Ferumoxytol atenua a função de MDSCs para melhorar a imunossupressão induzida por LPS na sepse

Resumo

A imunossupressão induzida pela sepse é reconhecida como uma das principais características responsáveis ​​por falhas terapêuticas. Células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), que são caracterizadas principalmente por suas propriedades supressoras, foram relatadas como expandidas na sepse. Ferumoxytol (FMT), um suplemento de ferro aprovado pela FDA, demonstrou possuir propriedades imunomodulatórias em tumores. No entanto, não está claro se a FMT altera as funções dos MDSCs para reduzir a imunossupressão na sepse tardia. Aqui, mostramos um efeito imunomodulador do FMT em MDSCs para melhorar a imunossupressão induzida por lipopolissacarídeo (LPS) no estágio final da sepse. A separação das células com FMT internalizado e a detecção do conteúdo de ferro intracelular mostraram que os MDSCs podem captar o FMT. Baixas doses de FMT não tiveram efeitos sobre a viabilidade celular dos MDSCs, mas o FMT inibiu a expansão dos MDSCs in vitro. Além disso, o FMT regulou negativamente os níveis de expressão de Arg-1, S100A8, S100A9 e p47phox, bem como a produção de ROS em MDSCs. FMT diminuiu a porcentagem de MDSCs granulocíticos (G-MDSCs) e promoveu a diferenciação de MDSCs em macrófagos. Além disso, o FMT reduziu o recrutamento de leucócitos e o espessamento da parede alveolar nos pulmões e áreas de necrose no fígado, bem como alguns marcadores bioquímicos de disfunção hepática. FMT diminuiu a porcentagem de G-MDSCs e MDSCs monocíticas (M-MDSCs) nos baços de camundongos sépticos induzidos por LPS. Digno de nota, o FMT reduziu as funções imunossupressoras das células T de G-MDSCs e M-MDSCs. Esperançosamente, o FMT também reduziu significativamente a expressão dos genes Arg-1 e p47phox em CD11b esplênico ⁺ Gr-1 ⁺ células isoladas de camundongos desafiados com LPS. Esses dados indicam que o FMT diminuiu as funções imunossupressoras dos MDSCs ao diminuir a produção de Arg-1 e ROS, sugerindo que o FMT pode reduzir a imunossupressão de longo prazo no estágio final da sepse.

Introdução

FMT, um suplemento de ferro aprovado pela Food and Drug Administration, tem sido usado para tratar a anemia por deficiência de ferro em adultos com doença renal crônica (DRC) [1], e o FMT também é amplamente usado como agente de contraste e carreador de drogas [2] . Estudos anteriores mostraram que o FMT tinha propriedades imunomoduladoras, como sua capacidade de induzir uma mudança fenotípica em macrófagos M2 em direção a um CD86 ⁺ alto , Subtipo de macrófago M1 positivo para TNF-α [3, 4]. No entanto, os efeitos do FMT em outras células do sistema imunológico não foram examinados.

MDSCs são uma população heterogênea de células mieloides imaturas com uma potente capacidade imunossupressora [5]. Em camundongos, os MDSCs são identificáveis ​​como Gr-1 ⁺ CD11b ⁺ células, enquanto os MDSCs humanos carecem do homólogo Gr-1 e são definidos como CD14 ^- HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ ou CD14 ⁺ HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ células [6]. MDSCs consistem em dois grandes grupos de células, granulocíticas ou PMN-MDSCs e M-MDSCs, e ambas as populações têm funções imunossupressoras através da produção de iNOS, ROS e Arg-1. O aumento da atividade de Arg-1 esgota a l-arginina e a falta de l-arginina inibe a proliferação de células T ao diminuir a expressão da cadeia zeta de CD3. INOS gera NO, que inibe as funções de JAK3 e STAT6 nas células T, bem como a expressão de MHC II. ROS induz a modificação pós-tradução de receptores de células T e pode causar a insensibilidade das células T antígeno-específicas [7]. M-MDSCs surgem de precursores de monócitos e podem se diferenciar em macrófagos e DCs sob condições de citocinas apropriadas. A maior parte do nosso conhecimento sobre MDSCs deriva de estudos sobre câncer. Nos últimos anos, uma expansão de MDSCs também foi descrita em doenças inflamatórias agudas e crônicas, incluindo inflamação, queimaduras e doenças autoimunes [8, 9]. Recentemente, um alto nível de captação de nanopartículas fluorescentes por MDSCs no esôfago e baço de camundongos foi relatado em estudos de imagem [10]. No entanto, não está claro se a FMT altera a função dos MDSCs envolvidos no desenvolvimento de doenças inflamatórias.

