Cinética e especificidade da captação de vesículas extracelulares HEK293T usando citometria de fluxo de imagem

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à bicamada lipídica nanométrica que são secretadas naturalmente pela maioria dos tipos de células como um mecanismo de comunicação para entregar proteínas, lipídios e material genético. Apesar do potencial terapêutico dos EVs, há informações limitadas sobre a cinética e a especificidade de captação do EV. Aqui, otimizamos uma plataforma baseada em citometria de fluxo de imagem (IFC) para avaliar quantitativamente os efeitos da dose, do tempo e da especificidade da célula receptora na internalização EV de células renais embrionárias humanas (HEK293T) de uma maneira de alto rendimento. Descobrimos que a captação de HEK293T EV é um processo ativo dependente da dose e do tempo. Além disso, a seletividade de captação EV foi quantificada in vitro , e descobrimos que os EVs HEK293T foram internalizados em quantidades maiores por células da mesma origem. Por último, as células-tronco neurais internalizaram significativamente mais EVs HEK293T em relação aos neurônios maduros, sugerindo que as células-tronco ou progenitoras, que são mais metabolicamente ativas do que células diferenciadas terminalmente, podem ter taxas mais altas de internalização EVs ativas. A caracterização da captação de EV, especialmente a especificidade, a dependência de dose e tempo e os ensaios cinéticos ajudarão a informar e desenvolver uma terapêutica baseada em EV direcionada e eficiente.

Introdução

A pesquisa de vesículas extracelulares é um campo em expansão devido à utilidade terapêutica e diagnóstica das vesículas extracelulares (EVs) naturais e projetadas. EVs variam de 50 a 1000 nm de diâmetro, são produzidos a partir de todos os tipos de células e são enriquecidos com proteínas transmembrana, incluindo CD63, CD81 e CD9; lipídios; proteínas; e DNA, RNA, mRNA e microRNA [1,2,3,4,5]. O conteúdo EV, notavelmente mRNA e miRNA ativos, foi implicado na modulação das células receptoras por meio da tradução de novo e da regulação pós-tradução das células-alvo [4, 6]. Compreender e, em seguida, modificar a captação cinética de EV e internalização acabará por levar à entrega otimizada de conteúdo EV para células-alvo com concentrações altas o suficiente para ter um benefício terapêutico.

Antes considerados "o lixo das células", os EVs têm sido aproveitados como uma alternativa às terapias celulares devido a muitas vantagens, incluindo sua biocompatibilidade, baixa imunogenicidade e toxicidade, capacidade de dosagem repetida, várias vias de administração e potencial para entregar medicamentos e terapias genéticas [3]. Nosso grupo relatou anteriormente efeitos positivos de EVs derivados de células-tronco neurais em acidente vascular cerebral e lesão cerebral traumática. Em ambos os modelos de acidente vascular cerebral murino e porcino, EVs melhorou o tecido e a recuperação funcional após o acidente vascular cerebral [3, 7, 8]. Também demonstramos que os EVs são neuroprotetores com benefícios funcionais em um modelo de lesão cerebral traumática em roedores [9]. Apesar desses efeitos observados e do potencial futuro de EVs, há pouco entendimento da especificidade e cinética de captação de EV, o que pode dificultar a tradução da terapêutica EV na clínica.

EVs também foram projetados como vetores de transferência e carregados com agentes terapêuticos, incluindo terapias gênicas e compostos químicos como uma alternativa para a terapêutica de nanopartículas e vetores de entrega [4, 10,11,12]. As células HEK293T têm sido amplamente utilizadas como células produtoras de EV devido à sua rápida proliferação inerente, alto rendimento de EV e facilidade de manipulação genética [13,14,15,16,17]. HEK293T EVs entregou terapias gênicas incluindo terapia de miRNA para câncer de mama [12] e tem sido usado para entregar quimioterápicos e construções de proteínas terapêuticas em um modelo de schwannoma [18]. Semelhante aos estudos de nanopartículas sintéticas que avaliam a citotoxicidade in vitro, os ensaios de toxicidade do MTT exibiram baixa toxicidade de HEK293T EVs não carregados e subsequente alta citotoxicidade quando carregados com quimioterápicos [10, 18,19,20,21]. Devido a esta utilização abundante de HEK293T EVs, analisamos sua cinética e especificidade neste estudo.

