Potente nano-hidrogel imunoestimulador anti-tumoral feito de DNA

Resumo

Os oligodesoxinucleotídeos CpG não metilados são motivos imunoestimuladores potentes na ativação do sistema imunológico inato e adquirido por meio da indução de respostas de células T específicas do antígeno do tipo Th1, mas sua instabilidade no soro influencia muito sua eficiência imunoestimulante. Aqui, construímos um novo nano-hidrogéis de imuno-DNA consistindo em sequências repetidas em tandem de unidades CpG denominadas nano-hidrogéis CpG-MCA por meio de amplificação de cadeia com múltiplos primers. Demonstrou-se que os nano-hidrogéis CpG-MCA resistem à degradação e aumentam a proliferação e migração de células RAW264.7 semelhantes a macrófagos murinos. Além disso, os nano-hidrogéis CpG-MCA induziram eficazmente a alta expressão do fator de necrose tumoral-α e interleucina-6 e inibiram notavelmente a proliferação de células U251, sugerindo que se espera que os nano-hidrogéis CpG-MCA sejam empregados como o imunoestimulante anticâncer potente.

Introdução

O DNA bacteriano contendo motivos CpG não metilados são adjuvantes de vacinas, antialérgenos e agentes imunoprotetores e anticâncer extremamente promissores [1]; poderia ser reconhecido por receptores endossômicos dentro das células do sistema imunológico, como células dendríticas (DC), macrófagos, células T, células natural killer (NK) e células NKT [2]. Essas células imunes inatas são capazes de responder a motivos CpG não metilados por meio do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) para moléculas específicas de patógenos no microrganismo patogênico. Foi confirmado que o oligonucleotídeo CpG (CpG-ODN) poderia ser reconhecido pelo receptor Toll-like 9 (TLR9) [3] e induziu uma resposta imune do tipo Th1 através da via de sinalização dependente de Myd88 [4]. No entanto, essas desvantagens do CpG-ODN impediram sua aplicação clínica devido à sua prematuração por adsorção de proteínas, digestão por endonucleases no soro [5] e instabilidade in vivo. Espera-se que esses problemas sejam resolvidos encapsulando o ácido nucleico de fita simples (ss) em um transportador de entrega ou tornando-o automontado em uma nanoestrutura que melhora sua estabilidade in vivo, bem como uma razão de internalização mais eficiente para células imunes inatas. Atualmente, vários veículos, tais como polietileniminas de polímero catiônico (PEI) [6], lipossomas [7, 8] e micropartículas [9], foram utilizados para a entrega de CpG-ODN; ainda existem algumas desvantagens que precisam ser melhoradas, como sua citotoxicidade, taxa de carregamento limitada e etc.

