Estudo Quantitativo da Internalização de Nanopartículas de PLGA em Células de Câncer Laríngeo e Imunes para Melhorar a Entrega de Fármacos

Resumo

A tradução clínica de nanomedicinas baseadas em poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) é limitada, partly devido à baixa eficiência de entrega resultante da fagocitose não específica por fagócitos. A compreensão da interação entre nanopartículas, células cancerígenas e imunes permanece amplamente elusiva. Neste estudo, uma investigação quantitativa sobre a internalização celular de partículas fluorescentes de PLGA (100 nm, 500 nm e 1 µm) contra células de carcinoma laríngeo com ou sem monócitos/macrófagos em sistemas de monocultura ou cocultura foi realizada pela primeira vez. Partículas de PLGA em concentrações de 5–20 µg/mL mostram biocompatibilidade superior, exceto para partículas de PLGA de 500 nm e 1 µm a 20 µg/mL que reduzem ligeiramente a viabilidade celular. Observação microscópica revelou que todos os três tamanhos de partículas são efetivamente ingeridos por ambas as células cancerígenas e macrófagos; no entanto, exame quantitativo de fluorescência revelou que o índice de captação de células cancerígenas (fluorescência intracelular média de partícula por célula cancerígena normalizada à de macrófago) declina substancialmente para todas as partículas de PLGA em coculturas comparado a monoculturas (1,35–1,05, 1,50–0,59 e 1,4–0,47 para partículas de 100 nm, 500 nm e 1 µm, respectivamente). Análise quantitativa usando citometria de fluxo confirmou ainda mais o índice de captação reduzido de células cancerígenas em coculturas, mas contagens de partículas mais altas por macrófago. Também foi descoberto que a formação de células gigantes multinucleadas via fusão de macrófagos aumentou após tratamento com PLGA, o que poderia ser explorado como uma abordagem potencial para entrega de fármacos tumorais. Em geral, estes achados fornecem novos insights sobre a interação nanopartícula-imune-células cancerígenas, o que pode facilitar a aplicação de nanocarreadores baseados em PLGA para o tratamento de carcinoma laríngeo.

Introdução

O câncer é uma das principais causas de mortalidade mundial, com cerca de 10 milhões de novos casos de morte relatados em 2018. O carcinoma laríngeo (células cancerígenas originadas na laringe) é a segunda malignidade mais comum dos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), respondendo por cerca de 180.000 novos casos e 95.000 mortes em 2018. Atualmente, fármacos direcionados são desenvolvidos como tratamento opcional para desafios introduzidos por terapias tradicionais como cirurgia, radioterapia e quimioterapia.

Nanocarreadores têm sido amplamente utilizados para carregar fármacos anticancerígenos como cisplatina, paclitaxel e docetaxel para melhorar sua solubilidade em água, biodisponibilidade e estabilidade para entrega e eficácia aprimoradas. Em geral, a entrega de fármacos baseada em nanopartículas (NP) permite a entrega de uma ampla gama de outras substâncias (por exemplo, proteínas, anticorpos, vacinas e ácidos nucleicos) a regiões específicas do corpo em modelos animais e pacientes. No entanto, o chamado efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR) resultou em eficiência de direcionamento consideravelmente variável entre diferentes tipos de câncer. Evidências recentes sugerem que a deposição de nanocarreadores de fármacos (aqui NPs de ouro) em tumores depende preferencialmente do processo de transcitose, um tipo de transporte transcelular biológico, no qual substâncias/NPs são transferidas através das células de um lado para outro, incluindo os cursos de endocitose, transferência vesicular e exocitose. Deve-se notar que os resultados contraditórios sobre os mecanismos de entrega direcionada de fármacos enfatizam a importância crítica de compreender a base da interação celular com nanofármacos ou NPs utilizando múltiplas estratégias experimentais, variando de cultura celular in vitro a cultura de tecido ex vivo e estudo animal in vivo.