A absorção seletiva ou específica se refere à capacidade natural de um EV de atingir tipos de células específicos. Há evidências abundantes sobre os mecanismos de internalização EV com pouco consenso sobre a especificidade de captação [22]. Freqüentemente, os EVs exibem captação seletiva por células receptoras semelhantes às de suas células-mãe, as células epiteliais internalizam mais EVs derivados do epitélio do que outras células receptoras [23, 24] e as células-tronco mesenquimais (MSC) internalizam uma quantidade significativamente maior de EVs derivados de MSC em comparação com outras linhas celulares in vitro [24]. No entanto, outros estudos descobriram que os EVs são internalizados por todos os tipos de células e apresentam uma biodistribuição não seletiva quando administrados in vivo [22, 25]. Apesar do imenso potencial terapêutico e interesse dos EVs, há uma deficiência no entendimento da especificidade de captação do EV. Ao compreender melhor a especificidade de captação de EV, podemos escolher apropriadamente as células produtoras de EV que são internalizadas seletivamente pelas células receptoras de interesse e, assim, melhorar a aplicabilidade terapêutica dos EVs.

Uma razão potencial para resultados conflitantes de captação de EV é a falta de padronização nas plataformas de medição, incluindo análises de efeitos de dose e tempo. Recentemente, um grupo de especialistas da International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) divulgou um documento de posicionamento enfatizando a necessidade de análise de dose e tempo, entre outros fatores de confusão na captação de EV [26]. O grupo afirmou que “uma dose não serve para todos” e que a dose pode afetar a captação EV ou seletividade [26]. Elevar as doses de HEK293T EVs altera o padrão de biodistribuição in vivo [27]. Os perfis de captação de EVs derivados do soro foram significativamente alterados pela dose [28]. Além disso, os tempos de co-incubação de EVs com células receptoras variando de 15 min a 48 h [24, 29,30,31,32,33] podem alterar as medições de captação. Se adotado por pesquisadores de EV e pela indústria, um processo quantificável e confiável para determinar a dose padrão e curvas de tempo para ajudar a identificar a dose mínima eficaz pode levar a estudos mais robustos e úteis.

Anteriormente, os pesquisadores usaram a citometria de fluxo padrão junto com várias formas de microscopia de baixo rendimento, incluindo microscopia confocal para analisar a captação EV [32,33,34]. No entanto, essas tecnologias têm várias limitações. A microscopia confocal pode ser demorada e subjetiva. Os citômetros de fluxo tradicionais foram projetados para medir partículas biológicas na faixa celular, não podem diferenciar enxame de EV ou coincidência e aumentaram o ruído devido ao disparo [35,36,37,38]. Conforme mencionado pelo grupo ISEV, há uma consciência crescente das limitações físicas da citometria de fluxo tradicional e destaque a demanda por citometria de fluxo especializada com limites de detecção na faixa de 100 nm [26, 38]. A citometria de fluxo de imagem (IFC) combina a natureza quantitativa de alto rendimento da citometria de fluxo com a tecnologia de imagem de fluorescência que pode resolver partículas fluorescentes inerentemente pequenas, até 100 nm de diâmetro [38]. Capacidades IFC levam a baixo ruído / fundo, diminuição da enxameação e dispositivos acoplados carregados para clareza de imagem [37, 39]. Essas características auxiliam no desenvolvimento de uma estratégia de gating para caracterizar EVs e captação com confirmação visual em uma maneira de alto rendimento como uma plataforma de captação EV precisa e quantificável [36, 37, 40].

