Novel Biocompatible Au Nanostars @ PEG Nanopartículas para imagens In Vivo CT e propriedades de depuração renal

Resumo

Nanossondas estão se tornando rapidamente ferramentas potencialmente transformadoras no diagnóstico de doenças para uma ampla gama de imagens de tomografia computadorizada (TC) in vivo. Comparado com agentes de contraste convencionais em escala molecular, nanopartículas (NPs) prometem habilidades aprimoradas para detecção in vivo. Neste estudo, novas nanopartículas de Au funcionalizadas com polietilenoglicol (PEG) com forma de estrela (AuNS @ PEG) com forte coeficiente de absorção de massa de raios-X foram sintetizadas como agentes de contraste para imagens de TC. Os resultados experimentais revelaram que as nanopartículas AuNS @ PEG são bem construídas com tamanhos ultra-pequenos, metabolização efetiva, alto valor de tomografia computadorizada e excelente biocompatibilidade. A imagem in vivo também mostrou que as nanopartículas de AuNS @ PEG obtidas podem ser eficientemente usadas na imagem aprimorada por CT. Portanto, as nanopartículas de AuNS @ PEG do agente de contraste sintetizado como um grande candidato potencial podem ser amplamente utilizadas para imagens de TC.

Histórico

A última década testemunhou o rápido desenvolvimento de nanopartículas em nanobiotecnologia, devido aos seus diversos materiais constituintes e grande área de superfície [1, 2]. Dentre essas nanopartículas, o Au tem ampla aplicação como sua excelente biocompatibilidade e afinidade no campo biomédico [3, 4]. Nos últimos anos, nanopartículas de Au são amplamente utilizadas em imagens de TC, devido ao seu maior número atômico, metal precioso e inércia química, além de não serem fáceis de proteínas na reação corporal [5,6,7].

A imagem de TC é uma ferramenta de diagnóstico clínico não invasivo através de diferentes densidades e espessuras de diferentes tecidos ou órgãos da atenuação do gerador de raios-X em vários graus, para formar diferentes tecidos ou órgãos de distribuição de contraste de imagem em escala de cinza e, portanto, para a posição relativa de a lesão e o tamanho da mudança de forma [8,9,10,11]. Atualmente, a aplicação clínica de agentes de contraste CT contém principalmente composto de iodo, que é uma pequena molécula, incluindo iodo orgânico e compostos de moléculas pequenas de iodo inorgânico, como diaztrizoato (ácido diatrizoico (DTA)) e iohexol (Omnipaque) [12]. No entanto, o pequeno agente de contraste à base de iodo molecular, removendo os efeitos dos compostos contendo iodo, precisa apenas de um tempo de imagem muito curto e não tem toxicidade renal baixa [13, 14]. Na prática clínica, a deterioração da função renal é uma complicação dos radiocontrastos iodados [15]. Portanto, o desenvolvimento de nanomateriais fornece novas idéias e métodos para resolver esses problemas. Estudos recentes também confirmaram que o agente de contraste de TC à base de nanopartículas pode efetivamente estender o tempo de imagem, enfraquecimento da toxicidade renal e ter melhor atenuação de raios-X do que os agentes de contraste à base de iodo, como nanopartículas de ouro e partículas de nanoprata usadas como Os agentes de contraste da TC têm atraído a atenção dos pesquisadores [16,17,18]. A nanoplataforma de dendrímero não apenas como pequena molécula modificada de meio de contraste iodado, mas também como um pacote de molde e estabilidade de diferentes nanopartículas inorgânicas, melhora o tempo de circulação sanguínea do agente de contraste, o que o torna melhor para imagens de TC [19].