Numerosos nanocarreadores como lipossomos, NPs de albumina, NPs de sílica e poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) têm sido clinicamente empregados para tratar diferentes tipos de câncer, incluindo carcinoma laríngeo. Nanopartículas baseadas em polímeros como micelas e PLGA têm grande potencial em aplicações biomédicas devido às suas formulações versáteis de nanofármacos através de mistura simples ou conjugação covalente, excelente capacidade de auto-organização, alta capacidade de carregamento de fármacos e biocompatibilidade. Por exemplo, nanocarreadores de PLGA revestidos com polietilenoglicol (PEG) carregados com doxorrubicina e verde de indocianina permitem quimioterapia-fototérmica sinérgica para câncer de mama. Além disso, estudos in vitro e in vivo mostraram que micelas carregadas com cisplatina exibem excelente atividade anticancerígena contra tumores ortotópicos de HNSCC (por exemplo, SAS-L1 e HSC-2). Embora vários nanocarreadores de nanofármacos poliméricos como PLGA e micelas tenham sido aprovados para uso clínico ou estejam sendo avaliados em ensaios clínicos, muitos mais nanofármacos poliméricos estão sob investigação pré-clínica com diferentes linhagens de células de câncer de cabeça e pescoço e modelos de tumores xenóicos de animais.

A evidência científica destacou a significância das respostas imunológicas do hospedeiro a nanocarreadores de fármacos, pois uma vez que esses NPs entram no corpo, eles se tornam inevitavelmente reconhecidos pelo sistema imunológico. Macrófagos são considerados a primeira linha de defesa celular do hospedeiro, especializando-se na neutralização e eliminação de alérgenos, microorganismos e partículas estranhas (por exemplo, nanocarreadores) via fagocitose e consequente preparação de respostas imunes. A maioria dos nanocarreadores recém-projetados falhou na entrega direcionada a regiões doentes específicas ou tumores in vivo devido ao acúmulo eficiente de NPs no sistema fagocítico mononuclear (SFM), como células de Kupffer no fígado e macrófagos da polpa vermelha no baço. Portanto, compreender os mecanismos de captação celular de NPs por células imunes como monócitos e macrófagos é crucial, pois determina o tempo de vida de nanocarreadores em tecidos e fluidos biológicos relevantes. Sistemas emergentes de cocultura celular in vitro têm, portanto, atraído crescente atenção nos campos de nanomedicina e toxicologia devido à demanda crescente por resultados mais significativos que possam refletir melhor a condição in vivo. De fato, sistemas de cocultura têm se mostrado capazes de exibir uma situação realista na imitação de estados de tecido saudáveis e doentes e têm sido utilizados confiavelmente em estudos de captação celular de NPs e absorção de fármacos. A utilização de modelos de cocultura de células cancerígenas e imunes geralmente oferece uma plataforma adequada para investigar as rotas e mecanismos de captação destes nanomateriais nas células, o que pode facilitar o design de nanocarreadores melhor direcionados a células cancerígenas enquanto simultaneamente reduzem a fagocitose de NPs. Portanto, é de importância essencial determinar a eficiência e o destino de NPs em células cancerígenas na presença de células imunes. A maioria dos nanocarreadores foi projetada para ter diâmetros de 50–200 nm para aproveitar o efeito EPR e prolongar a circulação sanguínea, enquanto NPs maiores (> 500 nm) são relatados como eficientemente eliminados pelo SFM. PLGA, um nanocarreador aprovado pela FDA, em diferentes tamanhos (100, 500 e 1000 nm) foi assim selecionado para investigar as capacidades de captação de UM-SCC-17A (uma linhagem clássica de carcinoma de células escamosas laríngeas) e THP-1 (uma linhagem de células monocíticas humanas agudas). Vários estudos in vitro aplicaram nanocarreadores de PLGA para entregar fármacos para matar células de câncer HNSCC em monoculturas; este é o primeiro estudo a investigar a eficiência e mecanismo de captação de NPs por células imunes e cancerígenas laríngeas simultaneamente em um modelo de cocultura empregando diferentes tamanhos de PLGA, o que pode fornecer uma base fundamental para o desenvolvimento de nanomedicinas seguras por design para terapia de HNSCC.

Materiais e Métodos

Materiais

Três partículas de PLGA comercializadas (Sigma-Aldrich) com diferentes tamanhos incluindo 100 nm, 500 nm e 1000 nm foram usadas neste estudo. Todas as partículas foram carregadas com fluoróforos verdes com comprimentos de onda de excitação e emissão óptica (ex/em) de 460 nm e 500 nm. Todas as partículas foram recebidas na forma de pó e foram suspensas em água destilada com concentração final de 10 mg/mL para uso posterior. Diâmetros hidrodinâmicos e potenciais zeta de três partículas foram realizados por espalhamento dinâmico de luz (DLS) conduzido com um instrumento Malvern Zeta Sizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). As suspensões de estoque de cada partícula foram diluídas 1:100 em 80 µl de água destilada para medição DLS. Seguindo a indicação do fabricante, 3 medições repetidas para cada partícula foram obtidas.

