Otimização da Citometria de Fluxo de Imagem para Quantificar Cinética e Especificidade da Captura de Vesículas Extracelulares por Células HEK293T

Resumo

Vesículas extracelulares (VEs) são vesículas de bicamada lipídica em nanoescala secretadas naturalmente pela maioria dos tipos celulares como mecanismo de comunicação para entregar proteínas, lipídios e material genético. Apesar do potencial terapêutico das VEs, há informação limitada sobre cinética e especificidade de captura de VEs. Aqui, otimizamos uma plataforma baseada em citometria de fluxo de imagem (CFI) para avaliar quantitativamente efeitos de dose, tempo e especificidade de célula receptora na internalização de VEs de células de rim embrionário humano (HEK293T) de forma de alta produtividade. Descobrimos que a captura de VEs HEK293T é um processo ativo, dependente de dose e tempo. Além disso, a seletividade da captura de VEs foi quantificada in vitro, e descobrimos que VEs HEK293T foram internalizadas em maiores quantidades por células da mesma origem. Por fim, células-tronco neurais internalizaram significativamente mais VEs HEK293T relativamente a neurônios maduros, sugerindo que células-tronco ou progenitoras, que são metabolicamente mais ativas que células terminalmente diferenciadas, podem ter taxas mais altas de internalização ativa de VEs. A caracterização da captura de VEs, notavelmente especificidade, dependência de dose e tempo, e ensaios cinéticos ajudarão a informar e desenvolver terapêuticos baseados em VEs direcionados e eficientes.

Introdução

A pesquisa de vesículas extracelulares é um campo em expansão devido à utilidade terapêutica e diagnóstica de vesículas extracelulares (VEs) naturais e engenheiradas. VEs variam de 50 a 1000 nm de diâmetro, são produzidas por todos os tipos celulares, e são enriquecidas com proteínas transmembrana, incluindo CD63, CD81 e CD9; lipídios; proteínas; e DNA, RNA, mRNA e microRNA [1-5]. Conteúdo de VEs, notavelmente mRNA e miRNA ativos, tem sido implicado na modulação de células receptoras via tradução de novo e regulação pós-traducional de células-alvo [4, 6]. Entender e então modificar a captura e internalização cinética de VEs eventualmente levará a entrega otimizada de conteúdos de VEs a células-alvo com concentrações altas o suficiente para ter benefício terapêutico.

Antes consideradas "o lixo das células", VEs têm sido aproveitadas como alternativa a terapias celulares devido a muitas vantagens incluindo sua biocompatibilidade, baixa imunogenicidade e toxicidade, capacidade de dosagem repetida, várias vias de administração, e potencial para entregar fármacos e terapias genéticas [3]. Nosso grupo relatou anteriormente efeitos positivos de VEs derivadas de células-tronco neurais em acidente vascular cerebral e lesão cerebral traumática. Em ambos modelos murino e suíno de AVC, VEs melhoraram recuperação tecidual e funcional pós-AVC [3, 7, 8]. Também mostramos VEs como neuroprotetoras com benefícios funcionais em modelo roedor de lesão cerebral traumática [9]. Apesar desses efeitos observados e potencial futuro das VEs, há pouca compreensão de especificidade e cinética de captura de VEs, o que pode dificultar a tradução de terapêuticos baseados em VEs para a clínica.

VEs também têm sido engenheiradas como vetores de transferência e carregadas com agentes terapêuticos incluindo terapias gênicas e compostos químicos como alternativa a terapêuticos e vetores de entrega de nanopartículas sintéticas [4, 10-12]. Células HEK293T têm sido amplamente usadas como células produtoras de VEs devido à sua proliferação rápida inerente, alto rendimento de VEs, e facilidade de manipulação genética [13-17]. VEs HEK293T entregaram terapias gênicas incluindo terapêuticos miRNA para câncer de mama [12] e foram usadas para entregar quimioterápicos e construções de proteínas terapêuticas em modelo de schwannoma [18]. Similar a estudos de nanopartículas sintéticas avaliando citotoxicidade in vitro, ensaios de toxicidade MTT exibiram baixa toxicidade de VEs HEK293T não carregadas e subsequente alta citotoxicidade quando carregadas com quimioterápicos [10, 18-21]. Devido a esta utilização abundante de VEs HEK293T, analisamos sua cinética e especificidade neste estudo.