Os materiais de DNA que são feitos de ácido nucléico apresentam grande potencial para serem usados como transportadores de entrega de CpG-ODN. Comparado com ssDNA, materiais de DNA com estrutura bidimensional ou tridimensional exibem propriedades diferentes, como fácil penetração das membranas celulares e estimulação de macrófagos para secretar citocinas [10]. O DNA em forma de X foi utilizado para entregar motivos CpG e aumentar com sucesso a atividade imunoestimuladora de CpG-ODN por aumento da captação celular, enquanto o aumento da captação celular é parcialmente devido à estrutura em forma de X [11]. Da mesma forma, um tetraédrico de DNA tridimensional que pode ser automontado em nanoestruturas com tamanhos uniformes foi inserido de forma não invasiva e eficiente nas células RAW264.7 para funcionar. Além disso, tal tetraédrico se mostrou mecanicamente estável e não citotóxico de acordo com a pesquisa [12]. Recentemente, o hidrogel CpG-RCA (gel CpG-RCA) com uma estrutura de nanoflores preparada por meio de amplificação por círculo rolante (RCA) demonstrou ser capaz de fornecer um sinal de estimulação imune, resistir à degradação da nuclease, aumentar a secreção de citocinas imunes e inibir a proliferação de células de linfócitos T de leucemia linfocítica aguda humana (CCRF-CEM) [13]. Os resultados acima sugeriram que a forma e a estrutura dos materiais de DNA desempenharam um papel importante no aumento da absorção celular e no aumento da eficiência da estimulação imunológica. Como as células CCRF-CEM são de leucemia de linfoblasto T humano, um tipo de malignidade hematológica, era diferente de um tumor maligno hematológico; tumores sólidos frequentemente circundam um microambiente imunossupressor que pode impedir a imunidade antitumoral válida [14]. Para isso, construímos um imunoestimulante de DNA contendo muito mais cópias de CpG-ODN por meio de amplificação de cadeia multi-primed (MCA) [15] em vez de RCA [16]. Tirando vantagem do princípio de emparelhamento de bases complementares, o iniciador envolvido em CpG e a sequência modelo especificamente projetada foram misturados à ligase e estendidos pela polimerase phi29 na presença de dNTPs livres. RCA (R) ou MCA (M) reagiu por x ou y horas a serem representadas separadamente como Rx ou My (Fig. 1); os produtos foram identificados por eletroforese em gel de agarose (Fig. 2a). Com base na reação MCA, os produtos obtidos foram denominados hidrogéis CpG-MCA (géis CpG-MCA) possuindo centenas ou milhares de CpGs em tandem devido ao grande aumento de cópias do motivo CpG. Os géis CpG-MCA também foram um imunoestimulante potente que aumentou significativamente a secreção de citocinas de células RAW264.7 e inibiu efetivamente a proliferação de linhas de células U251 de glioma humano. Esperávamos que este estudo conduzisse a um novo imunoestimulante nano-hidrogel baseado em materiais de DNA e promovesse sua aplicação para imunoterapia tumoral [17].

As imagens dos géis CpG-MCA e do gel CpG-RCA. a Imagem de eletroforese em gel de agarose do gel CpG-RCA (R12) e géis CpG-MCA (R4M4 e R4M8). Pista 1, digestão do marcador padrão DNA MW λ-Hind III; pista 2, R12; pista 3, R4M4; pista 4, R4M8, pista 5, marcador de DNA DL5000. Imagens SEM de R12 ( b ), R4M4 ( c ) e R4M8 ( d ) Imagens TEM de R12 ( e ), R4M4 ( f ) e R4M8 ( g ) A barra de escala preta é 3 μm; a barra de escala vermelha é 1 μm; barra de escala branca é 500 nm

As imagens do microscópio confocal e a intensidade fluorescente média em células RAW 264.7 tratadas com CpG-ODN, gel CpG-RCA (R12) e géis CpG-MCA (R4M4 e R4M8) (100 nM CpG equivalentes). Os géis CpG-MCA e o gel CpG-RCA foram marcados com Cy5 (vermelho) através da adição de Cy5-dCTP para sua absorção celular. CpG-ODN marcado com Cy5 foi usado como grupo de controle. a Imagens de microscopia confocal de gel CpG-RCA e géis CpG-MCA por células RAW 264,7 após incubação por 2 h. b A intensidade média de fluorescência de Cy5 em células RAW264.7. Os resultados são expressos como a média ± DP de três experiências independentes. **** P <0,0001

Métodos / Experimental

Materiais

Todos os oligonucleótidos foram adquiridos à Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. e purificados por cromatografia líquida de alta resolução. Conjuntos de dNTP (100 mM cada), phi29 DNA polimerase (10 U / μL) e tampão de reação de 10 × phi29 DNA polimerase (330 mM Tris-acetato (pH 7,9 a 37 ° C), 100 mM de acetato de Mg, 660 mM de acetato de K , 1% ( v / v ) Tween 20, DTT 10 mM) foram adquiridos na Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). T4 DNA ligase (400 U / μL), 5′-trifosadenina (ATP) e tampão de reação 10 × T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , ATP 1 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 ° C) foram adquiridos de New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA). A cianina 5-dCTP foi adquirida a PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, EUA). Os dispositivos de filtro centrífugo Amicon Ultra-0,5 foram adquiridos da Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). A água usada neste trabalho foi purificada pelo sistema de purificação de água Ultrapure UV da Millipore Synergy. Soro fetal bovino (FBS) Gibco, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, com alta glicose, L-glutamina, vermelho de fenol, piruvato de sódio, sem HEPES), Tripsina-EDTA (0,25%) e penicilina (10000 U / mL) - estreptomicina (10.000 μg / mL) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). Os kits de ELISA foram adquiridos da R&D Systems, Inc. O Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foi adquirido da Dojindo (Kumamoto, Japão). A linha de células semelhantes a macrófagos de camundongo (células RAW264.7) foi obtida do banco de células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As linhas de células de glioma humano (células U251) foram obtidas do banco de células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China).