Culturas Celulares de UM-SCC-17A e THP-1 e Exposição a Partículas

A linhagem de carcinoma laríngeo humano UM-SCC-17A e a linhagem de células monocíticas/macrófagos humana THP-1 compradas da Sigma-Aldrich, EUA e Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, China), respectivamente, foram usadas para construir o modelo in vitro neste estudo. Células UM-SCC-17A e THP-1 foram cultivadas em meio de cultura celular DMEM ou RPMI-1640 suplementado com 10% SFB (Gibco, Alemanha) e 1% solução de Penicilina-Estreptomicina (Gibco, Alemanha) a 37 °C com 5% CO₂. Células THP-1 foram expostas a soluções de 100 nM Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma, EUA) por 72 h antes do semeio celular para diferenciar em macrófagos. Ambas as células foram passadas usando 0,5% tripsina-EDTA a cada 3 dias, e a morfologia celular foi verificada diariamente para garantir a saúde das células.

Células foram semeadas em placas de 24 poços na densidade de 0,1 × 10⁶ células/poço para células monocultivadas para ensaio WST-1 e LDH, ou em lamínulas estéreis em placas de 24 poços para microscopia de fluorescência. Para o modelo de cocultura, células UM-SCC-17A foram primeiro semeadas em placas de 24 poços na densidade de 50.000/poço durante a noite e então adicionadas com 50.000/poço de células THP-1. Partículas foram suspensas em 500 µl de meio de cultura celular respectivo para células UM-SCC-17A e THP-1 monocultivadas ou meio de cultura celular misto 1:1 para células cocultivadas e expostas a amostras celulares por 24 h com concentrações finais de 5, 10 e 20 µg/mL para ensaio WST-1 e LDH ou 10 µg/mL para microscopia de fluorescência.

Para medição FACS, células foram semeadas em placas de 12 poços da mesma maneira descrita antes na densidade de 250.000 células/poço, ou 125.000 células/poço cada para o modelo de cocultura. Células foram cultivadas em 1 mL de meio de cultura celular durante a noite e expostas a partículas de PLGA na concentração final de 10 µg/mL por 24 h.

Ensaio de Viabilidade Celular

A viabilidade celular foi determinada pelo kit de reagente de proliferação celular WST-1 (Roche, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, a solução WST-1 foi diluída 1:10 em meio de cultura celular respectivo para monocultura UM-SCC-17A ou THP-1, ou meio de cultura celular misto 1:1 para células cocultivadas. O sobrenadante foi drenado após a exposição, e as células foram incubadas com 500 µl de solução de trabalho do ensaio WST-1 a 37 °C por 30 min. Amostras foram coletadas e centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min para remover as partículas. A absorbância (valor OD) das soluções foi medida sob comprimento de onda de 450 nm usando Infinite®F200 (Tecan, EUA). Os valores de absorbância foram corrigidos subtraindo o valor de uma amostra em branco contendo apenas a solução de trabalho WST-1, e as viabilidades celulares relativas foram comparadas com a amostra controle não tratada.

Ensaio de Vazamento de Membrana Celular

A liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi medida usando um kit comercial de detecção de citotoxicidade (LDH) (Roche, Alemanha) para determinar a citotoxicidade por partículas de PLGA. O sobrenadante das células foi coletado 24 h após a exposição, centrifugado a 14.000 rpm por 10 min, e diluído 1:10 em 200 µl de meio de cultura celular completo. O controle positivo foi definido como a liberação total de LDH por incubação das células com 0,2% Triton X-100 a 37 °C por 15 min, e diluído 1:50 em 200 µl de meio de cultura celular completo. Amostras foram incubadas com 100 soluções de trabalho do ensaio LDH por 30 min à temperatura ambiente, e a reação foi parada usando 50 µl de HCl 1%. A absorbância no comprimento de onda de 492 nm foi medida usando Infinite®F200 (Tecan, EUA), e concentrações relativas de LDH foram calculadas de acordo com a equação a seguir.

