Espectroscopia Integrada à Microscopia: Análise Precisa UV-Vis-NIR de Amostras Microescala

Um instrumento hifenado é aquele que combina as capacidades de duas tecnologias diferentes para formar uma nova técnica analítica com habilidades inovadoras. O microscópio espectrofotômetro é um tal instrumento hifenado; é um híbrido que combina o poder de ampliação de um microscópio óptico com proficiências analíticas de um espectrofotômetro de faixa UV-visível-NIR. Como tal, microscópios espectrofotômetros podem ser usados para medir espectros moleculares de áreas de amostra microscópicas do ultravioleta profundo ao infravermelho próximo. Eles podem ser configurados para muitos tipos diferentes de espectroscopia e, como tal, são usados para medir absorbância, reflectância e até espectros de emissão, como fluorescência e fotoluminescência, de amostras de tamanho mícron. Com a adição de algoritmos especializados, o microscópio espectrofotômetro também pode ser usado para medir espessura de filmes finos ou atuar como colorímetro para amostras microscópicas.

Por Que Usar Microscópio Espectrofotômetro

Existem muitas razões para usar o microscópio espectrofotômetro. A mais óbvia é que espectros podem ser adquiridos de uma área de amostra menor que um mícron. Adicionalmente, estes instrumentos requerem apenas pequenas quantidades de amostras em forma sólida ou líquida. Outra vantagem é que muito pouca ou nenhuma preparação é requerida para muitas amostras. E comparações de cor por espectroscopia tendem a ser mais precisas com espectrofotômetros porque estes instrumentos têm uma faixa espectral mais ampla, podem corrigir variações de iluminação e podem medir a intensidade de cada banda de comprimento de onda de luz.

Antes do advento da microespectroscopia, a única maneira de analisar muitos tipos de amostras microscópicas era usar testes microquímicos e então algum tipo de exame visual. Infelizmente, estes métodos tendem a ser destrutivos, requerem muitas amostras e sofrem das imprecisões do sistema visual humano. O microscópio espectrofotômetro evita estes problemas e pode "ver" além da faixa do olho humano e detectar variações que não seriam aparentes de outra forma.

Design do Microscópio Espectrofotômetro

O microscópio espectrofotômetro integra um microscópio óptico ou de luz com um espectrofotômetro de faixa UV-visível-NIR (Figura 1). O microscópio é um dispositivo projetado para ampliar uma imagem de objetos pequenos para permitir que sejam estudados. O espectrofotômetro é um instrumento que mede a intensidade de cada comprimento de onda de luz do ultravioleta através do visível e regiões do infravermelho próximo. Com um microscópio espectrofotômetro propriamente configurado, é possível adquirir espectros de absorbância, reflectância e emissão com áreas de amostragem na escala submicrométrica.

Para cobrir tal faixa espectral ampla com boa qualidade de imagem e espectral, um microscópio customizado é construído e integrado com o espectrofotômetro. Microscópios ópticos padrão têm uma faixa espectral limitada cobrindo apenas uma porção da região visível por causa dos materiais usados para as ópticas bem como as fontes de luz em si. O microscópio espectrofotômetro moderno utiliza um microscópio customizado com design óptico e fontes de luz otimizadas para o UV profundo através do NIR.

O próprio espectrofotômetro também deve ser projetado para microespectroscopia para obter bons resultados espectrais. Isso significa que o espectrofotômetro deve ser altamente sensível enquanto ainda mantém uma resolução espectral aceitável. Estabilidade também é um problema já que o microscópio espectrofotômetro é um instrumento de feixe único e espectros de referência devem ser obtidos antes de medir a amostra. O instrumento também deve ter uma alta faixa dinâmica já que frequentemente se alterna de microespectroscopia de transmissão ou reflectância para espectroscopia de fluorescência ao medir a mesma amostra. Isso permite obter diferentes tipos de informação espectral de exatamente a mesma localização na amostra microscópica.

A integração do espectrofotômetro com o microscópio é criticamente importante. Enquanto o microscópio e espectrofotômetro devem ambos ser otimizados para microespectroscopia, a chave para a operação de um microscópio espectrofotômetro é o hardware que os permite trabalhar juntos. Esta interface tem vários requisitos básicos. O mais importante, deve canalizar a energia eletromagnética coletada pelo microscópio da amostra para o espectrofotômetro. No entanto, o usuário deve ser capaz de visualizar a área de medição da amostra, mas também ver a amostra circundante. Isso é feito tendo a abertura de entrada do espectrofotômetro no mesmo plano focal que a imagem da amostra. A amostra pode então ser movida com o palco do microscópio, como normalmente se faria com um microscópio, até que a imagem da abertura de entrada esteja sobre a área a ser medida. Na Figura 2, o quadrado preto no centro da imagem é a abertura de entrada do espectrofotômetro. Tudo isso é feito em tempo real para que a espectroscopia de amostras de microscópio seja rápida e fácil.

Como mostrado na Figura 3, as ópticas do microscópio focam luz na amostra. A energia eletromagnética é então coletada da amostra pelo objetivo do microscópio. A luz do objetivo é focada na abertura de entrada espelhada do espectrofotômetro. A maioria da luz é refletida da superfície da abertura de entrada para a câmera. A abertura do espectrofotômetro também é imagemada pela câmera para que apareça como um quadrado preto na amostra (Figura 2). Isso permite alinhamento fácil e rápido do microscópio espectrofotômetro. A luz que passa através da abertura de entrada então passa para o espectrofotômetro onde um espectro é medido.

Aplicações de Microespectroscopia

Os primeiros microscópios espectrofotômetros foram desenvolvidos nos anos 1940 e desde então, uma série de diferentes aplicações foram desenvolvidas. Com a capacidade de adquirir espectros de áreas de amostra microscópicas, microscópios espectrofotômetros são usados em todo lugar, de laboratórios universitários a linhas de produção para controle de qualidade e análise de falhas.

Ciência Forense.

A análise de evidência forense tem sido uma das aplicações mais importantes para microscópios espectrofotômetros desde o início dos anos 1980. O maior esforço foi na análise de evidência vestigial, especificamente fibras têxteis e fragmentos de tinta. Como seus nomes sugerem, estes tipos de amostras são geralmente microscópicos e, sendo evidência, não devem ser danificados ou destruídos por testes. Com fibras, microscópios espectrofotômetros são usados para medir espectros de absorbância e fluorescência UV-visível-NIR de fibras individuais. Fragmentos de tinta são geralmente seccionados transversalmente e então o espectro de absorbância de cada camada é medido para que amostras conhecidas e questionadas possam ser comparadas com alto grau de discriminação.

Displays de Painel Plano.

Displays de painel plano modernos consistem de milhões de pixels multi-coloridos. Conforme a tecnologia progrediu, os pixels tornam-se cada vez menores e mais compactados em superfícies cada vez maiores. Os displays mais modernos usam diferentes tecnologias, como pontos quânticos e diodos emissores de luz orgânicos, para criar pixels de diferentes cores na escala microscópica. O microscópio espectrofotômetro é usado para ajudar a desenvolver estes materiais como fontes de luz viáveis e finalmente como displays. O microscópio espectrofotômetro também é usado no processo de produção para garantir que tanto a cor quanto a intensidade dos pixels são consistentes por todo o display, assegurando imagens brilhantes e uniformemente iluminadas por todo o display.

Energia.

Carvão e rocha fonte de petróleo contêm vitrinita e outros macerais. Microscópios espectrofotômetros são usados para classificar a maturidade térmica, e portanto o conteúdo energético, de carvão, coque e rocha fonte de petróleo. Isso é feito medindo a reflectividade absoluta de vitrinita em uma amostra polida. Dependendo da reflectividade, a maturidade térmica da amostra pode ser determinada.

Nanotecnologia.

O microscópio espectrofotômetro também está avançando nanotecnologia e ciência de materiais baseados em sua capacidade de medir espectros de transmissão, reflectância e emissão de áreas de amostra microscópicas. Uma área de aplicações em rápido crescimento é no desenvolvimento e uso de ressonância de plasmon de superfície (SPR).

Plasmôns de superfície são excitados iluminando uma superfície metálica planar ou partículas metálicas nanoescala com luz (Figura 4). Mudanças nas características ópticas destes materiais ocorrem quando estas nanopartículas ou superfícies interagem com outros materiais. Como tal, muito trabalho está sendo feito para desenvolver novos materiais que exibam alguma forma de ressonância de plasmon, mas também para construir dispositivos que apresentem estes fenômenos. O último inclui biossensores e sensores de dispositivos microfluídicos de vários tipos. O microscópio espectrofotômetro mede como os espectros dos materiais SPR mudam sob diferentes condições dando ao pesquisador a capacidade de caracterizar um novo material, então "sintonizar" aquele material para efeitos ópticos específicos.

Conclusão

O microscópio espectrofotômetro é uma técnica hifenada que combina o microscópio óptico com um espectrofotômetro para que se possa adquirir espectros de áreas de amostra microscópicas. Tais instrumentos são capazes de espectros de absorbância e reflectância do UV profundo através do visível e no infravermelho próximo. O microscópio espectrofotômetro também pode medir fluorescência e outros tipos de espectros de emissão. Estes dispositivos encontraram usos em muitos campos incluindo ciência forense, medição de espessura de filmes semicondutores e ópticos, biotecnologia e o mais recente em ciência de materiais.

Referências

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Este artigo foi escrito por Dr. Paul Martin, Presidente, CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Para mais informações, contate Dr. Martin em este endereço de e-mail, ou visite aqui.