Captura seletiva ou específica refere-se à habilidade natural de uma VE alvejar tipos celulares específicos. Há abundante evidência sobre mecanismos de internalização de VEs com pouco consenso sobre especificidade de captura [22]. Frequentemente VEs exibem captura seletiva por células receptoras similares às suas células parentais, células epiteliais internalizam mais VEs derivadas de epitélio que outras células receptoras [23, 24], e células-tronco mesenquimais (CTM) internalizam quantidade significativamente maior de VEs derivadas de CTM comparado com outras linhagens celulares in vitro [24]. No entanto, outros estudos encontraram que VEs são internalizadas por todos os tipos celulares e exibem biodistribuição não-seletiva quando administradas in vivo [22, 25]. Apesar do imenso potencial terapêutico e interesse das VEs, há deficiência na compreensão de especificidade de captura de VEs. Ao entender melhor a especificidade de captura de VEs, podemos escolher apropriadamente células produtoras de VEs que são seletivamente internalizadas por células receptoras de interesse e assim melhorar a aplicabilidade terapêutica das VEs.

Uma razão potencial para resultados conflitantes de captura de VEs é a falta de padronização em plataformas de medição, incluindo análises de efeitos de dose e tempo. Recentemente, um grupo de especialistas da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) lançou um artigo de posição enfatizando a necessidade de análise de dose e tempo, entre outros fatores confundidores na captura de VEs [26]. O grupo afirmou que "uma dose não serve para todos" e que dose pode afetar captura ou seletividade de VEs [26]. Elevação de doses de VEs HEK293T altera padrão de biodistribuição in vivo [27]. Perfis de captura de VEs derivadas de soro foram significativamente alterados por dose [28]. Adicionalmente, tempos de co-incubação de VEs com células receptoras variando de 15 min a 48 h [24, 29-33] podem alterar medições de captura. Se adotado por pesquisadores e indústria de VEs, um processo quantificável e confiável para determinar curvas padrão de dose e tempo para ajudar a identificar a dose mínima efetiva pode levar a estudos mais robustos e úteis.

Anteriormente, pesquisadores usaram citometria de fluxo padrão junto com várias formas de microscopia de baixa produtividade incluindo microscopia confocal para analisar captura de VEs [32-34]. No entanto, estas tecnologias têm várias limitações. Microscopia confocal pode ser demorada e subjetiva. Citômetros de fluxo tradicionais foram projetados para medir partículas biológicas na faixa celular, não podem diferenciar enxame ou coincidência de VEs, e têm ruído aumentado devido ao disparo [35-38]. Conforme mencionado pelo grupo ISEV, há crescente consciência das limitações físicas da citometria de fluxo tradicional e destaca a demanda por citometria de fluxo especializada com limites de detecção na faixa de 100 nm [26, 38]. Citometria de fluxo de imagem (CFI) combina a natureza quantitativa de alta produtividade da citometria de fluxo junto com tecnologia de imagem de fluorescência que pode resolver partículas fluorescentes inerentemente pequenas, até 100 nm de diâmetro [38]. Capacidades de CFI levam a baixo ruído/fundo, diminuição de enxame, e dispositivos de carga acoplada para clareza de imagem [37, 39]. Estas características auxiliam no desenvolvimento de estratégia de gating para caracterizar VEs e captura com confirmação visual de forma de alta produtividade como plataforma de captura de VEs precisa e quantificável [36, 37, 40].

Neste estudo, células HEK293T expressando CD63-eGFP foram utilizadas como linhagem celular doadora para produção de VEs devido ao seu uso comum em desenvolvimento terapêutico. As VEs fluorescentes isoladas foram co-cultivadas com linhagens celulares receptoras incluindo células neurais e endoteliais. Captura foi quantificada usando CFI, resultando em plataforma padronizada para medir importantes características cinéticas de captura e internalização de VEs para sistemas celulares in vitro. Além disso, fornecemos dados sobre um processo para quantificar captura de VEs fluorescentes em condições diferentes e linhagens celulares cultivadas para elucidar captura seletiva de VEs.