Neste estudo, células HEK293T que expressam CD63-eGFP foram utilizadas como a linha de células doadoras para a produção de EV devido ao seu uso comum no desenvolvimento terapêutico. Os EVs fluorescentes isolados foram co-cultivados com linhas de células receptoras, incluindo células neurais e endoteliais. A captação foi quantificada usando IFC, resultando em uma plataforma padronizada para medir a captação cinética importante de EV e recursos de internalização para sistemas de células in vitro. Além disso, fornecemos dados sobre um processo para quantificar a absorção de EV fluorescente em diferentes condições e linhas de células em cultura para elucidar a absorção seletiva de EV.

Materiais e métodos

Cultura de células

Células de rim embrionário humano (HEK293T) foram adquiridas da ATCC e cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina. Células-tronco neurais humanas (hNSC), células neurais SH-SY5Y, células epiteliais do fígado C3A, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e neurônios foram todos cultivados em condições padrão a 37 ° C, 5% CO ₂ antes dos ensaios de captação de vesículas extracelulares.

Marcação EV e isolamento

O DNA do plasmídeo CD63-eGFP foi obtido da Addgene (# 62964). CD63-pEGFP C2 foi um presente de Paul Luzio (Addgene plasmid # 62964). As células HEK293T foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 10 cm, e 10 μg de DNA de plasmídeo foram transfectados usando Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas após a transfecção, os meios foram mudados para meios HEK293T padrão desprovidos de soro fetal bovino e recolhidos durante 3 dias consecutivos. Conforme descrito anteriormente [3], os meios HEK293T foram filtrados através de um filtro de 0,22 μm e enriquecidos por ultrafiltração usando unidades de filtro centrífugo Amicon de celulose regenerada de 100 kDa e lavados duas vezes com PBS ++. EVs foram concentrados para 1 mL, e as distribuições de concentração e tamanho foram medidas no Nanosight NS300 pelo protocolo do fabricante (Malvern, Reino Unido). Os EVs foram isolados de diferentes recipientes de cultura HEK293T, cada recipiente considerado réplicas biológicas separadas, com três réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica (mínimo de nove amostras no total para cada condição).

Ensaios de absorção

As linhas de células receptoras foram semeadas a 60% de confluência em uma placa de 6 poços por 24 h sob condições de cultura padrão a 37 ° C. Os meios padrão foram alterados para meios livres de soro fetal bovino (FBS-) antes da co-cultura de vesículas extracelulares. EVs marcados com proteína fluorescente verde (GFP) foram administrados às células em doses e pontos de tempo variáveis. Após a co-cultura, as células foram ressuspensas em tripsina a 5% e concentradas em cerca de um milhão de células por 50 μL para citometria de fluxo. Trinta e sete graus Celsius é o padrão para experimentos de captação de EV em nossos ensaios, pois tem sido o padrão usado para cultura de células e plataformas de captação de EV in vitro [31, 41,42,43,44].

Ensaios de inibição

Ensaio frio

EVs foram co-cultivados com células receptoras a 4 ° C para efetivamente "pausar" o crescimento da cultura de células e inibir processos ativos [45]. Quatro graus Celsius inibe todas as formas ativas de captação de EV [31, 41,42,43,44].

Ensaio fixo

As células receptoras foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 30 min em gelo e lavadas com PBS imediatamente antes da co-cultura com EVs para inibir todas as formas ativas de absorção EV.

Aquisição ImageStreamX

A aquisição foi realizada no ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) usando o software INSPIRE. Um mínimo de 5.000 a 10.000 eventos de células foram adquiridos. Cada amostra biológica foi replicada em três poços replicados técnicos e adquirida individualmente no ISx. Imagens de campo claro foram coletadas no canal um e dispersão lateral (785 nm) no canal seis. A proteína fluorescente verde (GFP) foi estimulada por laser de argônio 488 nm a 200 mW, e a fluorescência foi coletada no canal dois (480-560 nm). Uma ampliação de 60 × foi usada em cada amostra junto com uma baixa taxa de aquisição para alta sensibilidade.