Microscopia de Fluorescência

Células foram visualizadas por coloração Hoechst para localização das partículas sob microscópio de fluorescência. Células foram lavadas com PBS 3 vezes após 24 h de exposição das partículas e incubadas com 4% formaldeído por 10 min à temperatura ambiente. Após fixação com formaldeído, as células foram então incubadas com 200 µl de solução de coloração contendo Hoechst diluído 1:1000 e 1% BSA em PBS por 30 min. Então, as lamínulas foram movidas para uma lâmina de vidro virada para baixo e mantidas com uma gota de agente antifade de fluorescência DAKO para visualização. Quatro canais ópticos foram definidos com um microscópio de fluorescência, incluindo campo claro para morfologia celular, DAPI para núcleos celulares, e GFP para partículas. Tempos de exposição do canal de partícula para cada imagem fluorescente foram registrados e usados para homogeneização da intensidade de fluorescência entre diferentes partículas, e partículas intracelulares foram calculadas por intensidade de fluorescência usando áreas selecionadas aleatoriamente pelo ImageJ. O índice de captação entre diferentes partículas foi comparado entre células UM-SCC-17A monocultivadas ou cocultivadas. Brevemente, a intensidade média de fluorescência (MFI) de partículas internalizadas foi calculada em, por exemplo, 50 células para cada tipo celular, que foi determinada como o valor de subtração entre a intensidade total de fluorescência (Itotal) de uma área específica e a autofluorescência (Iauto) da área do mesmo tamanho na região livre de partícula. O índice de captação de células cancerígenas foi determinado pela MFI de UM-SCC-17A normalizada à de células THP-1 em modelo monocultivado ou cocultivado.

Citometria de Fluorescência Ativada (FACS)

A citometria de fluorescência ativada (FACS) foi realizada para medir a capacidade de captação de três partículas. Células foram lavadas com PBS três vezes para remover o meio celular e partículas dissociadas 24 h após a exposição e incubadas com 200 µl de 0,5% tripsina-EDTA (Gibco, Alemanha) a 37 °C por 4 min para remover as células da placa. Então, a reação foi parada adicionando 2 ml de meio de cultura celular completo, e a suspensão celular foi movida para um tubo de vidro para medição FACS e centrifugada por 5 min a 300 × G, 4 °C. O sobrenadante foi descarregado suavemente, e as células foram suspensas em 200 µl PBS e preservadas em gelo. Células vivas foram primeiro separadas de detritos e células mortas usando dispersão frontal (FSC-A) - lateral (SSC-A). Então, as células cocultivadas foram analisadas usando canal APC versus FSC-A para separar células UM-SCC-17A de macrófagos baseados no tamanho das células. Um total de 30.000 células foram analisadas para cada amostra, e a intensidade média de fluorescência para cada célula foi calculada e normalizada entre diferentes partículas. Enquanto isso, após 24 h de incubação de partículas com células, o sobrenadante da cultura celular, tampão de lavagem (três vezes lavagem para remover partículas residuais aderidas à superfície celular), e células (digestão tripsinizada) foram coletados para medir a intensidade fluorescente usando um leitor de microplacas (Infinite®F200, Tecan). Por esta abordagem, a porcentagem de partículas ingeridas por células pode ser determinada para cada grupo.

Quantificação de Fusão Celular

Fusão de macrófagos em células gigantes multinucleadas (CGM) foi definida como uma célula gigante morfologicamente contendo dois ou mais núcleos dentro de um citoplasma normal, que pode ser claramente e sincronicamente identificada em imagens de campo claro e imagens fluorescentes após coloração. A porcentagem de fusão celular foi calculada pelo número de núcleos de CGM (contagem manual) normalizado às contagens totais de células, que foi determinada com abordagem automatizada no ImageJ.

Análise Estatística

Software GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) foi usado para análise estatística e visualização de resultados. Seguindo ANOVA unidirecional, o método Holm-Sidak ou teste t foi realizado para comparar resultados de múltiplos grupos ou dois grupos, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados com triplicatas independentes, e os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). Resultados com valor p < 0,05 (*) e p < 0,01 (**) foram considerados significativos.

Resultados e Discussão

Caracterização de Partículas de Poli(ácido lático-co-glicólico)

Micrografias de fluorescência de partículas de PLGA (Fig. 1a,b,c) exibiram intensidade fluorescente robusta e nenhuma diminuição significativa nos sinais de fluorescência ao longo de 14 d após preparação, sugerindo distribuição de tamanho relativamente homogênea e alta estabilidade de fluorescência. Conforme indicado pelo fornecedor, partículas de PLGA de 100, 500 e 1000 nm mostraram tamanhos de cerca de 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm e 951,9 ± 237,5 nm (Fig. 1d,e,f), respectivamente. De acordo com medições de potencial zeta, as cargas superficiais médias nas partículas foram encontradas como -20,6 ± 5,3, -17 ± 4,6 e -16,5 ± 3,5 com índice de polidispersão de 0,057, 0,056 e 0,062 para partículas de 100, 500 e 1000 nm, respectivamente, o que indicou seus padrões altamente monodispersos. Todas as partículas foram vortexadas e então sonicadas em banho de água por 5 min para eliminar amplamente a agregação de partículas. No entanto, pequenos picos correspondentes a partículas de 100 e 1000 nm foram observados com diâmetros de cerca de 4–6 µm devido à agregação inevitável de partículas em quantidades muito pequenas (cerca de 3–4%).