Sepse, uma resposta inflamatória desregulada do hospedeiro à infecção grave que pode causar disfunção orgânica com risco de vida, é a causa mais comum de morte na unidade de terapia intensiva. A sepse inicia uma resposta pró-inflamatória avassaladora que, se não tratada precocemente, se transforma rapidamente em imunossupressão de longo prazo. A expansão de MDSCs foi descrita nos baços e nódulos linfáticos em modelos animais sépticos [8, 11], bem como em pacientes com sepse [12,13,14]. A ativação de células imunossupressoras, como as MDSCs, é crítica para o controle adequado da hiperresponsividade do sistema imune inato, mas sua expansão excessiva pode levar à hiperimunossupressão, que é a força motriz predominante para infecção secundária e mortalidade na sepse tardia. Números aumentados de MDSCs se correlacionam com a supressão da proliferação de linfócitos. Foi relatado que os MDSCs adquirem seu fenótipo na medula óssea e então migram para órgãos linfóides secundários para inibir as respostas das células T e suprimir sua proliferação em camundongos imunossuprimidos com LPS [8]. A maioria dos pacientes com sepse prolongada exibe um estado imunossupressor, e a maior parte da mortalidade por sepse se deve à imunossupressão por sepse tardia. Eliminar MDSCs pode ter efeitos benéficos na sepse tardia, restaurando a resposta imune [15]. Portanto, formulamos a hipótese de que o FMT pode modular as funções dos MDSCs para reduzir a imunossupressão na sepse tardia.

Aqui, mostramos um efeito imunomodulador do FMT em MDSCs. Utilizamos as propriedades magnéticas do FMT para revelar que os MDSCs foram capazes de fagocitar o FMT in vitro. Além disso, descobrimos que o FMT atenuou a função imunossupressora de MDSCs por meio da regulação negativa de Arg-1 e ROS. Além disso, experimentos in vivo confirmaram que o FMT melhorou o estágio final da sepse induzida por LPS em camundongos ao enfraquecer a capacidade dos MDSCs de inibir as células T. Nossos dados sugerem que a função imunomoduladora da FMT pode ser usada para tratar a imunossupressão que ocorre na sepse tardia.

Materiais e métodos

Ratos

Camundongos machos C57BL / 6 (8–10 semanas de idade) foram adquiridos no Model Animal Research Center da Nanjing University (Nanjing, China). Os camundongos foram criados em condições livres de patógenos específicos (SPF) em um ciclo claro / escuro de 24 horas e tiveram acesso livre a comida e água. Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Universidade de Nanjing.

Coloração com Azul da Prússia

A distribuição intracelular de FMT foi detectada usando o kit de coloração com azul da Prússia de Perl (Solarbio, China) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 15 min e, em seguida, incubadas com ferrocianeto de potássio a 10% por 25-30 min, seguido de lavagem e contracoloração com vermelho nuclear rápido por 10 min. As células contendo partículas azuis no citoplasma foram positivas para coloração com azul da Prússia.

Geração de MDSCs derivados da medula óssea

As células da medula óssea foram obtidas por lavagem dos fêmures e tíbias de camundongos do tipo selvagem seguido de lise de hemácias. As células da medula óssea foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo com 10% de FBS, 1% v / v de penicilina e estreptomicina (Gibco, CA), 40 ng / mL de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Alemanha) e 40 ng / mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Alemanha) a 37 ° C em 5% de CO ₂ incubadora por 4 dias. Células não aderentes foram coletadas para experimentos adicionais.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi analisada usando o Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, MDSCs (5 × 10 ³ ) foram colocados em placas de cultura de 96 poços e incubados em 5% de CO ₂ atmosfera a 37 ° C antes do tratamento. O meio foi então substituído por meio fresco contendo várias concentrações de FMT (250, 500, 1000, 2000 μg / mL) por 24 h. O sobrenadante foi subsequentemente descartado e meio fresco contendo solução de CCK-8 foi adicionado. Após incubação a 37 ° C por 3 h, a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas Gen5 (BioTek, EUA).