Neste estudo, preparamos as nanopartículas nanopartículas de Au funcionalizadas com PEG (AuNS @ PEG); devido à área de superfície maior em comparação com nanopartículas de Au normais do mesmo tamanho, a nanostar de Au pode melhorar muito a imagem de TC. Depois de funcionalizadas com PEG, nanopartículas de nanostar de Au podem melhorar suas propriedades biocompatíveis e de depuração renal. Vários métodos, incluindo TEM, EDX, XPS, MTT e citometria de fluxo, foram usados para determinar os caracteres e a biocompatibilidade de nanopartículas de AuNS @ PEG. Além disso, análises histológicas e estudos de hematologia foram usados para testes sobre a toxicidade das nanopartículas de AuNS @ PEG in vivo, e os resultados confirmaram a boa biocompatibilidade das nanopartículas de AuNS @ PEG. Além disso, os experimentos de imagem de CT in vitro e in vivo também exibiram os excelentes recursos de imagem de CT de nanopartículas de AuNS @ PEG. Todos esses resultados revelaram que o agente de contraste sintetizado AuNS @ PEG nanopartículas como um grande candidato potencial poderia ser amplamente utilizado para imagens de TC e tinha boas propriedades de depuração renal.

Métodos

Todos os protocolos experimentais, incluindo todos os detalhes relevantes, foram aprovados pelo Comitê de Ética Regional, Jinzhou Medical University, Liaoning Province, China.

Materiais e instrumentos

Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e usados diretamente, a menos que indicado de outra forma.

Nanopartículas sintetizadas foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e análises de energia dispersiva de raios-X (EDX) usando voltagem de aceleração de 200 kV (Tecnai G2 Twin, FEI, Hillsboro, OR). A amostra TEM foi preparada por secagem de soluções de nanopartículas diluídas em uma grade de cobre revestida com carbono / formvar. As amostras foram preparadas depositando uma gota de uma solução coloidal diluída em uma grade de carbono e deixando o líquido secar ao ar em temperatura ambiente. Os espectros de adsorção de UV-vis foram registrados em um espectrofotômetro Shimadzu UV-2450 UV / Vis / NIR. A medição de espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi realizada em um Malvern Zetasizer NANO ZS a 25 ° C.

Síntese de nanopartículas de Au Nanostars / PEG (AuNS @ PEG)

Au nanostars (Au NS) foram sintetizados via método de crescimento mediado por sementes de acordo com um relatório anterior [20,21,22] com alguns pequenos ajustes. Normalmente, as sementes de Au que foram formadas com diâmetro de 10 nm foram sintetizadas pela redução química de HAuCl ₄ de acordo com relatório anterior [23]; 6 ml HAuCl ₄ solução ( w / v 1%) foi adicionado a 140 ml de água ultrapura e aquecida até à ebulição com agitação. Em seguida, 0,75 ml de oleilamina foram rapidamente injetados e a mistura resultante foi fervida por mais 2 h. O colóide Au foi naturalmente resfriado até a temperatura ambiente; 60 ml de ciclohexano foram adicionados ao colóide e a solução foi agitada magneticamente durante mais 1 h. Posteriormente, 1,5 ml de NaOH (4 M) foi injetado na mistura enquanto se agitava vigorosamente por mais 30 min. A mistura foi deixada para ser hierárquica. O Au nanoseed contido na camada superior foi precipitado pela adição de etanol. Os precipitados foram purificados alternadamente com etanol e água mais uma vez e dispersos em água.

As nanostars de Au com cerca de 50 nm de diâmetro foram sintetizadas de acordo com trabalhos anteriores misturando AgNO ₃ de forma rápida e simultânea (1 ml, 3 mM) e ácido ascórbico (500 μl, 0,1 M) com 100 ml de uma solução contendo 0,25 mM de HAuCl ₄ , HCl 1 mM e 1,5 ml das sementes de nanosfera de ouro. Em seguida, o polímero de polietilenoglicol tiolado (PEG, 6 kDa) foi adicionado em grande excesso para passivar a superfície das nanopartículas. A solução da mistura foi agitada continuamente durante 24 h, em seguida, as nanopartículas AuNS @ PEG obtidas foram coletadas através de 3 ciclos de centrifugação / redispersão em água. As nanopartículas de AuNS @ PEG formadas foram redispersas em água para uso posterior.