Avaliação de Viabilidade Celular e Citotoxicidade

Devido à sua excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade, partículas de PLGA foram aprovadas pela FDA e Agência Europeia de Medicamentos para aplicações biomédicas. Partículas de PLGA têm sido assim atualmente usadas na clínica e amplamente aplicadas em estudos pré-clínicos como nanocarreadores entregando fármacos a regiões doentes específicas ou tumores. No entanto, a eficiência de direcionamento e eficácia terapêutica de partículas de PLGA são dificultadas, pelo menos parcialmente, pelo sistema imunológico. Por exemplo, a alta fagocitose de partículas por células de Kupffer no fígado restringiu grandemente os nanocarreadores de fármacos de entrar no sítio tumoral. Portanto, é de vital importância estabelecer modelos in vitro avançados para estudar a interação entre células cancerígenas, células imunes e partículas para melhor imitar a situação in vivo de entrega de fármacos. UM-SCC-17A é uma linhagem única de carcinoma de células escamosas laríngeas isolada de espécime de câncer de laringe primário. No entanto, informações sobre sua eficiência de captação celular in vitro em sistemas de cocultura (por exemplo, co-incubação de macrófagos e células cancerígenas) ainda são insuficientes, uma questão que precisa ser abordada para melhorar a capacidade de previsão de respostas in vivo. Além disso, foi comprovado que o tamanho da partícula e revestimento superficial desempenham papel importante na capacidade de entrega a tumores sólidos, sítios doentes e células cancerígenas em modelos animais e culturas celulares. Aqui, aplicamos assim três tamanhos de PLGA a células de carcinoma UM-SCC-17A para investigar os efeitos do tamanho de partícula na captação celular e distribuição intracelular em sistemas de monocultura e cocultura.

Este estudo determinou a viabilidade celular usando o método WST-1 para monocultura de células THP-1 e UM-SCC-17A, bem como uma cocultura de ambos os tipos de células. Apesar de nenhuma morte celular óbvia ter ocorrido em grupos tratados com PLGA de 100 e 500 nm em todas as concentrações testadas, partículas de PLGA de 500 nm e 1 µm na concentração mais alta (20 µg/mL) reduziram significativamente a viabilidade celular em células UM-SCC-17A monocultivadas. Como esperado, a viabilidade de células THP-1 não foi significativamente afetada após 24 h de incubação com todos os três tipos de PLGA em concentrações de 5–20 µg/mL (≥ 95% viabilidade em comparação com células não tratadas, cuja viabilidade é considerada 100%). Idêntico aos resultados de células UM-SCC-17A monocultivadas, a viabilidade celular no sistema de cocultura não foi alterada pela presença de partículas de PLGA de 100 e 500 nm nas três dosagens usadas aqui, enquanto declinou significativamente no grupo tratado com 20 µg/mL de PLGA de 1 µm.

Avaliação de citotoxicidade de partículas utilizando o ensaio LDH é para determinar vazamento de membrana celular medindo a quantidade de LDH extracelular. A liberação desta enzima citoplasmática no sobrenadante da cultura celular é característica de lesão de membrana celular, levando à morte celular irreversível. Apesar do leve aumento dos níveis de LDH com dosagens mais altas em células UM-SCC-17A monocultivadas tratadas com várias doses de PLGA de 1 µm, nenhuma citotoxicidade distinta para as células foi observada mesmo na concentração mais alta de 20 µg/mL. Não surpreendentemente, todos os três tamanhos de PLGA usados aqui em várias dosagens foram incapazes de induzir liberação substancial de LDH no sobrenadante, indicando efeitos tóxicos insignificantes para células THP-1 monocultivadas, o que também é altamente consistente com os resultados de viabilidade celular descritos acima. Nos experimentos de cocultura, todas as partículas com diferentes concentrações mostraram excelente biocompatibilidade para ambas as células em termos de níveis de LDH liberados. Em geral, a ampla faixa de tamanho de partícula, de 100 nm a 1 µm, usada aqui cobre os tamanhos típicos de nanocarreadores (50–200 nm), como lipossomos, micelas, dendrímeros, polímeros e mini-células. Esta faixa também cobre partículas de tamanho sub-micrônico (partículas de 500 nm ainda podem ser consideradas NPs, por exemplo, partículas com tamanhos cerca de 500 nm têm mesmas vias de eliminação no pulmão que NPs de 10–100 nm e partículas de 1 µm de tamanho micrométrico. Nenhuma destas partículas de PLGA mostrou qualquer citotoxicidade óbvia para células THP-1 e/ou UM-SCC-17A em sistemas de monocultura e cocultura, exceto para partículas de PLGA de 500 nm e 1 µm na concentração mais alta contra células UM-SCC-17A e de cocultura (mas mais de 85% das células sobrevivem), indicando que são favoráveis para aplicações em sistemas de entrega de fármacos.