Análise IDEAS

As análises de dados e imagens foram realizadas no software IDEAS (Luminex). A estratégia de gating é a seguinte:

1. 1.
   A porta de foco foi determinada para eliminar células que não estavam no campo de foco usando o valor RMS do gradiente.
   
2. 2.
   As células focalizadas foram bloqueadas para eliminar dupletos e detritos usando campo claro de área vs. campo claro de proporção de aspecto. Dados bloqueados foram usados ​​para criar histogramas e gerar referências estatísticas medindo intensidade de fluorescência (soma de todos os pixels em uma imagem), intensidade máxima de pixel (intensidade dos pixels mais brilhantes em uma imagem), juntamente com valores de contagem de pontos por meio de algoritmos internos para cada amostra. Os recursos de contagem de pontos foram gerados usando os assistentes IDEAS aplicáveis. Contagem de pontos, intensidade média e proporção máxima de pixels são calculados pela fórmula (valor de saída com EVs / valor de saída sem EVs).
   

Estatísticas

Todos os dados quantitativos foram analisados ​​via GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Califórnia) e feitos em triplicado. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). A significância estatística foi determinada usando um T não pareado teste ou uma análise de variância unilateral (ANOVA) com post hoc de comparação múltipla de Tukey ou Dunnett em comparação com controles quando apropriado. p <0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Propriedades da vesícula extracelular HEK293T marcada com CD63-eGFP

Para gerar EVs marcados com fluorescência para analisar a cinética e a captação de vesículas extracelulares, as células HEK293T foram transfectadas com um plasmídeo carregando a proteína de fusão CD63-eGFP. CD63 é uma proteína tetraspanina comumente enriquecida na membrana de exossomos, tornando-a um alvo ideal para marcação fluorescente EV [46, 47]. A mídia gasta foi coletada da cultura de células HEK293T e os EVs foram isolados como relatado anteriormente [8]. Comparamos o tamanho e a distribuição de EVs isolados de células HEK293T transfectadas com CD63-eGFP com células HEK293T não transfectadas. O controle e os EVs HEK293T transfectados com CD63-eGFP exibiram um diâmetro médio médio de 110,28 nm e 103,616 nm, respectivamente, conforme medido pelo software de nanotracking (Fig. 1a), que é consistente com o tamanho relatado dos EVs HEK293T [13, 15, 27 , 48]. Sem diferenças significativas no diâmetro médio ( p =0,1615) e distribuição ( p =0,4225) de EVs isolados de células HEK293T não transfectadas e transfectadas com CD63-eGFP. A rotulagem eGFP não alterou o tamanho dos EVs HEK293T (Fig. 1b).

Caracterização de EVs HEK293T marcados com CD63-eGFP. EVs foram isolados de HEK293T (controle) e HEK293T expressando meio de cultura de células CD63-eGFP. a Distribuição de tamanho EV representativa registrada por meio de software de nanotracking. b Quantificação da distribuição do diâmetro médio de EVs HEK293T transfectados vs. não transfectados. c Imagens IFC de grânulos de controle negativo, EVs de controle HEK293T e EVs marcados com CD63-eGFP. BF significa campo claro, GFP significa proteína fluorescente verde (laser de excitação de 488 nm) e SSC significa dispersão lateral. EGFP positivo no canal GFP significa EVs HEK293T fluorescentes. d Expressão de marcador de superfície MACSPlex baseada em citometria de fluxo de EVs HEK293T não transfectados e EVs HEK293T CD63-eGFP. Ambas as fontes EV são positivas para CD29, CD9, CD63 e CD81, conforme medido em fluorescência relativa (denotado por X para positivo). As barras representam a média ± SEM; N =3; teste T não pareado. n.s. significa p > 0,05