Materiais e Métodos

Cultura Celular

Células de rim embrionário humano (HEK293T) foram compradas da ATCC e cultivadas em DMEM contendo 10% soro fetal bovino, 100 U/mL penicilina, e 100 μg/mL estreptomicina. Células-tronco neurais humanas (hNSC), células neurais SH-SY5Y, células epiteliais hepáticas C3A, células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), e neurônios foram todas cultivadas sob condições padrão a 37 °C, 5% CO₂ antes dos ensaios de captura de vesículas extracelulares.

Marcação e Isolamento de VEs

DNA plasmídio CD63-eGFP foi obtido da Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 foi um presente de Paul Luzio (plasmídeo Addgene #62964). Células HEK293T foram cultivadas a 70% de confluência em pratos de 10 cm, e 10 μg de DNA plasmídio foi transfectado usando Lipofectamine 2000 de acordo com instruções do fabricante. Vinte e quatro horas pós-transfecção, meios foram trocados para meios padrão HEK293T desprovidos de soro fetal bovino e coletados por 3 dias consecutivos. Como descrito anteriormente [3], meios HEK293T foram filtrados através de filtro de 0,22-μm e enriquecidos por ultrafiltração usando unidades de filtro centrífugo de celulose regenerada 100-kDa Amicon e lavados duas vezes com PBS++. VEs foram concentradas a 1 mL, e concentração e distribuições de tamanho foram medidas no Nanosight NS300 pelo protocolo do fabricante (Malvern, UK). VEs foram isoladas de diferentes vasos de cultura HEK293T, cada vaso considerado réplicas biológicas separadas, com três réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica (mínimo de nove amostras totais para cada condição).

Ensaios de Captura

Linhagens celulares receptoras foram semeadas a 60% de confluência em placa de 6 poços por 24 h sob condições de cultura padrão a 37 °C. Meios padrão foram trocados para meios livres de soro fetal bovino (FBS−) antes da co-cultura com vesículas extracelulares. VEs marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) foram administradas às células em doses e pontos de tempo variados. Após co-cultura, células foram ressuspensas em 5% tripsina e concentradas a cerca de um milhão de células por 50 μL para citometria de fluxo. Trinta e sete graus Celsius é o padrão para experimentos de captura de VEs em nossos ensaios pois tem sido o padrão usado tanto para cultura celular quanto para plataformas de captura de VEs in vitro [31, 41-44].

Ensaios Inibitórios

Ensaio a Frio

VEs foram co-cultivadas com células receptoras a 4 °C para efetivamente "pausar" crescimento de cultura celular e inibir processos ativos [45]. Quatro graus Celsius inibe todas as formas ativas de captura de VEs [31, 41-44].

Ensaio Fixado

Células receptoras foram fixadas em 4% paraformaldeído por 30 min no gelo e lavadas com PBS imediatamente antes da co-cultura com VEs para inibir todas as formas ativas de captura de VEs.

Aquisição ImageStreamX

Aquisição foi realizada no Citômetro de Fluxo de Imagem ImageStreamX Mark II (Luminex Corporation, Seattle, Washington) usando software INSPIRE. Mínimo de 5000-10.000 eventos celulares foram adquiridos. Cada amostra biológica foi replicada em três poços de réplica técnica e individualmente adquirida no ISx. Imagens de campo claro foram coletadas no canal um e espalhamento lateral (785 nm) no canal seis. Proteína fluorescente verde (GFP) foi excitada por laser argônio 488 nm a 200 mW, e fluorescência foi coletada no canal dois (480-560 nm). Ampliação de 60× foi usada em toda amostra junto com taxa de aquisição baixa para alta sensibilidade.