Preparação de modelos circulares de DNA

DNA de fita simples longa com um grupo fosforilado na extremidade 5 'com uma proporção igual de iniciadores CpG-ODN (iniciador 1) foram misturados em tampão de reação 1 × phi29 e hibridizados a 95 ° C por 5 min e lentamente resfriados a 4 ° C em um taxa de - 1 ° C / s usando um termociclador (Bio-Rad T100, Alemanha). Após o anelamento, 20 U / μL de T4 DNA ligase com ATP e tampão de reação de T4 DNA ligase foram adicionados e incubados a 4 ° C durante a noite. As enzimas permaneceram inativas a 75 ° C por 10 min.

Preparação de Géis CpG-MCA e Gel CpG-RCA

Um modelo de DNA circular (10 μL) foi misturado com tampão de reação de polimerase de DNA 1 × phi29, dNTP 4 mM para cada um e 5 U de polimerase de DNA phi29 e DDW estéril foram adicionados, 50 μL no total. A mistura foi incubada a 30 ° C com agitação durante 12 h (R12). Para a formação do gel MCA, após 4 h de reação RCA, 500 pM do iniciador 2 e do iniciador 3 foram então adicionados à mistura resultante, respectivamente, para serem incubados durante as horas de descanso a 30 ° C sem adição de reagentes adicionais (R4M4 e R4M8). A polimerase phi29 foi inativada a 65 ° C durante 10 min. O gel CpG-RCA e os géis CpG-MCA foram purificados por ultrafiltração.

Concentração de Géis CpG-MCA e Gel CpG-RCA

A concentração de géis CpG-MCA e gel CpG-RCA foi medida com base no número de cópias CpG envolvidas em todos os hidrogéis no grupo de tratamento. Uma vez que o dNTP adicionado ao sistema de reação foi de 4 mM para cada um, um molde circular continha 81 nucleotídeos e 1 cópia de CpG. Se Abs é a absorbância de dNTP em 260 nm e ε é o coeficiente de extinção de dNTP a 260 nm, então o dNTP consumido na reação pode ser medido e o total de cópias de CpG calculado pela seguinte equação:CpG cópias =(4 mM × 4 - Abs / ε × 1.000.000) / 81 [13]. Abs e ε de dNTP foram medidos por NanoDrop 2000c.

Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose foi usada para avaliar a formação e degradação dos géis CpG-MCA e a formação de um molde circular. Os hidrogéis foram executados em gel de agarose a 1% a 100 V por 60 min, e o molde circular foi executado em gel de agarose a 3% a 100 V por 60 min.

Caracterização de Géis CpG-MCA e Gel CpG-RCA

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Hitachi HT7700, Japão) foi empregada para caracterizar a estrutura interna e o tamanho aproximado dos géis CpG-MCA. Os géis CpG-MCA foram examinados por ultrassom por 30 minutos antes de serem depositados em cobre e secos. Os testes foram realizados no laboratório central do Hospital Renji. Microscopia eletrônica de varredura (SEM, Hitachi SU8020, Japão) foi usada para obter a morfologia dos géis CpG-MCA. Os géis CpG-MCA foram examinados por ultrassom por 30 min antes de serem depositados em um wafer de silício limpo, e a amostra foi revestida de metal com Au.