Cultura de células e AuNS @ Exposição a nanopartículas de PEG

As células de Neuroglia foram coletadas de tecidos da medula espinhal de rato. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U por ml de penicilina e 100 μg por ml de estreptomicina a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO ₂ . As células foram semeadas em placas de cultura seguidas por exposição a nanopartículas de AuNS @ PEG por 2 h em certas concentrações (50, 100, 200, 500 e 1000 ppm). Nanopartículas de DMEM sem AuNS @ PEG foram usadas como o grupo de controle.

Animais e tratamento

Este trabalho foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Jinzhou Medical University (número de licença:LMU-2013-368), China. Ratos Sprague Dawley machos (180–200 g) foram adquiridos no Animal Center da Jinzhou Medical University (número de licença:SCXK 2009-0004). Todos os ratos foram alimentados em sala com temperatura controlada (25,0 ± 0,2 ° C), em laboratório Specific Pathogen Free, com fotoperíodo claro / escuro de 12h / 12h e umidade de 50%. Os ratos tiveram livre acesso a comida e água.

Os desfechos humanos são escolhidos para minimizar ou encerrar a dor ou angústia dos animais experimentais por meio da eutanásia, incluindo agentes inalantes, agentes farmacêuticos não naturais e métodos físicos, em vez de esperar por suas mortes como o desfecho. Neste trabalho, os ratos foram divididos em dois grupos:(1) controle:os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de hidrato de cloral (10% em peso) e, em seguida, 800 μL de solução salina tamponada com fosfato foram injetados pela veia da cauda. (2) Teste:ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de hidrato de cloral (10% em peso) e, em seguida, 800 μL de solução de nanopartículas de AuNS @ PEG (200 μg / ml) foram injetados pela veia da cauda. Para o estudo de H&E, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical sem anestesia prévia, e seus corações, fígados, rins, baços e intestinos foram imediatamente dissecados, armazenados a -80 ° C e congelados em isopentano em gelo seco até mais processado.

Ensaio de viabilidade celular

As células da neuroglia em fase logarítmica foram semeadas em uma placa de 96 poços em 1 × 10 ⁴ células por poço em suspensão de células de 100 μl. Foi adicionada solução salina tamponada com fosfato (PBS) aos poços circundantes. A placa foi incubada a 37 ° C e 5% de CO ₂ por 24 horas para permitir a adesão das células. As células foram então alocadas em quatro grupos:as células do grupo controle foram incubadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino; no grupo de nanopartículas de AuNS @ PEG, 0, 25, 50, 100, 200, 500 ou 1000 ppm de nanopartículas de AuNS @ PEG foram adicionadas ao meio de cultura; as células foram observadas 24 horas depois em um microscópio de contraste de fase invertida (Leica, Heidelberger, Alemanha). Posteriormente, 20 μl de MTT (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foram adicionados a cada poço por 4 h. O meio foi removido e as células foram incubadas com 150 μl de dimetilsulfóxido por 10 min a 37 ° C. Os valores de densidade óptica (DO) foram medidos a 490 nm com um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

Citometria de fluxo

As células foram incubadas em placas de 6 poços por 24 h, depois agrupadas e tratadas como descrito acima. Uma suspensão de célula única foi feita usando tripsina e centrifugada a 300 g por 3 min. Após a remoção do sobrenadante, as células foram lavadas duas vezes com PBS pré-resfriado e centrifugadas em 1 ml de anexina V (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd., Tianjin, China) durante 10 min. As células foram ajustadas para 10 ⁵ / ml. A suspensão de células foi centrifugada e lavada três vezes com PBS. Amostras (100 μl) foram adicionadas a tubos Eppendorf com 5 μl de anexina V-APC (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) e 7-AAD (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd.) e misturadas. O volume foi feito até 500 μl com PBS, e os tubos foram incubados em temperatura ambiente por 15 min no escuro. A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo (BD FACSCanto II, BD Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). A taxa de apoptose celular foi calculada da seguinte forma:número de células apoptóticas / número total de células × 100%.