Capacidades de Captação Celular de PLGA em Sistemas de Monocultura e Cocultura

A Figura 4 mostra a morfologia celular (Fig. 4a,d,g), núcleos celulares e NPs de 100 nm (Fig. 4b,e,h), e imagens ampliadas mescladas (Fig. 4c,f,i) em sistemas de monocultura e cocultura. Nenhuma partícula foi observada nas células não tratadas do grupo controle. Agregados massivos de NPs de PLGA de 100 nm de grande tamanho foram observados no citoplasma de células monocultivadas de macrófagos. Enquanto isso, células UM-SCC-17A monocultivadas exibiram excelente capacidade de captação de PLGA de 100 nm, comprovada pelos sinais de fluorescência verde brilhante observados dentro da membrana celular. Para melhor ilustrar o acúmulo intracelular de partículas de PLGA em células THP-1 ou UM-SCC-17A e partículas extracelulares nas coculturas, sobreposições de imagens de campo claro com imagens de fluorescência foram aplicadas. No sistema de cocultura, ambos os tipos de células são diferenciáveis em termos de morfologia e tamanho celular nas imagens de campo claro, nas quais macrófagos exibiram forma redonda e tamanho pequeno, enquanto as células cancerígenas exibiram tamanho grande e forma alongada. No entanto, as células cancerígenas mostraram ingestão celular insuficiente devido à alta captação de PLGA de 100 nm por macrófagos no sistema cocultivado. Isso é esperado porque macrófagos são considerados como um tipo eficiente e específico de células imunes para realizar a função de fagocitose para eliminar microorganismos estranhos, alérgenos e partículas. Similarmente, Fig. 5 e Fig. 6 mostram análise qualitativa da capacidade de captação celular de partículas de PLGA de 500 nm e 1 µm em culturas de célula única ou mistas, respectivamente. É notável que ambas as morfologias celulares não foram alteradas após tratamento com diferentes tamanhos de partículas de PLGA na concentração de 10 mg/mL usada aqui. Partículas de PLGA de 500 nm e 1 µm exibiram intensidade de fluorescência mais forte em células UM-SCC-17A únicas do que em células THP-1 únicas. Em incubações de cocultura, há diminuições aparentes de sinal em células cancerígenas, nas quais a intensidade fluorescente de partícula foi encontrada menor que a dos macrófagos. Macrófagos fagocitaram todos os tipos de partículas rápida e efetivamente de modo que as células cancerígenas não conseguem ingerir partículas suficientes no sistema de cocultura. Para quantificar o efeito da fagocitose na capacidade de captação por células cancerígenas para diferentes tamanhos de partículas de PLGA, uma análise óptica semi-quantitativa foi realizada. Brevemente, as intensidades de fluorescência de partícula foram calculadas com base em, por exemplo, 50 células individuais carregadas de partícula para alcançar um valor médio para ambos os tipos de células, e o índice de captação de células cancerígenas foi determinado pela média da intensidade fluorescente intracelular de partícula por célula cancerígena normalizada à de macrófagos. Em monocultura, o índice de captação de células cancerígenas para PLGA de 100 nm foi encontrado como cerca de 1,34 ± 0,19, sugerindo que as células cancerígenas ingeriram mais partículas que aquelas ingeridas por macrófagos na cultura de célula única. Isso não é surpreendente devido ao alto nível de viscosidade de partículas de PLGA e o tamanho maior de células de câncer laríngeo. Similarmente, PLGA de 500 nm e 1 µm também foram grandemente internalizados por células cancerígenas com índices de captação de aproximadamente 1,5 ± 0,25 e 1,4 ± 0,31, respectivamente, em monocultura. Os índices de captação para partículas grandes declinaram substancialmente (0,59 ± 0,12 e 0,47 ± 0,1) na presença de macrófagos em sistemas de cocultura. Enquanto isso, capacidades de internalização celular idênticas para ambos os tipos de células após 24 h de incubação de partículas de PLGA de 100 nm na cultura de células mistas. Em geral, os resultados acumulados aqui sugeriram que a ingestão de partículas por células cancerígenas e macrófagos pode depender de diferentes vias de captação em cultura de célula única e ambiente de cocultura. Além disso, a presença de macrófagos reduziu a internalização celular de partículas de PLGA por células cancerígenas, particularmente para as grandes, um evento biológico observado em estudos de entrega de nanofármacos in vivo.