Imagem microscópica confocal

A captação de células foi fotografada por um microscópio confocal Leica. Células RAW264.7 foram semeadas em uma placa de petri confocal a uma densidade de 2 × 10 ⁵ células / mL. Após lavagem duas vezes com tampão fosfato (PBS), as células foram incubadas com CpG-ODN marcado com Cy5 100 nM, gel CpG-RCA e géis CpG-MCA em meio DMEM fresco por 2 h a 37 °. As células foram então lavadas três vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% por 30 min, então as células foram coradas com FITC-faloidina e Hoechst 33342. Todas as imagens foram tiradas usando um microscópio confocal a laser Leica. O semiquantitativo da intensidade fluorescente média foi calculado por Image J, um aplicativo baseado em Java para análise de imagens.

Ensaio ELISA

Células RAW264.7 foram semeadas a uma densidade de 7 × 10 ⁴ células / mL em uma placa de 24 poços cultivadas por 24 horas antes do uso. As células foram incubadas na presença de géis CpG-MCA e outros grupos a 37 ° C durante 8 h para TNF-α e 24 h para IL-6; os sobrenadantes foram coletados. Os níveis de citocinas nos sobrenadantes foram detectados por ensaio imunoenzimático (ELISA) seguindo protocolos sugeridos pelo fabricante.

Ensaio de expressão gênica

Os níveis de expressão gênica foram avaliados por PCR quantitativo em tempo real (Q-PCR). Células RAW264.7 foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 ⁶ células / mL em uma placa de 6 poços cultivadas por 24 h antes do uso. As células foram incubadas na presença de géis CpG-MCA e outros grupos a 37 ° C por 2 h para TNF-α e TLR9 e 8 h para IL-6 e outros. O isolamento e a purificação do mRNA foram realizados usando TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific). O mRNA extraído foi quantificado por NanoDrop 2000c. Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente usando o kit de reagentes PrimeScript RT com gDNA Eraser (Takara Bio Inc.); a amplificação foi realizada em um volume total de reação de 20 μL, usando TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores para genes são os seguintes:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206 (MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.

Ensaio de migração de ferida simples

As células RAW264.7 foram semeadas 70 μL a uma densidade de 5 × 10 ⁵ células / mL em inserções de cultura por 24 h antes do uso. Em seguida, as inserções foram removidas com cuidado e as células foram lavadas duas vezes antes de serem tratadas com cada grupo em um meio fresco. As fotos foram coletadas em 0h, 6h e 24h; a área da ferida foi medida por ImageJ. Cada grupo teve três repetições e o experimento foi repetido três vezes.

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada usando CCK8. As células RAW264.7 foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com cada grupo por 24 h. Em seguida, 10 μL de solução de CCK8 foram adicionados a cada poço, seguido por 1–2 h de incubação a 37 ° C. A absorbância foi medida a 450 nm, cada grupo teve três repetições e o experimento foi repetido três vezes.

Células U251 co-cultivadas com células RAW264.7

As células RAW264.7 foram semeadas nas câmaras superiores e as células U251 foram semeadas nas câmaras inferiores separadamente e incubadas por 24 h antes do tratamento. Após a lavagem com PBS três vezes, 1 μM GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA gel e géis CpG-MCA no meio fresco foram adicionados em ambas as câmaras superior e inferior pelo tempo indicado. As células U251 nas câmaras inferiores foram coletadas e conduzidas a experiência de clonagem de placa.

Ensaio de formação de clones de placa

O efeito na proliferação de células U251 de co-cultivadas com células RAW264.7 foi analisado com experimentos de clonagem em placa. As células U251 nas câmaras inferiores foram coletadas e diluídas com múltiplas proporções em DMEM contendo 15% de FBS em um número final de 200 células / poço em uma placa de cultura de 6 poços e continuou a cultura por 2 semanas até que os agrupamentos de clones pudessem ser observados por a olho nu (mais de 50 células / clone). Depois de lavar suavemente com PBS, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min, em seguida, coradas com violeta de cristal por 1 h. Os agrupamentos contendo mais de 50 células seriam incluídos na contagem como uma formação de clone bem-sucedida. Os experimentos foram repetidos três vezes e cada experimento teve três poços repetidos:taxa de formação de clones =(número de formação de clones / número de células inoculadas) × 100%.

