amina na proteína ou anticorpo. No entanto, este método não é eficiente o suficiente para atingir uma maior sensibilidade e especificidade devido à sua limitação de ligação. Para superar essa questão fundamental, durante a presente investigação, preparamos uma superfície ELISA quimicamente funcionalizada usando 3- (aminopropil) trietoxissilano (APTES) e glutaraldeído (GLU) para imobilização eficiente de proteínas. Como mostrado na Fig. 1a, uma superfície de PS ativada por hidróxido de potássio foi modificada por uma amina usando APTES e então reticulada com GLU para anexar a proteína. Na ausência de um tratamento com hidróxido de potássio, o nível ideal de APTES ligado à superfície PS é significativamente menor devido à ausência de um aceitador de ligação de hidrogênio polar que aumenta a adsorção inicial e desencadeará uma ligação mais elevada de APTES. A Figura 1b mostra a detecção proposta de proteína imobilizada na superfície de ELISA quimicamente modificada com seu anticorpo parceiro.

Representação esquemática de ELISA quimicamente modificado ( a ) A superfície do ELISA foi modificada quimicamente com APTES e GLU após tratamento com hidróxido de potássio. O antígeno foi imobilizado na superfície modificada com GLU. b O antígeno imobilizado foi detectado por seu anticorpo parceiro

Para coletar evidências sobre essa estratégia de detecção, queríamos usar uma proteína importante do vírus da imunodeficiência humana (HIV) chamada p24. O antígeno HIV-p24 é uma das proteínas que poderiam ser expressas durante o estágio inicial da infecção pelo HIV e se multiplica no sistema hospedeiro conforme revelado em outros sistemas virais (Fig. 2). O HIV intacto tem glicoproteínas no envelope que cobre o capsídeo, e o antígeno HIV-p24 reside na região do capsídeo (Fig. 3a). Antes de detectar o antígeno HIV-p24, inicialmente otimizamos a concentração do ligante químico para capturar o antígeno HIV-p24 na superfície do ELISA. Exploramos diferentes concentrações e combinações de APTES e GLU na superfície do ELISA e avaliamos os resultados usando uma concentração constante de 250 nM de antígeno HIV-p24. Como mostrado na Fig. 3b e c, a aplicação de APTES e GLU a 1% mostrou um nível saturado de ligação ao antígeno HIV-p24. Se o APTES estiver presente a menos de 1%, a absorbância de ligação (DO) é menor, ao mesmo tempo que o APTES 2%, devido a um aumento na inespecificidade (em referência ao experimento de controle). Para GLU, o nível de 2% mostra uma boa detecção do antígeno HIV-p24 a uma absorvância de 0,25 e, simultaneamente, o experimento de controle (sem HIV-p24) exibe a maior absorvância (0,16). O APTES e GLU ótimos de 1% mostram a menor absorbância no experimento de controle (0,08) e a maior absorbância (0,22) durante a detecção específica do antígeno HIV-p24. Esse resultado ocorreu porque, com o aumento de APTES e GLU, é possível capturar o anticorpo nas superfícies de amina livre remanescente (proveniente de APTES) e superfícies de aldeído (originado de GLU). Este resultado é o mesmo mesmo quando as regiões da superfície livre foram bloqueadas com BSA nos casos acima. Para ajustar o método ainda mais, também fizemos uma tentativa de aumentar a concentração de BSA para minimizar o sinal de fundo. No entanto, mesmo na concentração mais alta de APTES e GLU, houve bioincrustação. Com base nesses resultados, a condição otimizada é 1% APTES e GLU, conforme utilizado nos experimentos.

HIV e interação da célula hospedeira. A estratégia geral de multiplicação do HIV é mostrada

a Estrutura intacta do HIV. O antígeno p24 é indicado. b A otimização de APTES e GLU. APTES (0,5, 1 e 2%) e GLU (1 e 2%) foram usados ​​com diferentes combinações para detectar a concentração constante (250 nM) do antígeno HIV-p24

Após a otimização do APTES e do GLU, também ajustamos o tempo de incubação para ligar o GLU à superfície modificada por APTES. Conforme mostrado na Fig. 4a, incubar o GLU durante a noite leva à maior absorvância em comparação com o tempo de incubação mais curto (3 h). Este resultado ocorre devido ao tempo de incubação insuficiente para que o GLU se ligue à superfície modificada por APTES; em última análise, o anticorpo é capaz de se ligar às superfícies APTES restantes. Com um maior tempo de incubação para GLU, este composto tem a chance de cobrir completamente a superfície do APTES. Esta saturação aumenta a imobilização da proteína na superfície GLU e aumenta a sensibilidade do ensaio. Na concentração de HIV-p24 de 250 nM, há uma absorvância quase duas vezes maior com a incubação noturna de GLU (Fig. 4a).