Isolamento de RNA total e PCR em tempo real

O RNA total foi extraído das células usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) e quantificado com um espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Scientific, EUA) antes de ser transcrito reversamente usando o kit de síntese de cDNA de primeira fita HiScript II (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) de acordo com as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (PCR) foi realizada usando o kit SYBR Green PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) em um sistema qPCR em tempo real StepOne-Plus da Applied Biosystems (Applied Biosystems, Forster City, CA). A expressão do gene foi normalizada para GAPDH usando o 2 ^−ΔΔCt método. As sequências de primer estão listadas no arquivo adicional 1:Tabela S1.

Citometria de fluxo

Os tecidos foram preparados como suspensões de células únicas com colagenase tipo D (1 mg / mL) e DNase I (0,1 mg / mL) em solução salina balanceada de Hanks (HBSS) a 37 ° C por 30 min e, em seguida, os glóbulos vermelhos de o baço foi lisado. As suspensões de células foram filtradas através de filtros de células de 70 μm e os linfócitos foram coletados por centrifugação a 300 g por 5 min a 4 ° C. Após a lavagem, as células foram imediatamente preparadas para seleção de células ativadas por fluorescência. Células únicas foram incubadas com reagente de bloqueio FcR (Miltenyi Biotech, Alemanha) por 10 min, seguido por coloração com os seguintes conjugados de anticorpo por 20 min:anti-CD11b marcado com FITC, anti-CD11c, anti-CD4 e anti-CD8; Anti-Ly6G marcado com PE; Anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4 / 80 e anti-MHC II marcados com APC (BioLegend, CA). Após a lavagem, as células foram detectadas com um FACS Calibur (BD, CA) e os dados foram analisados ​​usando FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., EUA)

Coloração H&E

Os tecidos do fígado e do pulmão foram fixados em formaldeído tamponado com fosfato a 4%. Tecido fixado foi incluído em parafina e cortes de 5 μm de espessura foram corados com hematoxilina e eosina para microscopia de luz.

Ensaio de imunoabsorção enzimática

Os níveis séricos de TNFα, MCP-1 e IL-1β foram determinados usando kits específicos de ELISA (Dakewe, China) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi executada em duplicata.

Detecção de ROS

O ROS intracelular foi medido usando o kit de diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 5 μM de DCFH-DA a 37 ° C no escuro por 30 min, depois lavadas com meio RPMI-1640 e ressuspensas em PBS. As células foram analisadas quanto à fluorescência verde intracelular usando um citômetro de fluxo (BD, CA).

Ensaio de proliferação de células T

CD3 total ⁺ As células T foram enriquecidas a partir dos baços de camundongos de tipo selvagem usando um kit CD3ε MicroBead (Miltenyi Biotech, Alemanha) e coloração CFSE incubada (Invitrogen, EUA). Para a proliferação de células T induzida por anticorpo anti-CD3 / CD28, as células T foram ativadas com anticorpo anti-CD3 (1 μg / mL) e anticorpo anti-CD28 (1 μg / mL). G-MDSCs (Gr-1 ^alto Ly-6G ⁺ ) e M-MDSCs (Gr-1 ^dim Ly-6G ^- ) isolado de baços de camundongos tratados com FMT ou tratados com veículo usando um kit de isolamento de células supressoras derivadas de mieloide (Miltenyi Biotech, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. MDSCs foram co-cultivados na proporção de 1:1 com CD3 marcado com CFSE ⁺ Células T em placas de fundo plano de 96 poços por 3 dias. CFSE é dividido igualmente entre as células-filhas com cada divisão; portanto, a proliferação foi determinada por citometria de fluxo. A pureza das células após a classificação era> 90%.

Estatística e análise de dados

Todas as estatísticas foram calculadas usando o software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) e são apresentadas como médias ± desvios padrão (SD). As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo Mann-Whitney U teste ou não pareado, aluno bicaudal t teste. ANOVA de uma via foi usada para a comparação de vários grupos. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. Diferenças com p valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Um grande número de FMT de captação de MDSCs