Quantificação de Captação Celular por Citometria de Fluxo

Citometria de fluxo é amplamente usada para determinar a interação partícula-célula de maneira quantitativa, por exemplo, a captação dependente de tamanho de partículas de poliestireno com tamanhos variando de 20 a 1000 nm por células dendríticas in vivo. FACS foi assim utilizado para análise da porcentagem de células positivas para NP e número de partícula naquelas células positivas para NP em sistemas de monocultura e cocultura. Então, contagens médias de NP em uma única célula foram calculadas determinando a intensidade total de fluorescência em células carregadas de partícula normalizada à fluorescência da dose total aplicada. Por exemplo, cerca de 70% de PLGA de 500 nm foi depositado nas células cancerígenas, enquanto o residual foi mantido no sobrenadante de culturas celulares. Esta intensidade de fluorescência medida por um leitor Tecan foi então comparada aos sinais médios/totais de FACS (valores de sinal FITC de P5 e P6 na Fig. 8) para estimar o número de partícula no sistema de cocultura. Como semeadas nas células cocultivadas, cerca de metade das células foram reconhecidas como macrófagos e o restante considerado como células cancerígenas. Observou-se que aproximadamente 13.000 de partículas únicas de PLGA de 100 nm se acumularam em células cancerígenas e 9700 partículas em macrófagos na monocultura, consistente com os exames microscópicos acima. Um número muito menor de partícula (164 ± 30 e 45 ± 15) foi ingerido por células cancerígenas monocultivadas para PLGA de 500 nm e 1 µm, com contagem de partícula ligeiramente menor nos respectivos macrófagos. O número de partículas ingeridas por células únicas está em grande concordância com registros da literatura; por exemplo, uma média de 2500 NPs de ouro revestidas com brometo de cetiltrimetilamônio foram depositadas em células epiteliais, enquanto NPs de ouro modificadas com PEG tiveram apenas algumas dezenas por célula. Em sistemas de cocultura, inesperadamente, há um leve aumento no número de partícula de 100 nm em células cancerígenas, apesar de um aumento maior de internalização de NP por macrófago. Comparando ao índice de captação na cultura de célula única para cultura de células mistas, também reduz cerca de 25% para partículas de PLGA de 100 nm. Os índices de captação foram encontrados para declinar significativamente com redução de cerca de 2,5 e 3 vezes no sistema cocultivado para PLGA de 500 nm e 1 µm, respectivamente. Geralmente, foi encontrado que a existência de macrófagos afeta grandemente a capacidade de captação de células cancerígenas especialmente para partículas grandes, o que também está em excelente concordância com as observações acima.

