Espectroscopia usando um microscópio óptico

Um instrumento hifenizado é aquele que combina as capacidades de duas tecnologias diferentes para formar uma nova técnica analítica com novas habilidades. O espectrofotômetro de microscópio é um desses instrumentos hifenizados; é um híbrido que combina o poder de ampliação de um microscópio óptico com proficiências analíticas de um espectrofotômetro UV-visível-NIR. Como tal, espectrofotômetros de microscópio podem ser usados ​​para medir os espectros moleculares de áreas de amostras microscópicas desde o ultravioleta profundo até a região do infravermelho próximo. Eles podem ser configurados para muitos tipos diferentes de espectroscopia e, como tal, são usados ​​para medir absorbância, refletância e até espectros de emissão, como fluorescência e fotoluminescência, de amostras de tamanho micro. Com a adição de algoritmos especializados, o espectrofotômetro de microscópio também pode ser usado para medir a espessura de filmes finos ou atuar como colorímetro para amostras microscópicas.

Há muitas razões para usar o espectrofotômetro de microscópio. O mais óbvio é que os espectros podem ser adquiridos a partir de uma área de amostra menor que um mícron. Além disso, esses instrumentos requerem apenas pequenas quantidades de amostras na forma sólida ou líquida. Outra vantagem é que muito pouca ou nenhuma preparação é necessária para muitas amostras. E as comparações de cores por espectroscopia tendem a ser mais precisas com espectrofotômetros porque esses instrumentos têm uma faixa espectral mais ampla, podem corrigir variações de iluminação e podem medir a intensidade de cada faixa de comprimento de onda da luz.

Antes do advento da microespectroscopia, a única maneira de analisar muitos tipos de amostras microscópicas era usar testes microquímicos e, em seguida, algum tipo de exame visual. Infelizmente, esses métodos tendem a ser destrutivos, exigem muitas amostras e sofrem com as imprecisões do sistema visual humano. O espectrofotômetro do microscópio evita esses problemas e pode “ver” além do alcance do olho humano e detectar variações que de outra forma não seriam aparentes.

Projeto de espectrofotômetro de microscópio

O espectrofotômetro de microscópio integra um microscópio óptico ou de luz com um espectrofotômetro de faixa UV-visível-NIR (Figura 1). O microscópio é um dispositivo projetado para ampliar uma imagem de pequenos objetos para permitir que eles sejam estudados. O espectrofotômetro é um instrumento que mede a intensidade de cada comprimento de onda da luz do ultravioleta através das regiões do visível e do infravermelho próximo. Com um espectrofotômetro de microscópio devidamente configurado, é possível adquirir espectros de absorbância, refletância e emissão com áreas de amostragem na escala submicrônica.

Para cobrir uma faixa espectral tão ampla com boa qualidade de imagem e espectral, um microscópio personalizado é construído e integrado ao espectrofotômetro. Os microscópios ópticos padrão têm uma faixa espectral limitada que cobre apenas uma parte da região visível devido aos materiais usados ​​para a óptica, bem como às próprias fontes de luz. O espectrofotômetro de microscópio moderno utiliza um microscópio personalizado com um design óptico e fontes de luz otimizadas para o UV profundo através do NIR.

O próprio espectrofotômetro também deve ser projetado para microespectroscopia para obter bons resultados espectrais. Isso significa que o espectrofotômetro deve ser altamente sensível, mantendo uma resolução espectral aceitável. A estabilidade também é um problema, pois o espectrofotômetro do microscópio é um instrumento de feixe único e os espectros de referência devem ser obtidos antes da medição da amostra. O instrumento também deve ter uma faixa dinâmica alta, pois frequentemente se muda de microespectroscopia de transmissão ou refletância para espectroscopia de fluorescência ao medir a mesma amostra. Isso permite obter diferentes tipos de informações espectrais exatamente do mesmo local na amostra microscópica.