Imagens CT

A imagem de TC foi adquirida usando uma TC espiral de 128 fileiras e 64 cortes produzida pela General Electric Company (GE). Os parâmetros de imagem foram os seguintes:a espessura do corte é de 0,625; o meio são ratos nus; a energia do tubo, kvp, é 120 μA e 100 mA; CTDIVOL é 6,53 mGy; e o raio é 4,8 cm. Todos os animais foram escaneados na direção cranial para caudal da parte inferior do tórax até a pelve. Os dados da TC foram analisados por imagens e pós-tratamento.

Análise histológica

Os órgãos foram removidos e fixados em paraformaldeído 4%, em seguida, com solução de sacarose paraformaldeído 30% uma vez a cada 2 dias, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E) para exame histológico usando técnicas padrão. As seções foram examinadas em um microscópio de contraste de fase invertida .

Avaliação da função renal

Analisadores bioquímicos (Jinzhou Medical University) foram usados para avaliar BUN, Crea, β ₂ -MG e CO ₂ No Sangue. A função renal foi avaliada pelas alterações dos níveis séricos de BUN, Crea, β ₂ -MG e CO ₂ antes e depois da injeção de nanopartículas de AuNS @ PEG no rato.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± DP e analisados com o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) e SPSS. Os grupos foram comparados usando análise de variância unilateral e o teste de diferença mínima significativa. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização das nanopartículas AuNS @ PEG

Os nanomateriais entram no corpo humano e desempenham o papel de detecção. As propriedades físicas e químicas das nanopartículas são primeiro consideradas antes de entrarem no sistema circulatório [24, 25]. Como sabemos, existem dois fatores-chave no desenvolvimento de nanossondas de alto desempenho para imagens de TC in vivo e propriedades de depuração renal. Um é a funcionalização de superfície adicional; o outro é o controle de tamanho.

Uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão em grande escala (TEM) (Fig. 1a) foi usada para confirmar a estrutura das nanopartículas de AuNS @ PEG, que mostrou que as nanopartículas de AuNS @ PEG de estrutura em estrela foram preparadas, e essas nanopartículas tinham os tamanhos ideais ao redor 50 nm com alta uniformidade. Então, os elementos de Au encontrados no espectro de energia dispersiva de raios-X (EDX) de nanopartículas de AuNS @ PEG também comprovam a preparação de nanostar de Au (Fig. 1c). Além disso, a composição na superfície das nanopartículas de AuNS @ PEG foi ainda caracterizada por espectros de XPS, e Au4f, C1s e O1s derivados de nanostars de Au e PEG foram claramente mostrados na Fig. 1b, que também confirmam a formação de AuNS @PEG nanoparticles.

Micrografias eletrônicas de transmissão de nanopartículas de AuNS @ PEG ( a ), XPS ( b ) e EDX ( c ) das nanopartículas AuNS @ PEG

As características acima demonstraram a síntese bem-sucedida de nanopartículas de AuNS @ PEG.

CT Valor das Nanopartículas AuNS @ PEG

Nanopartículas de Au têm sido amplamente utilizadas como agentes de contraste de TC devido à sua melhor propriedade de atenuação de raios-X do que os agentes de contraste de TC de moléculas pequenas à base de iodo convencionais. Iodo ( Z =53) tem sido historicamente o átomo da primeira escolha no campo de imagens de TC. Para avaliar a viabilidade de nanopartículas AuNS @ PEG para imagens de tomografia computadorizada de raios-X, medimos os valores de CT (unidades de Hounsfield, HU). A Figura 2a mostra que as nanopartículas de AuNS @ PEG têm maior valor de CT em comparação com o iodo e água DI na mesma concentração. Quando a concentração de nanopartículas de AuNS @ PEG aumentou, a intensidade da imagem CT também aumentou continuamente com imagens mais brilhantes. Ao representar graficamente o valor CT (em HU) do AuNS @ PEG em função da concentração (Fig. 2b), podemos ver uma atenuação linear do valor CT das nanopartículas de AuNS @ PEG com as diferentes concentrações. Esses resultados revelam que as nanopartículas de AuNS @ PEG são candidatas ideais para uma nanossonda de imagem de TC positiva.