Análise IDEAS

Análises de dados e imagem foram conduzidas usando software IDEAS (Luminex). A estratégia de gating é a seguinte:

1. Porta de foco foi determinada para eliminar células que não estavam no campo de foco usando valor Gradient RMS.

2. Células focadas foram selecionadas para eliminar dupletas e detritos usando área de campo claro vs. razão de aspecto de campo claro. Dados selecionados foram usados para criar histogramas e gerar referências estatísticas medindo intensidade de fluorescência (soma de todos os pixels em uma imagem), intensidade máxima de pixel (intensidade dos pixels mais brilhantes em uma imagem), junto com valores de contagem de pontos via algoritmos internos para cada amostra. Características de contagem de pontos foram geradas usando os Wizards IDEAS aplicáveis. Contagem de pontos, intensidade média, e razão de pixel máximo são calculados pela fórmula (Valor de saída com VEs/Valor de saída sem VEs).

Estatísticas

Todos os dados quantitativos foram analisados via GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) e feitos em triplicatas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Significância estatística foi determinada usando teste T não pareado ou análise de variância unidirecional (ANOVA) com teste post hoc de Tukey ou Dunnett comparado com controles quando apropriado. p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Propriedades das Vesículas Extracelulares HEK293T Marcadas com CD63-eGFP

Para gerar VEs marcadas fluorescentemente para analisar cinética e captura de vesículas extracelulares, células HEK293T foram transfectadas com plasmídeo carregando proteína de fusão CD63-eGFP. CD63 é uma proteína tetraspanina comumente enriquecida na membrana de exossomos tornando-a alvo ótimo para marcação fluorescente de VEs [46, 47]. Meios gastos foram coletados de cultura de células HEK293T, e VEs foram isoladas como relatado anteriormente [8]. Comparamos tamanho e distribuição de VEs isoladas de células HEK293T transfectadas com CD63-eGFP a células HEK293T não transfectadas. Controle e VEs HEK293T transfectadas com CD63-eGFP exibiram diâmetro mediano médio de 110,28 nm e 103,616 nm, respectivamente, como medido por software de nanotracking (Fig. 1a), que é consistente com tamanho relatado de VEs HEK293T [13, 15, 27, 48]. Nenhuma diferença significativa em diâmetro mediano (p = 0,1615) e distribuição (p = 0,4225) de VEs isoladas de células HEK293T não transfectadas e transfectadas com CD63-eGFP foram observadas. Marcação eGFP não alterou tamanho de VEs HEK293T (Fig. 1b).

Ensaio CFI foi conduzido para determinar se CD63-eGFP estava associado a VEs. Como controle fluorescente negativo, esferas de 1,34 μM em solução tampão (Fig. 1c, topo) não apresentaram fluorescência quando expostas ao comprimento de onda de excitação 488 nm, mas eram visíveis em campo claro (BF) e espalhamento lateral (SSC). VEs HEK293T não marcadas foram negativas em BF, GFP, e SSC, sugerindo tamanho pequeno abaixo do limiar BF e falta de fluorescência (Fig. 1d, meio). A ausência em BF significa tamanho de VE menor que 300 nm, o que sugere enxame mínimo de VEs. Por fim, VEs marcadas com CD63-eGFP são negativas em BF e positivas no canal GFP significando fluorescência positiva das VEs HEK293T (Fig. 1c, fundo). O sinal positivo no canal GFP pode ser indicativo de uma única VE ou grupo de VEs fluorescentes. Coletivamente, estes resultados mostram que VEs HEK293T isoladas têm tamanho padrão e perfis de marcadores proteicos consistentes com relatos anteriores de exossomos HEK293T, e marcação eGFP não altera tamanho de VEs HEK293T [5, 27].

Usando método comercial baseado em citometria de fluxo para medir marcadores comuns de VEs, determinamos o perfil geral de tetraspaninas de VEs [5]. VEs HEK293T isoladas de controle e células HEK293T expressando CD63-eGFP foram positivas para marcadores padrão de VEs incluindo CD9, CD63, e CD81 como medido em unidades de fluorescência relativa (Fig. 1d). Como relatado anteriormente, CD29 também foi encontrado na superfície de VEs HEK293T e VEs HEK293T transfectadas com CD63-eGFP [5]. Estes resultados indicam que os métodos de isolamento e marcação para VEs HEK293T resultam em VEs com marcadores comuns de exossomos HEK293T.