A integração do espectrofotômetro com o microscópio é extremamente importante. Embora o microscópio e o espectrofotômetro devam ser otimizados para microespectroscopia, a chave para a operação de um espectrofotômetro de microscópio é o hardware que permite que eles trabalhem juntos. Esta interface tem vários requisitos básicos. Mais importante ainda, deve canalizar a energia eletromagnética coletada pelo microscópio da amostra para o espectrofotômetro. No entanto, o usuário deve ser capaz de visualizar a área de medição da amostra, mas também ver a amostra ao redor. Isso é feito tendo a abertura de entrada do espectrofotômetro no mesmo plano focal da imagem de amostra. A amostra pode então ser movida com a platina do microscópio, como normalmente faria com um microscópio, até que a imagem da abertura de entrada esteja sobre a área a ser medida. Na Figura 2, o quadrado preto no centro da imagem é a abertura de entrada do espectrofotômetro. Tudo isso é feito em tempo real para que a espectroscopia das amostras do microscópio seja rápida e fácil.

Conforme mostrado na Figura 3, a ótica do microscópio focaliza a luz na amostra. A energia eletromagnética é então coletada da amostra pela objetiva do microscópio. A luz da objetiva é focada na abertura de entrada espelhada do espectrofotômetro. A maior parte da luz é refletida da superfície de abertura de entrada para a câmera. A abertura do espectrofotômetro também é fotografada pela câmera para que apareça como um quadrado preto na amostra (Figura 2). Isso permite o alinhamento fácil e rápido do espectrofotômetro do microscópio. A luz que passa pela abertura de entrada passa então para o espectrofotômetro onde um espectro é medido.

O microscópio pode ser configurado com diferentes esquemas de iluminação dependendo do tipo de experimento a ser realizado. A iluminação incidente com luz branca permite a microespectroscopia de refletância desde o UV profundo até o IR próximo. A iluminação incidente também pode ser usada para microespectroscopia de fluorescência ou fotoluminescência. Além disso, a microespectroscopia de transmissão é possível com luz branca focada na amostra através do condensador do microscópio.

Aplicações da microespectroscopia

Os primeiros espectrofotômetros de microscópio foram desenvolvidos na década de 1940 e, desde então, uma série de aplicações diferentes foram desenvolvidas. Com a capacidade de adquirir espectros de áreas de amostras microscópicas, os espectrofotômetros microscópicos são usados ​​em todos os lugares, desde laboratórios universitários até linhas de produção para controle de qualidade e análise de falhas.

Ciência Forense. A análise de evidências forenses tem sido uma das aplicações mais importantes para espectrofotômetros microscópicos desde o início da década de 1980. O maior esforço foi na análise de vestígios, especificamente fibras têxteis e lascas de tinta1,2. Como seus nomes sugerem, esses tipos de amostras são geralmente microscópicas e, sendo evidências, não devem ser danificadas ou destruídas por testes. Com fibras, espectrofotômetros de microscópio são usados ​​para medir a absorbância de UV-visível-NIR e espectros de fluorescência de fibras individuais. As lascas de tinta são geralmente seccionadas e, em seguida, o espectro de absorbância de cada camada é medido para que amostras conhecidas e questionadas possam ser comparadas com um alto grau de discriminação.

Telas de tela plana. As telas planas modernas consistem em milhões de pixels multicoloridos. À medida que a tecnologia avança, os pixels tornam-se cada vez menores e mais compactados em superfícies cada vez maiores. As telas mais modernas usam diferentes tecnologias, como pontos quânticos e diodos orgânicos emissores de luz, para criar pixels de cores diferentes na escala microscópica. O espectrofotômetro do microscópio é usado para ajudar a desenvolver esses materiais como fontes de luz viáveis ​​e, finalmente, como monitores 3,4. O espectrofotômetro do microscópio também é usado no processo de produção para garantir que tanto a cor quanto a intensidade dos pixels sejam consistentes em toda a tela, garantindo imagens brilhantes e uniformemente iluminadas na tela.

Energia. A rocha geradora de carvão e petróleo contém vitrinita e outros macerais. Os espectrofotômetros microscópicos são usados ​​para classificar a maturidade térmica5 e, portanto, o conteúdo de energia, de carvão, coque e rocha geradora de petróleo. Isso é feito medindo a refletividade absoluta da vitrinita em uma amostra polida. Dependendo da refletividade, a maturidade térmica da amostra pode ser determinada.