O ensaio IFC foi conduzido para determinar se o CD63-eGFP estava associado a EVs. Como um controle negativo fluorescente, os grânulos de 1,34 μM na solução tampão (Fig. 1 c, topo) não tinham fluorescência quando expostos ao comprimento de onda de excitação de 488 nm, mas eram visíveis em campo claro (BF) e dispersão lateral (SSC). EVs HEK293T não marcados foram negativos no BF, GFP e SSC, sugerindo um tamanho pequeno abaixo do limiar de BF e falta de fluorescência (Fig. 1d, meio). A ausência em BF significa um tamanho EV menor que 300 nm, o que sugere enxame mínimo de EVs. Por último, os EVs marcados com CD63-eGFP são negativos em BF e positivos no canal GFP, o que significa fluorescência positiva dos EVs HEK293T (Fig. 1c, parte inferior). O sinal positivo no canal GFP pode ser indicativo de um único EV ou um grupo de EVs fluorescentes. Coletivamente, esses resultados mostram que os HEK293T EVs isolados têm tamanho padrão e perfis de marcadores de proteína consistentes com relatórios anteriores de exossomos HEK293T, e a marcação de eGFP não altera o tamanho dos EVs HEK293T [5, 27].

Usando um método baseado em citometria de fluxo disponível comercialmente para medir marcadores EV comuns, determinamos o perfil geral de tetraspanina EV [5]. EVs HEK293T isolados de células HEK293T de controle e que expressam CD63-eGFP foram positivos para marcadores EV padrão, incluindo CD9, CD63 e CD81, conforme medido em unidades de fluorescência relativa (Fig. 1d). Conforme relatado anteriormente, o CD29 também foi encontrado na superfície de EVs HEK293T e EVs HEK293T transfectados com CD63-eGFP [5]. Estes resultados indicam que os métodos de isolamento e marcação para HEK293T EV resultam em EVs com marcadores de exossomo HEK293T comuns.

Captação ativa de EVs HEK293T

Dois ensaios de internalização inibitória foram realizados. HEK293T EVs foram co-cultivados com células receptoras a 4 ° C (frio) ou com células receptoras previamente fixadas com paraformaldeído (fixadas). Os tratamentos diminuíram a presença de EVs marcados com eGFP nas células receptoras em comparação com células receptoras co-cultivadas com EVs em condições fisiológicas (Fig. 2a). Ensaios inibitórios fixos e frios reduziram a contagem de manchas (frio: p =0,0127, corrigido: p =0,0078), intensidade (frio: p =0,0105, corrigido: p =0,0374) e pixel máximo (frio: p =0,0159, corrigido: p =0,0149) de sinais de fluorescência em células receptoras sem tratamentos, indicando inibição de captação de EV. Estes resultados inferem que a localização eGFP e os aumentos nos parâmetros de saída significam que HEK293T EVs são internalizados para os seguintes ensaios de absorção.

Ensaios de inibição de internalização EV. As células HEK293T foram co-cultivadas com HEK293T EVs sob várias condições. Controle (37 ° C) refere-se à co-cultura em ambiente fisiológico de 37 ° C. Frio refere-se à co-cultura em um ambiente de 4 ° C. A inibição fixa refere-se a um ensaio em que as células receptoras foram fixadas em PFA antes da co-cultura. a Imagens IFC representativas de células receptoras. A coluna 1, BF, significa campo claro. A coluna 2, GFP, significa proteína fluorescente verde (laser de excitação de 488 nm) e a coluna 3 significa uma fusão de BF e GFP. O controle mostra GFP positivo que representa a internalização EV. b - d Quantificação de ensaios de inibição em comparação com controles via contagem de pontos, intensidade média de fluorescência e pixel máximo. As barras representam a média ± SEM; N =3; ANOVA unilateral seguida do teste post hoc de Tukey em comparação com o controle. * p <0,05; *** p <0,01