Estabilidade dos géis CpG-MCA e gel CpG-RCA

Gel CpG-MCA liofilizado ou gel CpG-RCA foi colocado em 400 μL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (10% de FBS-DMEM) respectivamente e incubado a 37 ° C por 24 h; as concentrações de DNA no sobrenadante foram medidas por NanoDrop 2000c após centrifugação a 1000 rpm por 10 s. Os demais hidrogéis foram calculados de acordo com as concentrações de DNA no sobrenadante. O gel restante =( m - c × V ) / m × 100%, onde m é a massa de gel que adicionamos, c é a concentração de DNA no sobrenadante, e V é o volume do sobrenadante. Géis CpG-MCA ou gel CpG-RCA foram colocados em 10% FBS-DMEM ou PBS respectivamente e incubados a 37 ° C por 12 h ou 24 h. Após a incubação, os géis foram corridos em gel de agarose a 1% a 100 V durante 60 min.

CpG-ODN

O CpG-ODN de fita simples foi sintetizado pela Sangon Company (Beijing, China) e purificado usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O CpG-ODN usado neste estudo foi CpG-ODN 1668 [18]:5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT, e os oligonucleotídeos não CpG foram nomeados GpC-ODN [18]:5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.

Análise estatística

Todos os dados neste estudo são representados como valores médios ± desvio padrão (média ± DP) de dois ou três experimentos independentes. A análise estatística entre os diferentes grupos foi realizada por meio de um t de Student teste. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05 (nível de confiança de 95%).