Para verificar se as células com FMT internalizadas são separadas por MACS MicroBeads, usamos a coloração com azul da Prússia para detectar o conteúdo de ferro intracelular em macrófagos tratados com FMT (1000 ng / mL) por 24 h. As células foram divididas em três grupos:antes da separação magnética, células FMT-positivas que foram selecionadas magneticamente (FMT +) e aquelas que não foram magneticamente isoladas (FMT-). A coloração com azul da Prússia demonstrou que a maioria das células selecionadas magneticamente eram positivas para o azul da Prússia (Fig. 1a). Para comparar a capacidade de fagocitar FMT entre MDSCs, macrófagos e DCs, isolamos esplenócitos de camundongos C57BL / 6 naive tratados com FMT por 6 h, 12 h, 24 h e 48 h. Os esplenócitos foram divididos em dois subconjuntos:antes da separação magnética e células FMT-positivas. A análise de citometria de fluxo revelou que quase 60% dos MDSCs e mais de 60% dos macrófagos acumularam FMT após 12–48 h (Fig. 1b, c). Apenas aproximadamente 40% das DCs foram FMT-positivas em 24 h. Esses dados mostraram que, como os macrófagos, os MDSCs podem captar o FMT e sugeriram que o FMT pode influenciar a função do MDSC.

Habilidades de MDSCs, macrófagos e DCs para captar FMT. a Os macrófagos foram tratados com FMT (1000 ng / mL) por 24 h, em seguida, corados com azul da Prússia para verificar a presença celular e deposição de ferro entre três grupos:antes da separação magnética, selecionado magneticamente (FMT +), não isolado magneticamente (FMT-) . b Esplenócitos de camundongos C57BL / 6 naïve foram incubados com FMT por 6 h, 12 h, 24 h e 48 h. Análise FACS das porcentagens de MDSCs, macrófagos e DCs em dois subconjuntos:antes da separação magnética, células FMT-positivas. c A proporção de células FMT-positivas para células antes da separação magnética. Todos os dados são representativos de três experimentos independentes para cada grupo experimental e são exibidos como a média ± desvio padrão

FMT inibe a expansão de MDSCs in vitro

Foi relatado que FMT induz uma mudança fenotípica em macrófagos M2 em direção a um CD86 ⁺ alto , Subtipo de macrófago M1 positivo para TNF-α [3]. Uma vez que há um grande número de MDSCs que podem assumir o FMT, formulamos a hipótese de que o FMT pode alterar a função dos MDSCs. Primeiro, os efeitos citotóxicos do FMT em 250, 500, 1000 e 2000 μg / mL em MDSCs foram avaliados pelo ensaio de viabilidade celular CCK8. Os resultados mostraram que o FMT não teve efeito sobre a viabilidade celular em doses baixas e apenas exibiu citotoxicidade moderada na dose máxima de 2.000 μg / mL (Fig. 2a). Em seguida, testamos se o FMT em concentrações diferentes afetaria a geração de MDSCs. Células da medula óssea isoladas de camundongos C57BL / 6 naïve foram tratadas com médias ou várias concentrações de FMT (250, 500, 1000 e 2000 μg / mL) por 4 dias, seguido por caracterização por citometria de fluxo no dia 4. GM-CSF e IL-6 foi adicionado no dia 0. Os resultados de três experimentos independentes revelaram que FMT em 1000 e 2000 μg / mL diminuiu significativamente a expansão de MDSCs (Fig. 2b, c).

Quantificação citométrica de fluxo da porcentagem de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ células após o tratamento com FMT a 250, 500, 1000, 2000 μg / mL in vitro. a A viabilidade das células MDSC foi detectada usando ensaios de CCK8 após o tratamento com várias concentrações de FMT por 24 h. b , c Células de medula óssea isoladas de camundongos C57BL / 6 foram cultivadas por 4 dias com GM-CSF e IL-6 na presença de diferentes concentrações de FMT, e os fenótipos celulares foram avaliados por citometria de fluxo. Todos os dados são representativos de três experimentos independentes para cada grupo experimental e são exibidos como a média ± desvio padrão. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 conforme determinado por um aluno não pareado t teste versus células tratadas com veículo sozinho