Captação EV HEK293T dependente da dose

Para desenvolver uma curva de dose padrão para a plataforma IFC, HEK293T EVs foram co-cultivados com células receptoras HEK293T em doses crescentes que variam de 0 a 20.000 EVs por célula a 37 ° C. As imagens IFC representativas exibiram um aumento visual da fluorescência eGFP com doses elevadas de EVs (Fig. 3a). O menor número de EVs que pode ser detectado foi de 6.000 EVs por célula HEK293T co-cultivada. Neste nível, contagem de pontos ( p =0,0012), intensidade ( p =0,0075) e pixel máximo ( p =0,0005) as medições foram significativamente maiores do que as células receptoras sem EVs (Fig. 3b – d). Portanto, as doses de 6000 HEK293T EVs são o limite inferior para a captação em nossa condição experimental. Da mesma forma, doses de 10.000 e 20.000 EVs tiveram maior contagem de pontos (10.000: p =0,0009; 20.000: p <0,0001), intensidade (10.000: p <0,0001; 20.000: p <0,0001) e pixel máximo (10.000: p <0,0001; 20.000: p <0,0001) em comparação com células sem EVs. Comparando entre as doses mais altas, não há diferenças significativas na contagem de pontos (6.000 vs. 10.000: p =0,999, 10.000 vs. 20.000: p =0,0927), intensidade (6.000 vs. 10.000: p =0,8482, 10.000 vs. 20.000: p =0,999) e contagem máxima de pixels (6.000 x 10.000: p =0,6056, 10.000 vs. 20.000: p =0,5281) entre 6.000 e 10.000, junto com 10.000 contra 20.000. Da mesma forma, comparando entre 6.000 e 20.000, não há diferença estatística na contagem de pontos ( p =0,0787) e intensidade ( p =0,8083). Há uma diferença significativa no pixel máximo entre 6.000 e 20.000 ( p =0,0140). No geral, a curva de rendimento exibe uma dependência significativa da dose em todos os parâmetros (local, intensidade, pixel máximo, p <0,0001). Estes resultados indicam que a captação de HEK293T EV é dependente da dose com um limite mínimo de 6.000 HEK293T EVs por célula.

A captação de HEK293T EV tem um efeito de dose com um limite mínimo de 6.000 EVs. As células HEK293T foram co-cultivadas com HEK293T EVS em doses crescentes de 0 a 20.000 / célula. a Imagens IFC representativas de células receptoras com as respectivas doses EV. A localização de GFP significa absorção de HEK293T EV. b - d Quantificação de ensaios de dose em comparação com controles e cada grupo por meio de contagem de pontos, intensidade média de fluorescência e razões máximas de pixel. As barras representam a média ± SEM; N =3; ANOVA unilateral seguida do teste post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0,01

HEK293T EV Temporal Uptake

Usando 6.000 EVs por célula, HEK293T EVs foram co-cultivadas com células HEK293T para aumentar os períodos de tempo antes da IFC, variando de 5 min a 24 h. O comprimento da exposição EV desempenhou um papel fundamental na quantidade de fluorescência visível nas células receptoras, diminuindo após 12 h (Fig. 4a). Inicialmente, 30 minutos de co-cultura exibiram um aumento significativo na contagem de manchas ( p =0,0081) sugerindo uma possível tendência de captação EV, mas não em outros parâmetros de captação (intensidade: p =0,3073, pixel máximo: p =0,0952) (Fig. 4b – d). Em 2 h de co-cultura, contagem de pontos significativamente maior ( p =0,0028), intensidade ( p =0,0420), e pixel máximo ( p =0,0006) foram registrados em comparação com as células receptoras sem EVs. Novamente, às 4 horas de co-cultura, todos os parâmetros foram maiores do que os controles (contagem de pontos: p =0,0003, intensidade: p <0,0001, pixel máximo: p <0,0001). A intensidade e o pixel máximo continuaram a ser maiores do que os controles em 4, 12 e 24 h de co-cultura. Não houve diferenças em quaisquer parâmetros de absorção entre 4 e 12 h de co-cultura (local: p =0,999, intensidade: p =0,5797; pixel máximo: p =0,2489). No entanto, intensidade ( p =0,0191), e pixel máximo ( p =0,027) diminuiu entre 12 e 24 h de co-cultura (Fig. 4 c, d). Semelhante à curva de dose, a captação de HEK293T EV é dependente do tempo com a captação de EV consistente em 4 horas de incubação e um pico em 12 horas. Coletivamente, uma dose de 6.000 EVs por célula semeada e uma co-cultura de 4 h foi padronizada para os seguintes ensaios de absorção.