A intensidade de atenuação de raios-X das nanopartículas de AuNS @ PEG em função da concentração de Au ( a ) e imagem de CT das nanopartículas de AuNS @ PEG em diferentes concentrações (iodoidrina, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,75, 15,625 e 7,8125 ppm, respectivamente) ( b )

Ensaio de citotoxicidade

Era crucial investigar a biocompatibilidade das nanopartículas de AuNS @ PEG in vitro antes de serem usadas em imagens de TC in vivo como um agente de contraste. O ensaio de MTT foi realizado para avaliar sua citotoxicidade nas células da neuroglia. Após incubação com nanopartículas de AuNS @ PEG em diferentes concentrações (25, 50, 100, 200, 500 e 1000 ppm, respectivamente) por 24 h, foi realizado um ensaio de viabilidade MTT de células da neuroglia. Pode-se observar que a viabilidade das células após o tratamento com nanopartículas de AuNS @ PEG na faixa de concentração estudada é bastante semelhante ao controle, o que indica claramente que as nanopartículas de AuNS @ PEG formadas apresentam uma boa citocompatibilidade em uma concentração de até 200 ppm . Mesmo com uma dose relativamente alta de nanopartículas (1000 ppm), a viabilidade celular ainda permaneceu acima de 90% (Fig. 3a).

Viabilidade celular da neuroglia incubada com diferentes concentrações de nanopartículas de AuNS @ PEG por 24 h ( a ); a apoptose de células induzida por nanopartículas de AuNS @ PEG é mostrada por citometria de fluxo:controle ( bi ), 25 ppm ( ii ), 50 ppm ( iii ), 100 ppm ( iv ), 200 ppm ( v ), 500 ppm ( vi ) e 1000 ppm ( vii )

A citocompatibilidade das nanopartículas de AuNS @ PEG foi ainda confirmada por análise de citometria de fluxo das células tratadas com as nanopartículas de AuNS @ PEG em diferentes concentrações por 2 h. Na análise de citometria de fluxo, as células foram coradas com anexina V-APC e 7-AAD após o tratamento com nanopartículas de PBS e AuNS @ PEG. As células de Neuroglia tratadas com PBS sem coloração foram usadas como controle (Fig. 3bi). Pode-se observar que as células tratadas com nanopartículas de AuNS @ PEG em concentrações de 25, 50, 100, 200, 500 e 1000 ppm, respectivamente (Fig. 3bi-vii). Tomados em conjunto com os resultados do ensaio de MTT, nossos resultados exibiram que as nanopartículas de AuNS @ PEG têm boa citocompatibilidade, e não houve mudança na morfologia celular óbvia após o tratamento com as nanopartículas de AuNS @ PEG, o que concordou com os dados de MTT.

Imagem CT In Vivo e Biodistribuição

Incentivados por seu alto desempenho de contraste de CT no experimento in vitro, confirmamos ainda a viabilidade de nanopartículas de AuNS @ PEG como um agente de contraste de CT in vivo. Nanopartículas de AuNS @ PEG (200 ppm) foram injetadas por via intravenosa nas veias da cauda do rato. Tal dose de nanopartículas de AuNS @ PEG foi escolhida devido aos resultados de baixa toxicidade e porcentagem de apoptose de MTT e citometria de fluxo e alta sensibilidade de CT. As imagens de TC das regiões importantes do órgão foram registradas antes da injeção na veia da cauda e em diferentes pontos de tempo após a injeção na veia da cauda (Fig. 4). Nosso estudo tem como objetivo testar a capacidade de imagens de tomografia computadorizada e depuração renal. Portanto, enfatizamos a mudança do órgão do rim e da bexiga na tomografia computadorizada. A Figura 4a é a imagem de TC do rim de rato antes da injeção. Em comparação com a pré-injeção, a imagem do rim é bastante melhorada de 0,5 a 2 h (Fig. 4b-d). A distribuição dependente do tempo das nanopartículas de AuNS @ PEG no rato também foi rastreada pelo valor do sinal CT após a injeção intravenosa. A imagem do rim e da bexiga foi bastante aumentada de 0,5 a 2 h, e o valor HU deles aumentou de 95 para 464 e 105 para 664. Após 6 h pós-injeção, a intensidade de contraste CT no rim de rato obviamente diminuiu ao longo do tempo ( Fig. 4e). Após 24 h após a injeção, a imagem de TC do órgão da bexiga é completamente clara, mostrando as excelentes propriedades de depuração renal das nanopartículas de AuNS @ PEG (Fig. 4f). Devido ao seu tamanho de partícula ideal e funcionalização de superfície, a eliminação de nanopartículas de AuNS @ PEG do sangue durante a circulação pode ser tão lenta. Portanto, esses resultados indicam que as nanopartículas de AuNS @ PEG preparadas podem ser uma nanossonda única e promissora para fornecer imagens de TC em tempo real in vivo. Isso é benéfico para futuras aplicações clínicas porque os agentes de contraste podem ser administrados a pacientes no hospital.