FMT reduz a capacidade imunossupressora de MDSCs

Os MDSCs usam vários mecanismos para inibir a proliferação e função efetora das células T, sendo o melhor descrito a produção de ROS e Arg-1. A expressão do componente p47phox do complexo nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-oxidase (NOX) é responsável pela produção de ROS em MDSCs [5]. Foi relatado que S100A8 / A9 é sintetizado e secretado por MDSCs em uma alça inflamatória autócrina e que isso é importante na supressão da função das células dendríticas em modelos de camundongos [16]. Para determinar se FMT poderia alterar a função de MDSCs, obtivemos MDSCs derivados de BM conforme descrito anteriormente e usamos RT-PCR para medir a expressão de mRNA em MDSCs tratados com FMT versus controles não tratados. Os resultados revelaram que os MDSCs tratados com FMT diminuíram significativamente os níveis de expressão de Arg-1, S100A8, S100A9 e p47phox em comparação com os MDSCs não tratados (Fig. 3a-h). Em seguida, avaliamos os níveis de ROS em MDSCs de controle e MDSCs tratados com FMT. Os resultados revelaram que os MDSCs tratados com FMT exibiram um nível significativamente mais baixo de ROS do que as células de controle (Fig. 3i, j). Posteriormente, comparamos as mudanças nas subpopulações de MDSC nos grupos tratados e não tratados com FMT. Os resultados mostraram que FMT diminuiu a porcentagem de G-MDSCs, com um ligeiro aumento em M-MDSCs também observado (Fig. 3k, l).

FMT altera a função de MDSCs in vitro. MDSCs derivados da medula óssea tratados com veículo ou FMT por 24 h. a - h Expressão do gene Arg-1, S100A8, S100A9 e p47phox a partir de MDSCs tratados conforme medido por RT-PCR quantitativo. eu MDSCs derivados de BM foram incubados com FMT por 24 h e a produção de ROS foi detectada por FCM. j Dados quantitativos de i . k Subpopulações de MDSCs nos grupos tratados com FMT e de controle. l Análise FACS das percentagens de G-MDSCs e M-MDSCs. Todos os dados são representativos de três experimentos independentes para cada grupo experimental e são exibidos como a média ± desvio padrão. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 conforme determinado por um aluno não pareado t teste versus células tratadas com veículo sozinho

FMT promove a diferenciação de MDSCs em macrófagos

Para determinar se FMT estimula a diferenciação final de MDSCs em macrófagos, tratamos as células com 1000 μg / mL de FMT no dia 0 e realizamos citometria de fluxo para os marcadores associados a macrófagos CD11b e F4 / 80 nos dias 1, 3 e 5. O os resultados mostraram que 1 dia após a adição de 1000 μg / mL de FMT, a proporção de macrófagos aumentou significativamente em mais de 2 vezes em comparação com as células não tratadas. Da mesma forma, 3 dias e 5 dias após o tratamento com FMT, as proporções de macrófagos também aumentaram significativamente (Fig. 4a, b).

Efeito do FMT na diferenciação de MDSCs. a , b MDSCs derivados da medula óssea foram tratados com ou sem 1000 μg / mL FMT e o número de macrófagos foi avaliado após 1 dia, 3 dias e 5 dias por FACS. Todos os dados são representativos de três experimentos independentes para cada grupo experimental e são exibidos como a média ± desvio padrão. * p <0,05, versus células tratadas com veículo sozinho

FMT melhora os sintomas em camundongos sépticos induzidos por LPS

Foi relatado que a sepse está associada a danos nos tecidos e leva à falência de órgãos e disfunção endotelial [17]. Para investigar se a FMT reduz os sintomas de sepse tardia, a extensão dos danos aos órgãos nos camundongos experimentais foi avaliada após 10 dias. Um exame histopatológico dos pulmões na sepse induzida por LPS indicou que o FMT reduziu o recrutamento de leucócitos e o espessamento da parede alveolar em comparação com os camundongos tratados com veículo. A coloração de H&E também revelou que a área de necrose hepática era menor nos camundongos tratados com FMT em comparação com os camundongos tratados com veículo (Fig. 5a, b). Além disso, os níveis séricos de aspartato transaminase, usados ​​como um marcador bioquímico de disfunção hepática nesses animais, foram significativamente mais baixos nos fígados de camundongos tratados com FMT em comparação com o controle (Fig. 5c). No entanto, FMT não afetou os níveis de alanina aminotransferase (Fig. 5d). Além disso, acredita-se que a sepse esteja associada a resultados adversos, como produção elevada de citocinas inflamatórias; portanto, avaliamos as alterações nos níveis de citocinas pró-inflamatórias no soro. O nível de TNF-α no soro foi ligeiramente, mas não significativamente, menor em camundongos tratados com FMT 3 h após a injeção de LPS, e nenhuma diferença nos níveis de MCP-1 ou IL-1β foi observada entre camundongos tratados com FMT e veículo camundongos tratados (Fig. 5e-g).