Otimização do período de incubação para GLU. a Otimizado para ter um período de incubação de 3 he uma incubação durante a noite usando 1% de GLU em uma superfície modificada por APTES a 1%. b Detecção de 125 nM de p24 por três abordagens diferentes, convencional, APTES-GLU-p24 (método 1) e APTES-GLU-p24 pré-misturado (método 2)

Devido ao maior sinal genuíno após a incubação durante a noite de GLU com o aumento da absorvância e detecção específica de p24, usamos uma condição semelhante para outros experimentos. Nesse caso, imobilizamos o GLU na superfície modificada por APTES e, em seguida, anexamos a proteína (método 1). Também tentamos outra abordagem; primeiro, misturamos 1% de GLU com 125 nM de antígeno HIV-p24 e, em seguida, adicionamos essa mistura à superfície de PS modificada por amina (método 2). Surpreendentemente, houve um aumento da absorbância com a mesma concentração de antígeno HIV-p24 (de OD 0,161 a 0,23) que a concentração usada no método 2. Quando permitimos que a proteína se ligasse ao GLU como a pré-mistura, quase todas as proteínas foram capaz de ligar o GLU, e então essa mistura facilmente adsorvida na superfície modificada com amina. No entanto, quando foi permitido que a proteína se ligasse à superfície de GLU pré-imobilizada, a maioria dos grupos aldeído de GLU não estavam disponíveis. A Figura 4b indica que o método de mistura mostra a detecção de uma concentração semelhante (125 nM) de antígeno HIV-p24 com uma absorvância mais alta. Além disso, os métodos 1 e 2 exibiram absorvância mais alta em comparação com o método convencional na mesma concentração do antígeno HIV-p24.

Após a otimização completa das etapas de detecção, para encontrar o limite de detecção, titulamos o antígeno HIV-p24 de faixas picomolar a nanomolar (500 pM a 500 nM). Comparamos três métodos diferentes, a saber, o convencional, APTES-GLU-p24 (método 1:p24 imobilizado em APTES seguido de modificação de GLU) e APTES-GLU pré-misturado de HIV-p24 (método 2:a pré-mistura de p24 e GLU seguido por imobilização no APTES) com a mesma concentração de p24. Como mostrado na Fig. 5, o limite de detecção para p24 foi encontrado ser 30 nM para o ELISA convencional. No método 1, o limite de detecção foi melhorado oito vezes (4 nM) em comparação com o ELISA convencional. Esse resultado ocorreu porque quando usamos a superfície de PS modificada quimicamente, a imobilização da proteína foi estável sob o arranjo uniforme e a taxa de imobilização também foi bastante elevada em comparação com a adsorção convencional de proteínas na superfície de ELISA. Vashist et al. [12] já mostraram que a maior imobilização de um anticorpo na superfície do ELISA modificado por APTES foi associada a um nível de detecção dramaticamente melhorado em comparação com o ELISA convencional [12]. Em seu trabalho, a amina do APTES pode ligar grupos carboxila no anticorpo e, dessa forma, imobilizar o anticorpo quimicamente na superfície do ELISA. Usando este método, podemos apenas imobilizar os anticorpos na superfície do ELISA através de seus grupos carboxila, mas a imobilização do antígeno à base de proteína não é possível no APTES. Para tanto, introduzimos o ligante GLU para imobilizar a proteína na superfície do ELISA PS. Com esses ligantes químicos, não apenas a proteína, mas também um anticorpo foi quimicamente ligado por meio do acoplamento de amina ao aldeído no glutaraldeído. A fixação inespecífica de biomoléculas no substrato ELISA foi monitorada usando os experimentos de controle. Uma experiência de controle foi realizada sem a molécula alvo (HIV-p24). Sem o alvo, o anticorpo específico para p24 não pode se ligar na superfície e, portanto, o anticorpo secundário conjugado com enzima também não é imobilizado na superfície de ELISA. Neste caso, ao adicionarmos o substrato (TMB), não conseguimos encontrar nenhuma alteração na absorbância.