Resultados e discussão

O imunoestimulante de DNA foi construído com sucesso por meio da reação MCA [16]. Nesta reação, a primeira e importante etapa antes da amplificação isotérmica é a reação de ciclização de um molde de fita simples longa (ss) (Esquema 1). Empregamos eletroforese em gel de agarose para confirmar a formação de DNA circular após o anelamento e ligação com um primer (arquivo adicional 1:Figura S1). A distância de migração entre o primer e o modelo de ssDNA longo tornou-se mais curta, pois a estrutura mudou depois que o modelo tornou-se um ciclo e ligado ao primer. A reação MCA contém uma série de unidades repetidas em série e facilmente leva ao aparecimento de nanoflores devido ao enrolamento contínuo (Esquema 1). Os resultados da eletroforese em gel de agarose demonstraram que os produtos da reação RCA (gel CpG-RCA ou R12) e reação MCA (gel CpG-MCA ou R4M4 / R4M8) foram obtidos com sucesso (Fig. 1a). O gel CpG-RCA e os géis CpG-MCA foram difíceis de migrar através do gel de agarose e mantiveram a retenção na posição inicial. Ambos os géis eram muito pegajosos, por isso foram retirados como seda quando os pipetamos (Arquivo adicional 1:Figura S2A-C). Esses resultados sugeriram que o molde de DNA é amplificado exponencialmente com dNTPs livres para formar um hidrogel [15]. Vale ressaltar que a distância de migração não apresentou diferença significativa entre o gel CpG-RCA e o gel CpG-MCA. Além disso, os resultados de SEM e TEM mostraram ainda que o diâmetro do gel CpG-RCA (Fig. 1b, e) e géis CpG-MCA (Fig. 1c, d, f e g) variaram de nanoescala a escala micrométrica, e exibiu uma morfologia de nanoflores. O CpG-ODN precisa ser internalizado em células imunes positivas para TLR9 e interagir com TLR9 que está localizado nos endossomos dentro das células imunes para executar sua atividade imunoestimulante. Para isso, usamos CpG-ODN marcado com Cy5, gel CpG-RCA e géis CpG-MCA para pesquisar sua absorção nas células RAW264.7 usando microscopia confocal. Como observado na Fig. 2a, os géis CpG-MCA marcados com Cy5 foram eficazes internalizados e distribuídos no citoplasma de células RAW264.7. Com base na intensidade média de fluorescência medida, a eficiência de absorção dos géis CpG-MCA foi significativamente aumentada ( P <0,0001) em comparação com o de CpG-ODN (Fig. 2b), demonstrando a absorção eficaz de géis CpG-MCA, que é favorável para exercer uma estimulação imunológica mais forte. É relatado que a captação de DNA por células RAW264.7 de macrófago de camundongo foi aumentada com a concepção de diferentes nanoestruturas de DNA. Como o DNA estruturado semelhante ao tetrápode (tetrápode), o DNA tetraédrico (tetraedro) e o DNA tetragonal (tetrágono) [19]. Da mesma forma, o DNA em forma de X, o DNA em forma de Y e o hidrogel de X-DNA também mostraram aumentar a captação de DNA pelas células [20, 21]. Esses resultados sugeriram que as estruturas de ordem superior do DNA eram formas mais eficientes de entregar fragmentos de DNA funcionalizados. Portanto, especulamos que a alta absorção celular de géis CpG-MCA derivada da mudança de formato dos géis CpG-MCA por meio da formação de gel. Em seguida, testamos a estabilidade dos géis CpG-MCA. Os géis CpG-MCA foram incubados a 37 ° C por diferentes tempos em diferentes soluções. Os resultados da eletroforese em gel de agarose mostraram que os géis CpG-MCA eram relativamente estáveis em solução de PBS e foram parcialmente degradados no soro envolvido no meio (arquivo adicional 1:Figura S3A). Os géis CpG-MCA ainda se mostraram como uma escada em vez de uma única banda, o que sugeria uma degradação incompleta. Posteriormente, pesquisamos a estabilidade dos géis em 10% FBS-DMEM. Os resultados do TEM confirmaram que os géis CpG-MCA foram parcialmente digeridos e não se parecem mais com flores, mas ainda mantêm a forma (Arquivo adicional 1:Figura S2D-F). A curva de degradação dos géis CpG-MCA foi traçada detectando a concentração de DNA no sobrenadante em 24 h (Arquivo adicional 1:Figura S3B). Foi demonstrado que após uma incubação por 24 h em 10% FBS-DMEM, R12 reteve quase 80%, enquanto R4M4 e R4M8 permaneceram quase 85%, o que correspondeu aos resultados da eletroforese em gel de agarose. A fim de confirmar a degradação dos géis, os géis CpG-MCA foram incubados a 37 ° C até 48 h em soro, e a produção de degradação foi executada em eletroforese em gel de agarose (arquivo adicional 1:Figura S4). Os géis não parecem mais escadas, pois foram digeridos em pedaços pela enzima no soro e perderam sua viscosidade e se tornaram até mesmo pedaços de nucleotídeo único, sugerindo que os géis CpG-MCA são biodegradáveis, pois podem ser digeridos na presença de soro fetal bovino ( FBS). Consequentemente, os géis CpG-MCA resistem eficazmente à digestão do soro em 24 horas e, finalmente, degradam-se completamente. A alta capacidade de resistir à degradação ajudará a melhorar sua eficiência de estimulação imunológica; os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no sobrenadante de células RAW264.7 também mostraram claramente que os géis CpG-MCA poderiam estimular efetivamente as células a produzir citocinas imunes.

A ilustração esquemática sobre a preparação e absorção celular de géis CpG-MCA e gel CpG-RCA. O DNA de fita simples longa com um grupo fosforilado na extremidade 5 'foi misturado com iniciadores compostos por motivos CpG que foram primeiro emparelhados e ligados por T4 DNA ligase para formar um molde circular. A reação de RCA e MCA foi realizada por phi29 DNA polimerase para gerar uma grande quantidade de DNA concatemer sequencial e convolver como muitas nanoflores. Os géis podem então ser captados por macrófagos e estimular a secreção de citocinas