FMT melhora a lesão hepática em camundongos sépticos induzidos por LPS. a Os camundongos receberam PBS ou uma injeção i.p. injeção de 5 mg / kg de peso corporal de LPS bacteriano no dia 0. Após 1 he 5 dias, FMT a uma dose de 10 mg / kg ou 100 μL de solução salina foi administrada pela veia da cauda. Os camundongos foram divididos em quatro grupos ( n =6):controle, veículo receptor; LPS, recebendo apenas LPS; FMT, recebendo apenas FMT; e LPS + FMT, recebendo LPS e FMT. b Os tecidos pulmonar e hepático foram corados com hematoxilina e eosina. c-d Transaminases séricas (ALT e AST) foram medidas ( n =6). Os níveis de citocinas (TNF-a, IL-1β e MCP-1) foram medidos por ELISA. e - g Efeitos da sepse induzida por LPS na produção de citocinas em camundongos tratados com veículo ou ferumoxitol. Os níveis de citocina medidos por ELISA no soro do veículo ou de camundongos tratados com ferumoxitol após administração i.p. Desafio com LPS (50 mg / kg). ** p <0,01 conforme determinado por um aluno não pareado t teste

FMT diminui o número de MDSCs no baço de camundongos sépticos induzidos por LPS

Evidências crescentes apóiam que a imunossupressão associada à sepse aumenta a mortalidade [18] e os MDSCs são considerados o principal componente da rede imunossupressora [8]. Foi relatado que G-MDSCs são mais especificamente expandidos em pacientes sépticos e parecem ser os principais atores da supressão imunológica induzida por sepse [12]. Para determinar se FMT modula populações de MDSC em camundongos do tipo selvagem, camundongos C57BL / 6 foram administrados com FMT via veia da cauda na hora 1 e dia 5. Os resultados mostraram que nenhuma diferença significativa na porcentagem de MDSCs foi detectada no baço ou no osso medula entre o controle e os camundongos tratados com FMT (Fig. 6a, e). Digno de nota, o FMT diminuiu a expansão dependente de LPS de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ células da medula óssea e do baço (Fig. 6a, e), o que é consistente com estudos in vitro. Além disso, o FMT também diminuiu a porcentagem de G-MDSCs e M-MDSCs no baço, enquanto apenas a porcentagem de G-MDSCs foi diminuída na medula óssea (Fig. 6c, g). Estes dados indicam que o FMT diminui o número de MDSCs no baço de camundongos sépticos induzidos por LPS.

FMT diminui o número de MDSCs em camundongos sépticos induzidos por LPS. Os camundongos foram divididos em quatro grupos ( n =6):controle, veículo receptor; LPS, recebendo apenas LPS; FMT, recebendo apenas FMT; e LPS + FMT, recebendo LPS e FMT. a CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ populações de células na medula óssea foram detectadas por FACS. b Dados quantitativos de a . c Gráfico de pontos de citometria de fluxo da expressão Ly6C e Ly6G no CD11b fechado ⁺ células do baço. d Quantificação das percentagens dos subconjuntos granulocíticos e monócitos. e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ as populações de células nos baços foram detectadas por FCM. f Dados quantitativos de e . g Gráfico de pontos de citometria de fluxo da expressão de Ly6C e Ly6G nas células CD11b + bloqueadas de baços. h Quantificação das percentagens dos subconjuntos granulocíticos e monócitos. * p <0,05 conforme determinado por um aluno não pareado t teste