Limite de detecção para o antígeno HIV-p24. O p24 foi titulado de 0,5 a 500 nM. Três abordagens diferentes foram seguidas, convencionais e métodos 1 e 2

Para melhorar o limite de detecção, tentamos pré-misturar GLU e o antígeno HIV-p24 antes da etapa de imobilização na superfície modificada por APTES. Esperava-se que a pré-mistura do antígeno GLU e HIV-p24 melhorasse com a maior imobilização das proteínas na superfície do ELISA. Quando pré-misturamos GLU com o antígeno HIV-p24, a proporção de ligação de aldeído a GLU é alta. Quando adicionamos esta mistura à superfície do ELISA, melhora a taxa de imobilização. Dixit et al. descobriram que quando eles pré-misturaram o anticorpo e APTES antes da imobilização na placa de ELISA, sua abordagem aumentou a imobilização do anticorpo na superfície de ELISA e o limite de detecção foi aumentado [12]. Em nosso estudo, como esperado, quando pré-misturamos o antígeno GLU e HIV-p24 antes da imobilização, o limite de detecção foi aumentado para 1 nM e foi 30 vezes maior do que o ELISA convencional, que apresentou um limite de detecção de 30 nM. Nossa estratégia não apenas melhorou o limite de detecção, mas também melhorou a absorbância para todas as concentrações do antígeno HIV-p24. A 250 nM de p24, observamos que a absorbância foi de 0,35, o que é quase o dobro do ELISA convencional com a mesma concentração de antígeno HIV-p24. Com todas as concentrações do antígeno HIV-p24, uma grande diferença na absorbância foi observada em comparação com o ELISA convencional (Fig. 5), conforme evidente na detecção confiável do antígeno HIV-p24.

Para avaliar a especificidade do ensaio, realizamos o teste com dois experimentos de controle diferentes. Escolhemos soro humano e HIV-TAT e misturamos com GLU em vez do antígeno HIV-p24 antes do uso e avaliamos sua especificidade. Como mostrado na Fig. 6, no caso de soro humano e HIV-TAT, não há absorvância significativa; no entanto, o antígeno HIV-p24 250 nM exibiu um claro aumento na absorbância. Este resultado confirma a detecção específica do antígeno HIV-p24 na superfície de ELISA quimicamente modificada com maior sensibilidade.

Detecção específica do antígeno HIV-p24. Em vez de HIV-p24, o soro humano e a proteína HIV-TAT foram usados ​​para verificar a especificidade

Conclusões

Uma imobilização mais alta e adequada de uma proteína ou anticorpo na superfície do ELISA melhora dramaticamente o limite de detecção. Aqui, apresentamos um método de funcionalização química interessante para imobilizar a quantidade de proteína ou anticorpo que se liga na superfície do ELISA PS, auxiliado por APTES e GLU. Para demonstrar a detecção, usamos o antígeno p24 do HIV. O limite de detecção foi melhorado 30 vezes em comparação com o ELISA convencional. Desenvolvimentos adicionais da presente investigação poderiam levar a melhorias semelhantes com base em produtos químicos em outras superfícies de detecção e seriam úteis para detectar diferentes antígenos em uma abundância mais baixa, o que representaria um avanço nos diagnósticos médicos.

Abreviações

APTES:

3- (Aminopropil) trietoxissilano

BSA:

Albumina sérica bovina

COOH:

Carboxyl

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

Fc:

Fragmento cristalizável

GLU:

Glutaraldeído

HIV:

Vírus da imunodeficiência humana

HRP:

Peroxidase de rábano

IgG:

Imunoglobulina

OD:

Uma densidade óptica

PEG:

Polietileno glicol

PS:

Poliestireno

PVLA:

Polivinil benzil lactonoilamida

TMB:

3,3 ′, 5,5′-Tetrametilbenzidina

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