A captação de HEK293T EV depende do tempo. As células HEK293T foram co-cultivadas com 6000 HEK293T EVs / célula por períodos crescentes de tempo. a Imagens IFC representativas de células receptoras, respectivamente. A localização de GFP significa aumento da captação de HEK293T EV. b - d Quantificação de ensaios de curso de tempo em comparação com controles e cada grupo por meio de contagem de pontos, intensidade média de fluorescência e razões máximas de pixels. As barras representam a média ± SEM; N =3; ANOVA unilateral seguida do teste post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0,01

Captação comparativa de HEK293T EVs por múltiplas linhas celulares

A hipótese de que a captação de EV é um processo seletivo em que os EVs são preferencialmente captados por células de sua própria origem foi testada usando IFC. Os EVs HEK293T foram co-cultivados com células HEK293T ou outras linhas celulares:epiteliais (células do fígado C3A), endoteliais (células endoteliais da veia umbilical humana) e neurais (células de glioblastoma SH-SY5Y). A fluorescência do eGFP é mais abundante nas células HEK293T em comparação com os outros tipos de células (Fig. 5a). Em comparação com C3A e HUVECs, as células HEK293T apresentaram intensidade de fluorescência significativamente maior (C3A: p =0,0321; HUVEC: p =0,0055) (Fig. 5c), quando co-cultivado com HEK293T EVs. Além disso, as células HEK293T tinham pixels máximos mais altos (C3A: p =0,0221; HUVEC: p =0,0079; SH-SY5Y: p =0,0486) (Fig. 5d) em comparação com todas as outras linhas de células receptoras (Fig. 5b). Em relação à intensidade, as células SH-SY5Y foram significativamente maiores do que HUVECs quando co-cultivadas com HEK293T EVs ( p =0,0304). Estes resultados suportam a captação seletiva de HEK293T EV por células HEK293T em comparação com outras linhas de células in vitro.

HEK293T EVs exibe preferência de absorção para células HEK293T. Os EVs HEK293T foram co-cultivados com células HEK293T, células epiteliais C3A, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e células neurais SY5Y. a Imagens IFC representativas de células receptoras co-cultivadas com HEK293T EVs. b - d Quantificação de ensaios de preferência de absorção EV em comparação com os controles e entre si por meio de contagem de pontos, intensidade média de fluorescência e razões máximas de pixel. As barras representam a média ± SEM; N =3; ANOVA unilateral seguida do teste post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0,01

Status de diferenciação de células neurais e internalização HEK293T EV

Uma vez que EVs foram implicados para fins terapêuticos e de entrega visando doenças neurais, células-tronco neurais humanas (hNSCs) e neurônios humanos maduros foram usados ​​como linhas de células receptoras em nosso sistema para examinar se o status de diferenciação da célula receptora desempenha um papel na absorção seletiva de EVs. Imagens representativas de IFC exibiram evidência visual de absorção em ambos os tipos de células, mas com a maior localização de eGFP em hNSCs (Fig. 6a). hNSCs co-cultivados com HEK293T EVs têm maior contagem de pontos ( p =0,0082) e pixel máximo ( p =0,0083) em comparação com neurônios maduros. Juntos, esses resultados sugerem que o status de diferenciação das células neurais afeta a captação de HEK293T EVs.