FMT reduz as propriedades imunossupressoras de células T de MDSCs in vivo

A redução numérica de múltiplas populações de células imunes, incluindo células T CD4 e CD8, é uma das principais características da resposta imune adaptativa após a sepse. Está associada a um risco aumentado de morte, bem como a outros desfechos desfavoráveis ​​[19, 20]. Foi demonstrado que os MDSCs suprimem a proliferação das células T ao prejudicar a expressão da cadeia zeta das células T em pacientes com sepse [21]. Para avaliar a proporção de linfócitos na sepse em estágio avançado, medimos a proporção de células T CD4 e CD8 em um modelo de sepse murina. Os resultados mostraram que o FMT causou um aumento nas células T CD4 e CD8 nos baços dos camundongos induzidos por LPS (Fig. 7a, b). Não houve diferenças nas porcentagens de células T CD4 e CD8 no baço de camundongos tratados com FMT em comparação com camundongos de controle (Fig. 7a, b). Para confirmar ainda mais o papel dos MDSCs na supressão da proliferação de células T in vivo, G-MDSCs e M-MDSCs foram isolados dos baços do veículo ou camundongos desafiados com LPS tratados com FMT por MACS e co-cultivados com células T CD3 a 1:1 Razão. Nossos resultados mostraram que o tratamento com FMT reduziu as funções imunossupressoras das células T de G-MDSCs e M-MDSCs (Fig. 7e, f). Além disso, também medimos os níveis de expressão de Arg-1 e p47phox em MDSCs isolados do baço de camundongos. Como esperado, a expressão dos genes Arg-1 e p47phox foi significativamente reduzida em CD11b esplênico ⁺ Gr-1 ⁺ células isoladas de camundongos desafiados com LPS tratados com FMT quando comparados com camundongos desafiados com LPS (Fig. 7g, h). Esses dados indicam que o FMT diminuiu as funções imunossupressoras dos MDSCs ao diminuir a produção de Arg-1 e ROS, sugerindo que o FMT pode reduzir a imunossupressão de longo prazo na sepse em estágio avançado.

FMT reduz as propriedades imunossupressoras de MDSCs. a CD3 ⁺ CD4 ⁺ populações de células em baços foram detectadas por FACS. b Dados quantitativos de a . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ populações de células em baços foram detectadas por FACS. d Dados quantitativos de a . e A capacidade de G-MDSCs de camundongos para suprimir a proliferação de células T induzida por estimulação anti-CD3 / CD28 foi medida por FACS ( n =3 por grupo). Um histograma representativo é mostrado. f A capacidade de M-MDSCs de camundongos desafiados com LPS tratados com veículo ou FMT para suprimir a proliferação de células T induzida por estimulação anti-CD3 / CD28 foi medida por FACS ( n =3 por grupo). Um histograma representativo é mostrado. g , h Expressão de ARNm de Arg-1 e p47phox em MDSCs de veículo ou camundongos desafiados com LPS tratados com FMT

Discussão

O suplemento de ferro aprovado pela FDA FMT tem sido amplamente utilizado como um transportador de drogas e um agente de contraste em exames de ressonância magnética. Verificou-se que o FMT inibe o crescimento do câncer ao induzir uma resposta imune pró-inflamatória com polarização de macrófagos M1 [3], indicando que o FMT tem funções imunomodulatórias. Neste estudo, avaliamos o efeito do FMT em MDSCs comparando o fenótipo e a função de MDSCs tratados com FMT com os MDSCs de controle não tratados. Estudos anteriores mostraram que os MDSCs são capazes de absorver nanopartículas magnéticas [10], e nossos dados demonstraram ainda que o FMT atenua as funções imunossupressoras dos MDSCs no baço através da regulação negativa de Arg-1 e ROS. Nossos dados também indicaram que o FMT tem um efeito direto na diferenciação de MDSC, com aproximadamente um quinto das células se diferenciando uniformemente em macrófagos após 5 dias em experimentos in vitro. Embora não tenhamos investigado o fenótipo de macrófagos expostos ao FMT, hipotetizamos que eles eram do subtipo M1 pró-inflamatório. Os resultados demonstraram claramente que FMT melhora a diferenciação e maturação de MDSCs e, portanto, sugere que isso está subjacente à redução na população de MDSC que observamos durante a sepse tardia.

A sepse inicia uma resposta imune complexa que varia com o tempo e é acompanhada por respostas pró-inflamatórias e antiinflamatórias. Estudos anteriores mostraram que a morte nos estágios iniciais da sepse é devido à inflamação excessiva. Derive e colegas relataram que a transferência adotiva de MDSCs do dia 10 para camundongos sépticos atenuou a produção de citocinas peritoneais e melhorou a taxa de sobrevivência [22]. Mais recentemente, Namkoog et al. observaram que o pré-tratamento com claritromicina aumentou a sobrevivência em um modelo de camundongo de choque induzido por LPS ao expandir o CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ população de células [23]. Eles descreveram que os MDSCs desempenham um papel protetor na sepse, no entanto, deve-se observar que eles estavam preocupados com os estágios iniciais da sepse. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados ​​e / ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

ALT:

Alanina aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartato aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleucina-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Espécies que reagem ao oxigênio

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α

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