Captura Ativa de VEs HEK293T

Dois ensaios inibitórios de internalização foram realizados. VEs HEK293T foram co-cultivadas com células receptoras a 4 °C (frio) ou com células receptoras previamente fixadas com paraformaldeído (fixado). Os tratamentos diminuíram a presença de VEs marcadas com eGFP nas células receptoras comparado com células receptoras co-cultivadas com VEs sob condições fisiológicas (Fig. 2a). Ensaios inibitórios frio e fixado reduziram contagem de pontos (frio: p = 0,0127, fixado: p = 0,0078), intensidade (frio: p = 0,0105, fixado: p = 0,0374), e pixel máximo (frio: p = 0,0159, fixado: p = 0,0149) de sinais de fluorescência em células receptoras sem tratamentos, indicando inibição de captura de VEs. Estes resultados inferem que localização eGFP e aumentos em parâmetros de saída significam que VEs HEK293T são internalizadas para os seguintes ensaios de captura.

Captura de VEs HEK293T Dependente de Dose

Para desenvolver curva de dose padrão para plataforma CFI, VEs HEK293T foram co-cultivadas com células receptoras HEK293T em doses crescentes variando de 0 a 20.000 VEs por célula a 37 °C. Imagens CFI representativas exibiram aumento visual de fluorescência eGFP com doses elevadas de VEs (Fig. 3a). O menor número de VEs que pôde ser detectado foi 6000 VEs por célula HEK293T co-cultivada. Neste nível, contagem de pontos (p = 0,0012), intensidade (p = 0,0075), e pixel máximo (p = 0,0005) foram significativamente maiores que células receptoras sem VEs (Fig. 3b-d). Portanto, doses de 6000 VEs HEK293T é o limiar baixo para captura em nossa condição experimental. Similarmente, doses de 10.000 e 20.000 VEs tiveram contagem de pontos mais alta (10.000: p = 0,0009; 20.000: p < 0,0001), intensidade (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) e pixel máximo (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) comparado com células sem VEs. Comparando entre doses mais altas, não há diferenças significativas em contagem de pontos (6000 vs. 10.000: p = 0,999, 10.000 vs. 20.000: p = 0,0927), intensidade (6000 vs. 10.000: p = 0,8482, 10.000 vs. 20.000: p = 0,999), e contagem de pixel máximo (6000 vs. 10.000: p = 0,6056, 10.000 vs. 20.000: p = 0,5281) entre 6000 e 10.000, junto com 10.000 vs. 20.000. Similarmente, comparando entre 6000 e 20.000, não há diferença estatística em contagem de pontos (p = 0,0787) e intensidade (p = 0,8083). Há diferença significativa em pixel máximo entre 6000 e 20.000 (p = 0,0140). No geral, a curva de rendimento exibe dependência de dose significativa em todos os parâmetros (ponto, intensidade, pixel máximo, p < 0,0001). Estes resultados indicam que captura de VEs HEK293T é dependente de dose com limiar mínimo de 6000 VEs HEK293T por célula.

Captura Temporal de VEs HEK293T

Usando 6000 VEs por célula, VEs HEK293T foram co-cultivadas com células HEK293T por comprimentos de tempo crescentes antes da CFI, variando de 5 min a 24 h. Comprimento de exposição a VEs desempenhou papel chave na quantidade de fluorescência visível nas células receptoras, declinando após 12 h (Fig. 4a). Inicialmente, 30 min de co-cultura exibiu aumento significativo em contagem de pontos (p = 0,0081) sugerindo possível tendência para captura de VEs, mas não em outros parâmetros de captura (intensidade: p = 0,3073, pixel máximo: p = 0,0952) (Fig. 4b-d). A 2 h de co-cultura, contagem de pontos significativamente mais alta (p = 0,0028), intensidade (p = 0,0420), e pixel máximo (p = 0,0006) foram registrados comparado com células receptoras sem VEs. Novamente, a 4 h de co-cultura, todos os parâmetros foram maiores que controles (contagem de pontos: p = 0,0003, intensidade: p < 0,0001, pixel máximo: p < 0,0001). Intensidade e pixel máximo continuaram maiores que controles a 4, 12, e 24 h de co-cultura. Não houve diferenças em quaisquer parâmetros de captura entre 4 e 12 h de co-cultura (ponto: p = 0,999, intensidade: p = 0,5797; pixel máximo: p = 0,2489). No entanto, intensidade (p = 0,0191), e pixel máximo (p = 0,0027) diminuíram entre 12 e 24 h de co-cultura (Fig. 4c,d). Similar à curva de dose, captura de VEs HEK293T é dependente de tempo com captura consistente a 4 h de incubação e pico a 12 h. Coletivamente, dose de 6000 VEs por célula semeada e co-cultura de 4 h foi padronizada para os seguintes ensaios de captura.