Nanotecnologia. O espectrofotômetro de microscópio também está avançando na nanotecnologia e na ciência de materiais com base em sua capacidade de medir áreas de amostras microscópicas de transmissão, refletância e espectro de emissão. Uma área de aplicações em rápido crescimento é o desenvolvimento e uso de ressonância plasmônica de superfície (SPR)6,7,8.

Os plasmons de superfície são excitados iluminando uma superfície metálica planar ou partículas metálicas em nanoescala com luz (Figura 4). Mudanças nas características ópticas desses materiais ocorrem quando essas nanopartículas ou superfícies interagem com outros materiais. Como tal, muito trabalho está sendo feito para desenvolver novos materiais que exibam alguma forma de ressonância plasmônica, mas também para construir dispositivos que apresentem esses fenômenos. Este último inclui biossensores e sensores de dispositivos microfluídicos de vários tipos. O espectrofotômetro do microscópio mede como os espectros dos materiais SPR mudam sob diferentes condições, dando ao pesquisador a capacidade de caracterizar um novo material e, em seguida, “ajustar” esse material para efeitos ópticos específicos.

Conclusão

O espectrofotômetro microscópico é uma técnica hifenizada que combina o microscópio óptico com um espectrofotômetro para que se possa adquirir espectros de áreas de amostras microscópicas. Tais instrumentos são capazes de espectros de absorbância e refletância do UV profundo através do visível e nas regiões do infravermelho próximo. O espectrofotômetro de microscópio também pode medir fluorescência e outros tipos de espectros de emissão. Esses dispositivos encontraram usos em muitos campos, incluindo ciência forense, medição de espessura de filme óptico e semicondutor, biotecnologia e o que há de mais recente em ciência de materiais.

Referências

1. S. Walbridge-Jones, Microespectrofotometria para medição de cor de fibras têxteis, Identificação de Fibras Têxteis , Publicação Woodhead, 2009, Páginas 165-180,
2. Guia Padrão para Microespectrofotometria em Análise Forense de Pintura, Sociedade Americana de Testes e Materiais.
3. Buchnev, O., Podoliak, N., &Fedotov, V. A. (2018). Metapixel preenchido com cristal líquido com refletância e transmitância assimétrica selecionáveis . J. Molecular Liquids, 267, 411-414.
4. Rezaei, S. D., Hong Ng, R. J., Dong, Z., Ho, J., Koay, E. H., Ramakrishna, S., &Yang, J. K. (2019). Paletas de cores plasmônicas de gama ampla com resolução de subcomprimento de onda constante . ACS nano, 13 (3), 3580-3588.
5. “Métodos para a análise petrográfica de carvões – Parte 5:Método para determinar microscopicamente a refletância da vitrinita”, ISO 7404-5, International Organization for Standardization, 2009.
6. Ng, R.J.H., Krishnan, R.V., Dong, Z., Ho, J., Liu, H., Ruan, Q., Pey, K.L. e Yang, J.K (2019). Microtags para arte:imagens ocultas visíveis e infravermelhas usando plasmons de lacuna em óxido de alumínio nativo . Optical Materials Express, 9 (2), 788-801.
7. Alali, M., Yu, Y., Xu, K., Ng, R.J., Dong, Z., Wang, L., Dinachali, S.S., Hong, M. e Yang, J.K. (2016). Empilhamento de cores em super-redes plasmônicas esfoliantes . Nanoscale, 8 (42), 18228-18234.
8. Jiang, M., Siew, S.Y., Chan, J.Y., Deng, J., Wu, Q.Y.S., Jin, L., Yang, J.K., Teng, J., Danner, A. e Qiu, C.W., (2020 ). Resistência padronizada em prata plana alcançando cores plasmônicas saturadas com largura de linha espectral abaixo de 20 nm . Materials Today, 35, 99-105.

Este artigo foi escrito pelo Dr. Paul Martin, Presidente, CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Para mais informações, entre em contato com Dr. Martin em Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você precisa habilitar o JavaScript para visualizá-lo., ou visite aqui .