A eficácia imunoestimulante dos géis CpG-MCA foi avaliada posteriormente, tratamos macrófagos RAW264.7 com GpC-ODN (a sequência mudou de efeito GACGTT para GAGCTT) [22], CpG-ODN, CpG-RCA gel e CpG- O MCA gela e, em seguida, detecta a expansão de TNF-α e IL-6. A concentração de TNF-α no sobrenadante de células RAW264.7 incubadas por 8 h com gel CpG-RCA (R12) e géis CpG-MCA (R4M4 e R4M8) eliciou um nível muito mais alto de TNF-α do que CpG-ODN no mesma concentração de tratamento (Fig. 3a). Para os géis CpG-MCA, R4M8 em vez de R4M4 induziu nível mais alto de secreção de TNF-α ( P <0,001), sugerindo que a secreção de TNF-α aumentou à medida que as cópias aumentaram. Além disso, R4M8 induziu uma significativa ( P <0,001) maior concentração de TNF-α do que R12, indicando que os géis CpG-MCA são estimuladores mais poderosos do que os géis CpG-RCA quando o tempo total de reação é igual. A mesma tendência também foi encontrada na detecção de IL-6 (fig. 3d). A secreção de IL-6 estimulada por géis CpG-MCA e gel CpG-RCA foi significativamente aumentada. A secreção de IL-6 nos grupos R12, R4M4 e R4M8 foi 2,97 vezes ( P <0,0001), 4,39 vezes ( P <0,0001) e 27,81 vezes ( P <0,0001) daquele no grupo CpG-ODN, respectivamente. A secreção de IL-6 no grupo R4M8 foi de 6,33 vezes ( P <0,0001) daquele observado no grupo R4M4 e 9,36 vezes ( P <0,001) do observado no grupo R12. Vale a pena mencionar que a secreção de IL-6 não apresentou diferença significativa entre os grupos CpG-ODN, GpC-ODN e controle. Estes resultados confirmaram que uma maior eficiência de TNF-α e IL-6 liberados foi observada a partir de células RAW264.7 tratadas com géis CpG-MCA em vez de CpG-ODN. Além disso, o efeito dos géis CpG-MCA com uma concentração diferente na secreção de citocinas também foi investigado, e descobrimos que a secreção de TNF-α e IL-6 aumentava com a concentração de géis (Fig. 3b, e). O resultado da capacidade imunoestimulante dos géis não-CpG (indicados como R12-C, R4M4-C e R4M8-C na Fig. 3c) e GpC-ODN demonstrou que eles mal induziram a secreção de TNF-α (Fig. 3c), indicando que as respostas imunes induzidas por géis CpG-MCA resultam dos motivos CpG.

Detecção de citocinas liberadas de células RAW264.7 estimuladas com CpG-ODN, gel CpG-RCA e géis CpG-MCA usando kit ELISA. a A secreção de TNF-α a partir de células RAW264.7. b A secreção de TNF-α por células RAW264.7 após tratamento com diferentes concentrações de géis CpG-MCA. c Detecção da capacidade imunoestimulante de géis CpG e géis não CpG (R12-C, R4M4-C e R4M8-C). d A secreção de IL-6 pelas células RAW264.7. e A secreção de IL-6 pelas células RAW264.7 após tratamento com diferentes concentrações de géis de MCA. Os resultados são expressos como a média ± DP de duas experiências independentes. ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001

Em seguida, testamos a expressão de mRNA de citocinas, marcadores de superfície celular e TLR-9. O mRNA de TNF-α no grupo CpG-ODN foi de 1,25 vezes conforme a expressão detectada no grupo de controle, e a alteração nos grupos R12, R4M4 e R4M8 foi de 3,28 vezes ( P <0,01), 2,53 vezes ( P <0,05) e 4,57 vezes ( P <0,001) daquele testado no grupo CpG-ODN separadamente (Arquivo adicional 1:Figura S5A). A expressão de mRNA de IL-6 no grupo CpG-ODN foi 1,01 vezes maior do que no grupo de controle. A expressão de mRNA de IL-6 nos grupos R12, R4M4 e R4M8 foi 3,87 vezes ( P <0,01), 4,63 vezes ( P <0,05) e 23,04 vezes ( P <0,0001) tanto quanto no grupo CpG-ODN respectivamente (Arquivo adicional 1:Figura S5B).