Imagens de TC de rato antes da injeção ( a ) e em pontos de tempo diferentes (0,5, 1, 2, 6 e 24 h) ( b - f ) após injeção intravenosa de nanopartículas de AuNS @ PEG (200 ppm)

Coloração H&E

Mudanças histológicas nos órgãos dos camundongos foram realizadas após 24 h após a injeção de nanopartículas de AuNS @ PEG, e os resultados foram mostrados na Fig. 5. Podemos ver que nenhuma mudança óbvia na histologia dos órgãos principais foi observada, e o mais importante, não há nanopartículas de AuNS @ PEG residuais deixadas nesses órgãos. Com base nos resultados acima, as nanopartículas AuNS @ PEG exibiram boa biocompatibilidade e nenhuma toxicidade in vivo óbvia, o que as promete como um novo agente de contraste de imagens de TC para aplicação em medicina biológica.

Seções de tecido manchadas com H&E: a coração, b fígado, c baço, d pulmão, e rim e f intestino. As barras de escala representam 100 mm

Estudo da função renal de AuNS @ nanopartículas de PEG

Para avaliar ainda mais a toxicidade in vivo de nanopartículas de AuNS @ PEG, os parâmetros de BUN, Crea, β ₂ -MG e CO ₂ foram medidos para estudos de função renal; analisamos o soro. Esses valores podem avaliar se a função renal do rato é boa ou não. Os valores de BUN podem avaliar a função urinária do rato. O valor variável de Crea representa as várias doenças no corpo do rato. O β ₂ A concentração de -MG está principalmente relacionada à função tubular renal. E o valor de CO ₂ pode avaliar a função de acidificação do túbulo renal. O rato recebeu nanopartículas de AuNS @ PEG a uma concentração de 200 ppm. O nível desses resultados foi examinado 24 horas após a injeção, e não houve diferença entre antes e depois da injeção de nanopartículas de AuNS @ PEG em ratos (Tabela 1).

Conclusões

Em resumo, desenvolvemos nanopartículas fáceis de AuNS @ PEG para aplicações em imagens de TC. As nanopartículas de AuNS @ PEG formadas têm tamanhos ultra-pequenos, baixa toxicidade, boa dispersibilidade em água, hemocompatibilidade e citocompatibilidade na faixa de concentração dada. Os valores de CT mostram que as nanopartículas AuNS @ PEG têm uma boa imagem brilhante. Os resultados de imagem in vitro indicam que as nanopartículas de AuNS @ PEG possuem fortes propriedades de atenuação de raios-X como um novo agente de contraste para aplicações de imagem CT, que também foram demonstradas pela imagem CT de rim de rato in vivo. Além disso, a distribuição do estudo biológico e a exploração da toxicidade in vivo mostram que as nanopartículas de AuNS @ PEG podem se metabolizar e ter alta compatibilidade biológica. Assim, nanopartículas AuNS @ PEG podem ser candidatos promissores para aplicações médicas.

Síntese hidrotérmica de nanopartículas de In2O3 híbridos gêmeos heteroestruturas de ZnO de disco hexagonal para atividades fotocatalíticas aprimoradas e estabilidade Biossegurança e capacidade antibacteriana do grafeno e do óxido de grafeno in vitro e in vivo

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