O status de diferenciação neural afeta a captação de HEK293T EV. HEK293T EVs foram co-cultivados com neurônios humanos maduros e células-tronco neurais humanas. a Imagens IFC representativas de células receptoras co-cultivadas com HEK293T EVs. b - d Quantificação de ensaios de preferência de absorção EV em comparação com os controles e entre si por meio de contagem de pontos, intensidade média de fluorescência e razões máximas de pixel. As barras representam a média ± SEM; N =3; não pareado T teste. * p <0,05; *** p <0,01 em comparação com 0 EVs (controle)

Discussão

Processo de padronização de captação EV in vitro

Um grupo de especialistas internacionais em EVs enfatizou a necessidade de determinar com eficácia a dose mínima efetiva de EVs para ensaios de captação, e aqui desenvolvemos um sistema que pode ser efetivamente adotado em campo [26]. Existem desafios ao analisar a captação de EV. Por exemplo, como nós e outros observamos, os resultados podem diferir se a dose EV e o tempo de exposição forem alterados [26]. Abordamos a dose e a concentração de HEK293T EV como uma variável cinética. Além disso, uma dose eficaz mínima in vitro pode prever mais uniformemente a biodistribuição in vivo de EVs e ser usada para desenvolver parâmetros de dosagem in vivo mais consistentes para a terapêutica e distribuição de EVs. Em um estudo de biodistribuição EV de camundongo in vivo, o aumento da dose de EVs HEK293T resultou em uma mudança na distribuição EV relativa nos órgãos [27]. Semelhante aos achados de um estudo in vitro anterior usando EVs de câncer de bexiga [39], os EVs HEK293T exibiram uma forte dependência da dose com uma dose eficaz mínima de 6.000 EVs em nosso estudo. Somos os primeiros a usar partículas por célula como uma medição de dose sensível in vitro, que se correlaciona melhor com modelos in vivo usando partículas por peso corporal. Nossos dados também indicaram um limite de saturação de dose após 6.000 EVs, potencialmente informando futuros estudos de variação de dose in vivo, indicando que doses mais altas podem ter benefícios limitados.

Outra variável de confusão da medição da captação de EV são os efeitos temporais potenciais na captação de EV. Em nosso sistema, encontramos uma forte dependência do tempo com captação tão cedo quanto 2 h com uma diminuição potencial entre 12 e 24 h. Semelhante aos nossos achados, a dependência do tempo foi relatada em poucos estudos usando células de câncer de bexiga, células tumorais e outros com captação desde 15 min até 24 h [29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. Como visto com EVs HEK293T, os valores mais baixos em 24 h de co-cultura podem ser resultado da divisão celular ou reciclagem / degradação de EVs internalizados em pontos de tempo iniciais [50]. Especificamente, uma vez que foi demonstrado que os EVs são internalizados e depois quebrados ou internalizados e então liberados após 24 h, incubações mais longas podem gerar leituras de internalização imprecisas [31, 50]. Nosso estudo é o primeiro a usar IFC para fornecer evidências visuais e quantitativas de uma curva de rendimento dependente do tempo na captação de HEK293T EV.

Como o documento de posição ISEV sugere, a escolha de um rótulo EV pode afetar a absorção, necessitando de técnicas menos disruptivas, como os métodos de marcação GFP usados ​​em nosso estudo. Especificamente, 72% dos pesquisadores participantes de uma pesquisa afirmam que os experimentos com corantes lipídicos não são confiáveis, a menos que controles adequados sejam usados ​​[26]. Os corantes EV não se correlacionam de forma confiável com o conteúdo EV pequeno e podem até aumentar o tamanho da vesícula. A contaminação de lipoproteínas marcadas erroneamente e conteúdo de proteína e agregação de corante contribuíram para falsos positivos [51, 52]. Portanto, fundimos o CD63 com um eGFP para rotular os EVs HEK293T. Semelhante a outros relatórios de marcação de proteína, HEK293T EVs foram GFP positivos sem diferenças observadas no diâmetro e manteve a composição de proteína de superfície EV padrão [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

Conclusões

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados gerados e / ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

EV:

Extracellular vesicles

HEK293T:

Human embryonic kidney cell line

IFC:

Imaging flow cytometry

hNSC:

Human neural stem cell

GFP:

Green fluorescent protein

BF:

Campo brilhante

SSC:

Side scatter

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles

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