Captura Comparativa de VEs HEK293T por Múltiplas Linhagens Celulares

A hipótese de que captura de VEs é processo seletivo onde VEs são preferencialmente capturadas por células de sua própria origem foi testada usando CFI. VEs HEK293T foram co-cultivadas com células HEK293T ou outras linhagens celulares: epiteliais (células hepáticas C3A), endoteliais (células endoteliais de veia umbilical humana), e neurais (células glioblastoma SH-SY5Y). Fluorescência eGFP é mais abundante em células HEK293T comparado com outros tipos celulares (Fig. 5a). Comparado com C3A e HUVECs, células HEK293T tiveram intensidade de fluorescência significativamente mais alta (C3A: p = 0,0321; HUVEC: p = 0,0055) (Fig. 5c), quando co-cultivadas com VEs HEK293T. Adicionalmente, células HEK293T tiveram pixel máximo mais alto (C3A: p = 0,0221; HUVEC: p = 0,0079; SH-SY5Y: p = 0,0486) (Fig. 5d) comparado com todas as outras linhagens celulares receptoras (Fig. 5b). Quanto à intensidade, células SH-SY5Y foram significativamente mais altas que HUVECs quando co-cultivadas com VEs HEK293T (p = 0,0304). Estes resultados suportam captura seletiva de VEs HEK293T por células HEK293T comparado com outras linhagens celulares in vitro.

Status de Diferenciação de Células Neurais e Internalização de VEs HEK293T

Como VEs têm sido implicadas para propósitos terapêuticos e de entrega visando doenças neurais, células-tronco neurais humanas (hNSCs) e neurônios humanos maduros foram usadas como linhagens celulares receptoras em nosso sistema para examinar se o status de diferenciação da célula receptora desempenha papel na captura seletiva de VEs. Imagens representativas de CFI exibiram evidência visual de captura em ambos tipos celulares, mas com maior localização eGFP em hNSCs (Fig. 6a). hNSCs co-cultivadas com VEs HEK293T têm contagem de pontos mais alta (p = 0,0082) e pixel máximo (p = 0,0083) comparado a neurônios maduros. Juntos, estes resultados sugerem que status de diferenciação de células neurais afeta captura de VEs HEK293T.

Discussão

Processo de Padronização de Captura de VEs In Vitro

Um grupo de especialistas internacionais em VEs enfatizou necessidade de determinar efetivamente a dose mínima efetiva de VEs para ensaios de captura, e aqui desenvolvemos sistema que pode ser efetivamente adotado pelo campo [26]. Há desafios ao analisar captura de VEs. Por exemplo, como nós e outros observamos, resultados podem diferir se dose de VEs e tempo de exposição são alterados [26]. Abordamos dose e concentração de VEs HEK293T como variável cinética. Também, dose mínima efetiva in vitro pode prever mais uniformemente biodistribuição in vivo de VEs e ser usada para desenvolver parâmetros de dosagem in vivo mais consistentes para terapêuticos e entrega de VEs. Em estudo de biodistribuição in vivo de VEs em camundongo, aumento de dose de VEs HEK293T resultou em mudança da distribuição relativa de VEs em órgãos [27]. Similar a achados em estudo prévio in vitro usando VEs de câncer de bexiga [39], VEs HEK293T exibiram forte dependência de dose com dose mínima efetiva a 6000 VEs em nosso estudo. Somos os primeiros a usar partículas por célula como medida de dose sensível in vitro, que correlaciona melhor com modelos in vivo usando partículas por peso corporal. Nossos dados também indicaram limite de saturação de dose após 6000 VEs, potencialmente informando futuros estudos de variação de dose in vivo indicando que doses mais altas podem ter benefícios limitados.