Nanohidrogel Baseado em DNA com Potente Atividade Imunoestimuladora Antitumor

Resumo

Oligodesoxinucleotídeos CpG não metilados (CpG-ODN) são ativadores poderosos de imunidade inata e adaptativa, mas sua degradação rápida em soro limita utilidade clínica. Engenhamos nanohidrogéis CpG-MCA por amplificação em cadeia multi-primada (MCA), gerando hidrogéis ricos em repetições CpG em tandem. Os géis CpG-MCA resultantes resistem a degradação nucleásica, são prontamente internalizados por macrófagos RAW264.7, e desencadeiam secreção robusta de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6). Em co-cultura com células glioma humano U251, géis CpG-MCA suprimiram marcadamente proliferação celular tumoral, superando géis CpG-ODN e CpG-RCA convencionais. Estes achados demonstram que nanohidrogéis CpG-MCA são imunoestimulante potente, biocompatível com forte atividade antitumoral.

Introdução

DNA bacteriano contendo motivos CpG não metilados serve como adjuvante eficaz e agente anticancerígeno ao engajar receptor Toll-like 9 (TLR9) em células dendríticas, macrófagos e outras células imunes. No entanto, CpG-ODN é propenso a adsorção proteica e digestão nucleásica, comprometendo sua estabilidade e potência in vivo. Encapsulamento em veículos entrega ou auto-organização em nanoestruturas DNA de ordem superior melhorou estabilidade e captação celular, mas desafios como citotoxicidade e carga limitada permanecem.

Nanomateriais DNA — tetraedros, redes X-formadas e redes hidrogel — mostraram internalização celular aprimorada e indução citocina comparado oligonucleotídeos lineares. Amplificação círculo rolante (RCA) produz géis nanoflor que protegem motivos CpG e amplificam sinalização imune. Baseando-se neste conceito, empregamos amplificação em cadeia multi-primada (MCA) para produzir hidrogéis CpG-MCA, contendo milhares de repetições CpG e formando estruturas nanoflor. Hipotetizamos que estes hidrogéis fornecerão estabilidade, captação e imunoestimulação superiores, inibindo crescimento tumores sólidos.

Materiais e Métodos

Materiais

Todos oligonucleotídeos sintetizados (Sangon Biotech, Xangai) e purificados por HPLC. Reagentes para MCA e RCA, incluindo polimerase DNA phi29, ligase T4 DNA, dNTPs e tampões, obtidos Thermo Fisher e New England Biolabs. Linhagens celulares RAW264.7 (macrófago camundongo) e U251 (glioma humano) obtidas Academia Chinesa Ciências. Kits ELISA (R&D Systems) e CCK-8 (Dojindo) usados quantificação citocina e ensaios viabilidade.

Preparação Templates DNA Circular

DNA fita simples (SS-DNA) fosforilado contendo primers CpG aquecido 95 °C 5 min e resfriado 4 °C. Ligase adicionada overnight 4 °C formar templates circulares; enzimas inativadas 75 °C 10 min.

Construção Hidrogéis CpG-MCA e CpG-RCA

Aliquota 10 µL template circular misturada com 1× tampão phi29, 4 mM dNTPs e 5 U polimerase phi29 volume 50 µL. Incubação 30 °C 12 h produziu gel RCA (R12). Para MCA, após 4 h RCA, 500 pM primers 2 e 3 adicionados e mistura incubada tempo restante (R4M4 e R4M8). Polímeros inativados calor 65 °C e purificados ultrafiltração.

Caracterização

Eletroforese gel agarose confirmou formação hidrogel. MET e MEV revelaram morfologias nanoflor variando 100 nm a vários micrômetros. Citotoxicidade avaliada CCK-8; captação visualizada marcação Cy5 e microscopia confocal; secreção citocina medida ELISA; expressão gênica quantificada qRT-PCR.

Ensaio Estabilidade

Hidrogéis incubados 10% FBS-DMEM ou PBS 37 °C; DNA residual quantificado NanoDrop, padrões degradação monitorados eletroforese gel agarose.

Co-cultura com Células U251

Células RAW264.7 semeadas câmara superior Transwell; células U251 colocadas câmara inferior. Após 24 h tratamento com géis CpG-ODN, CpG-RCA ou CpG-MCA, proliferação U251 avaliada ensaio clonogênico.

Resultados e Discussão

Formação templates circulares e amplificação bem-sucedida confirmada gel agarose: produto MCA (R4M4/R4M8) e produto RCA (R12) exibiram retenção alto peso molecular e aparência nanoflor em MET/MEV.

Imageamento confocal demonstrou géis CpG-MCA internalizados eficientemente células RAW264.7, com intensidade fluorescência média >10× CpG-ODN linear (p < 0,0001), indicando captação superior devido arquitetura nanoflor.

Estudos estabilidade mostraram géis CpG-MCA retiveram ~85% conteúdo DNA após 24 h em 10% FBS-DMEM, enquanto CpG-ODN linear degradou >90% dentro 12 h, ressaltando efeito protetor matriz hidrogel.

Ensaios imunoestimulação in vitro revelaram géis CpG-MCA induziram secreção TNF-α e IL-6 em níveis 3-27× maiores CpG-ODN (p < 0,0001). Notavelmente, R4M8 produziu resposta citocina mais forte, correlacionando com seu maior número cópias CpG.

Análise expressão gênica mostrou up-regulação significativa transcritos TLR9, TNF-α e IL-6 em células tratadas CpG-MCA, junto com aumento CD86 e diminuição CD206 marcadores superfície, indicando mudança fenótipo pró-inflamatório M1.

Ensaios migração (Transwell e scratch wound) revelaram géis CpG-MCA estimularam migração RAW264.7 mais CpG-ODN, aumentando potencial infiltração células imunes tumores.

Co-cultura com células glioma U251 demonstrou redução pronunciada formação clones: R4M8 alcançou taxa formação clones 12% relativo controle CpG-ODN (p < 0,001), confirmando atividade antitumoral potente mediada liberação citocina induzida CpG-MCA.

Conclusões

Engenhamos com sucesso nanohidrogéis CpG-MCA incorporando milhares de motivos CpG, conferindo resistência nucleases, captação eficiente macrófagos e indução robusta citocinas tipo Th1. Estes hidrogéis suprimem efetivamente proliferação células glioma in vitro, destacando promessa como imunoestimulante biocompatível para terapia câncer.

Disponibilidade Dados e Materiais

Conjuntos dados suportando este estudo disponíveis autor correspondente mediante solicitação razoável.

Abreviações

Géis CpG-MCA

Hidrogel DNA gerado por amplificação cadeia multi-primada

Gel CpG-RCA

Hidrogel DNA gerado por amplificação círculo rolante

MCA

Amplificação cadeia multi-primada

R12

Gel CpG derivado RCA

R4M4, R4M8

Hidrogéis CpG-MCA com 4 ou 8 extensões primer

R12-C, R4M4-C, R4M8-C

Hidrogéis sem motivos CpG