A expressão de mRNA de TLR-9, o receptor de CpG dentro das células [4], também aumentou em todos os grupos em comparação com o grupo de controle, mas os grupos de gel CpG-MCA aumentaram notavelmente a expressão de mRNA de TLR-9 em comparação com o CpG Grupo -ODN (Arquivo adicional 1:Figura S5C). Além de citocinas e TLR9, também detectamos moléculas coestimulatórias (CD) CD86 e CD206, que foram usadas para marcar macrófagos pró-inflamatórios (M1) e promotores de crescimento (M2), respectivamente [23]. Verificou-se que não havia diferença significativa entre o grupo CpG-ODN e o grupo de controle em CD86 ou CD206 (Arquivo adicional 1:Figura S5D, E). Em comparação com o grupo de gel CpG-RCA, o CD86 nos grupos de gel CpG-MCA aumentou em vários graus, enquanto o CD206 diminuiu em vários graus, e o grupo R4M8 aumentou e diminuiu mais, sugerindo que as células RAW264.7 tratadas com géis CpG-MCA são propensos a se diferenciar na população M1 com o marcador de superfície CD86, o que verificou ainda mais a capacidade de estimulação imunológica dos géis CpG-MCA.

A secreção de citocinas pelos macrófagos é extremamente importante na resposta à estimulação imune, bem como na proliferação e migração de macrófagos. A estimulação de macrófagos com CpG-ODN aumentaria a produção de citocinas antiinflamatórias por meio da via dependente de TLR9. As citocinas induzidas por CpG-ODN aumentaram a migração de macrófagos e promoveram a proliferação de macrófagos pela regulação negativa da expressão de um regulador negativo do ciclo celular [24]. O CpG-ODN também induziu a expressão do inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1) em macrófagos, o que resultou em uma migração aumentada através da vitronectina [25]. Também investigamos a capacidade dos géis CpG-MCA de promover a migração de macrófagos e avaliar sua citotoxicidade. A migração de células RAW264.7 foi induzida por géis CpG-MCA em ambos os sistemas de migração transwell (Fig. 4a) e ensaio de migração de feridas por arranhões (Fig. 4b). As células RAW264.7 foram cultivadas na presença ou ausência de géis CpG-MCA e permitiram que migrassem por 24 h. O número de migração de macrófagos nos grupos de gel CpG-MCA foi muito maior do que no grupo CpG-ODN (Fig. 4a). Em seguida, procedemos ao ensaio de migração da ferida por raspagem; as células puderam migrar por 24 horas, e as fotos foram capturadas em 0 horas, 6 horas e 24 horas. Os resultados demonstraram que a área arranhada diminuiu à medida que a ferida cicatrizou. A migração de macrófagos em 6 h mostrou que os géis CpG-MCA foram mais eficazes do que o grupo CpG-ODN, pois a taxa de cicatrização de feridas foi maior, mas não há significância distinta entre os grupos R12, R4M4 e R4M8 (arquivo adicional 1:Figura S6A, B). E a área de arranhão em 24 h confirmou que a taxa de cura da área de arranhão no grupo CpG-ODN foi de 1,70 vezes ( P <0,05) do que no grupo de controle, e a taxa de cura nos grupos R12, R4M4 e R4M8 foi 1,63 vezes ( P <0,001), 1,63 vezes ( P <0,0001) e 2,23 vezes ( P <0,0001) daquele medido no grupo CpG-ODN separadamente. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. a The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. ** P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P < 0.01), 15.3% (P < 0.001), and 12.0% (P < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. ** P < 0.01, ***P <0,001

Conclusões

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados e / ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

CpG-MCA gels:: CpG-MCA hydrogel
CpG-RCA gel:: CpG-RCA hydrogel
MCA/M:: Multi-primed chain amplification
R12:: CpG-RCA gel
R12-C, R4M4-C, R4M8-C:: Hydrogels not containing CpG motifs
R4M4, R4M8:: CpG-MCA gels
RCA/R:: Rolling circle amplification

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