Indução de Fusão Celular por NPs de PLGA

Evidência científica extensiva mostrou que a fusão de monócitos/macrófagos em células gigantes multinucleadas (CGM) ocorreu em uma ampla gama de processos biológicos. Geralmente, implantação de biomateriais no corpo causa uma resposta a corpo estranho caracterizada pela fusão de macrófagos em CGMs e encapsulamento fibrótico. Uma ampla variedade de células primárias humanas e murinas como macrófagos alveolares, macrófagos esplênicos, microglia, macrófagos derivados de medula óssea e monócitos sanguíneos, bem como linhagens celulares como RAW264.7 e UG3 também foram frequentemente observadas para formar CGMs in vitro. É bem conhecido que macrófagos formam um fenótipo fusogênico quando são incapazes de ingerir materiais estranhos via fagocitose devido ao grande tamanho de partículas ou implantes. Até agora, não está claro se a fusão de células macrófagas in vitro relaciona-se ao tamanho de partícula na faixa 100–1000 nm, que pode ser facilmente fagocitado. Aqui, fusões celulares foram observadas em todos os grupos por exame microscópico. A fusão celular foi confirmada apenas quando múltiplos núcleos foram encontrados compartilhando o mesmo citoplasma em ambas as imagens de fluorescência e campo claro. Formação espontânea de células gigantes por células THP-1 ocorreu no grupo controle sem tratamento de partícula, com porcentagem de fusão de cerca de 10% do total de células, conforme relatado na literatura. Fusão celular dependente de tamanho foi encontrada para partículas de PLGA de 100 e 500 nm, enquanto PLGA de 1 µm induziu aumento insignificante de fusões em monocultura. Isso pode ser devido ao pequeno número de partículas de PLGA de 1 µm expostas às células (aproximadamente 60 partículas expostas a cada célula na concentração de 10 µg/mL). Quando os macrófagos foram cocultivados com células cancerígenas, as porcentagens de formação de CGM foram aumentadas em todos os grupos em comparação com os grupos de monocultura correspondentes. Em particular, há um incremento significativo de fusão celular para PLGA de 1 µm (19%) na cultura de células mistas. O aumento mais proeminente em fusão ocorreu em partículas de PLGA de 500 nm cocultivadas, o que pode ser atribuído ao grande tamanho de partícula e números suficientes de partícula ingeridos por célula.

A maquinaria molecular envolvida na fusão de macrófagos tem sido amplamente investigada, alcançando progresso substancial. Por exemplo, a formação de receptores de fusão de macrófagos CD47 e CD44 juntos permitiu mediar o processo de fusão de macrófagos e subsequente diferenciação de células gigantes e a entrega de miR-223 por vesícula de NP permitiu atenuá-la. Portanto, estudos futuros devem focar na determinação de moléculas-chave na regulação de fusão de macrófagos induzida por partícula e os receptores dominantes expressos na membrana de células gigantes. Outra preocupação importante é o destino das CGMs. Acredita-se que CGMs fundidas com partículas ou estímulos possam subsequentemente experimentar o processo de apoptose ou necrose. Isso pode levar à liberação de partículas não digeridas ou outros materiais gigantes para outras células in vitro ou tecidos biológicos in vivo, induzindo ainda mais resposta inflamatória de longo prazo ou granulomas. Por outro lado, a fusão de macrófagos em si pode ser benéfica para entrega de fármacos por NP, por exemplo, em tecidos tumorosos, a re-liberação de fármacos de macrófagos para células cancerígenas pode representar uma capacidade aprimorada de destruição tumoral. Mais importante, futuros estudos de nanomedicina devem abordar como explorar a aplicação de fusão de macrófagos para entrega de nanocarreadores para diagnóstico e terapia de doenças aprimorados. Isso é porque não apenas macrófagos são um tipo abundante de células imunes no corpo com excelente capacidade de captação de nanofármacos, mas também podem ser usados em entrega gênica direcionada para reparo de tecidos lesados.

Conclusão

Ao melhor de nosso conhecimento, este estudo relatou pela primeira vez a captação celular competitiva de partículas de PLGA com tamanhos variando de 100 nm a 1 µm em células de câncer laríngeo UM-SCC-17A e monócitos/macrófagos THP-1 cocultivados. Os dados coletados aqui provaram que células imunes podem alterar/reduzir a internalização de partícula por células cancerígenas in vitro, o que é semelhante aos achados anteriores em estudos de entrega de nanofármacos in vivo. Fusão celular de macrófagos dependente de tamanho e relacionada à cultura celular causada por partículas de PLGA também foi demonstrada aqui. Estudos futuros devem investigar o mecanismo de captação em sistemas cocultivados e projetar novas abordagens para alcançar um índice de captação mais alto para células de câncer laríngeo na presença de fagócitos. Além disso, avaliação elaborada do tráfego intracelular e destino de nanocarreadores de fármacos em sistemas co- ou tri-cultivados em 3D, que melhor imitam as condições in vivo, é necessária antes da utilização de estudos em animais in vivo e mesmo em ensaios clínicos.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado [e seus arquivos de informação suplementar].

Abreviações

PLGA:

Poli(ácido lático-co-glicólico)

HNSCC:

Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço

EPR:

Permeabilidade e retenção aumentadas

NPs:

Nanopartículas

ICG:

Verde de indocianina

SFM:

Sistema fagocítico mononuclear

LDH:

Lactato desidrogenase

FACS:

Citometria de fluorescência ativada

CGM:

Células gigantes multinucleadas

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz