A administração de nanopartículas de artesunato aumenta a eficiência antitumoral ao ativar a apoptose celular mediada por mitocôndrias

Resumo

A artemisinina e seus derivados foram considerados como exercendo um amplo espectro de atividades anticâncer e induziram efeitos anticâncer significativos em células tumorais. A artemisinina e seus derivados puderam ser absorvidos rapidamente e foram amplamente distribuídos, matando seletivamente as células tumorais. Uma vez que as baixas concentrações de artesunato dependiam principalmente da oncose para induzir a morte celular nas células tumorais, os seus efeitos antitumorais foram indesejáveis ​​e limitados. Para obter melhores efeitos antitumorais, neste estudo, aproveitamos uma nova nanotecnologia para projetar novas nanopartículas de albumina de soro bovino carregadas com artesunato para atingir o acúmulo mitocondrial de artesunato e induzir a apoptose mediada por mitocondrial. Os resultados mostraram que, quando comparados com a dependência do artesunato livre na morte oncótica, as nanopartículas de albumina de soro bovino carregadas com artesunato mostraram maior citotoxicidade e seus efeitos apoptóticos significativos foram induzidos através da distribuição de artesunato na mitocôndria. Este achado indicou que nanopartículas de albumina de soro bovino carregadas com artesunato danificaram a integridade mitocondrial e ativaram a apoptose celular mediada por mitocondrial por meio da regulação positiva de proteínas relacionadas à apoptose e facilitando a rápida liberação de citocromo C.

Histórico

A artemisinina e seus derivados têm sido amplamente utilizados no tratamento da malária devido à sua alta atividade antimalárica e baixa toxicidade. Os pesquisadores também descobriram que a artemisinina e seus derivados demonstraram atividade antitumoral significativa em virtude de seus poucos efeitos colaterais tóxicos e maior tolerância por parte dos pacientes [1]. Foi relatado que o artesunato (Ats) definitivamente inibiu o crescimento das células tumorais e ainda induziu efeitos anticancerígenos significativos nas células tumorais [2,3,4]. Alguns experimentos indicaram que os Ats causaram diferentes graus de apoptose e oncose em células tumorais após 48 h, e que os graus de apoptose e oncose eram dependentes da dose de Ats. Em baixas concentrações, Ats não induziu apoptose óbvia em células tumorais e a morte celular induzida por Ats foi acompanhada por morte semelhante a oncose [5,6,7,8]. A fim de obter maiores efeitos antitumorais, uma dosagem maior de Ats foi aplicada, mas isso confirmou ainda mais sua grave toxicidade e supressão da medula óssea. Portanto, é necessário encontrar um tratamento eficaz para reduzir a dosagem efetiva de Ats para aumentar sua eficácia antitumoral [9,10,11]. Verificou-se que as mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação dos efeitos apoptóticos e oncóticos dos Ats. A mitocôndria também estava envolvida na regulação do processo de transdução de uma ampla variedade de sinais apoptóticos [12,13,14,15,16,17]. Quando a mitocôndria foi atacada por drogas, sua permeabilidade foi aumentada e o potencial de membrana diminuído, levando ao edema endometrial da membrana mitocondrial e à rápida liberação de citocromo C da mitocôndria para o citoplasma [18,19,20]. Além disso, algumas proteínas da família das caspases foram ativadas e a reação em cascata de apoptose celular foi induzida.

Para aumentar os efeitos antitumorais de Ats, muitas novas técnicas foram tentadas para aumentar a distribuição da droga nas células tumorais ou para melhorar a entrega direcionada de drogas em organelas celulares para induzir a morte celular [21,22,23]. Nanopartículas (NPs) como uma ferramenta-chave no tratamento direcionado do câncer têm sido amplamente investigadas e têm mostrado um potencial promissor. Como os NPs apresentam um tamanho de partícula menor e uma área de superfície alta, eles podem entrar na circulação sanguínea através dos capilares e passar pela lacuna da célula endotelial e migrar para o local do tumor, alcançando assim uma distribuição direcionada ao medicamento e aumentando a biodisponibilidade do medicamento . Além disso, os NPs poderiam controlar a liberação do fármaco por meio da degradação do biomaterial em um padrão longo e suave, em última análise, prolongando a meia-vida de eliminação, melhorando a concentração sanguínea efetiva e reduzindo a frequência de dosagem. Acima de tudo, NPs carregados de drogas podem ser entregues em locais específicos dentro das células, melhorando a eficácia do tratamento [24,25,26].

Para aumentar os efeitos antitumorais de Ats em baixas concentrações, tentamos projetar novos NPs de albumina de soro bovino (BSA) carregados com Ats. Devido ao baixo pH nas células tumorais, o acúmulo de um grande número de prótons de hidrogênio presentes na membrana mitocondrial externa ou no espaço intermembranar, ao contrário, a membrana inter mitocondrial é rica em carga negativa devido à sua composição química e matriz mitocondrial secreção, que torna um potencial transmembrana eletropositivo externo e negativo interno que pode favorecer a liberação de BSA. Então, o acúmulo massivo de Ats nas mitocôndrias poderia efetivamente desencadear a apoptose mediada por mitocôndrias. Os resultados mostraram que, quando comparado com a morte oncótica típica induzida por Ats livres, Ats foi especificamente transferido para a mitocôndria com a mediação de NPs BSA e promoveu a ativação mediada pela mitocôndria de proteínas caspases relacionadas à apoptose. Isso acendeu uma apoptose celular significativa, destacando assim a maior citotoxicidade.

Métodos

Materiais

O BSA foi adquirido da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, EUA) e o Ats foi adquirido da Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, República Popular da China). As células SMMC-7721 e as células Plc foram adquiridas do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, República Popular da China). Todos os outros produtos químicos adquiridos eram de grau analítico; eles foram obtidos de vários fornecedores.

Preparação e caracterização de NPs BSA carregados com Ats

De acordo com a literatura relatada anteriormente [27], NPs de BSA carregados com Ats foram preparados por meio de um método de dessolvatação. Resumidamente, os NPs de BSA carregados com Ats foram preparados vertendo rapidamente 1,0 mL de álcool anidro contendo uma certa quantidade de Ats em 0,5 mL de solução de BSA a 37 ° C até a opalescência. Com a remoção de etanol por evaporação rotativa, BSA NPs carregados com Ats foram precipitados do meio e, em seguida, 8% de glutaraldeído em água (0,5 μL / mg de BSA) foi adicionado para induzir a reticulação de partículas sob agitação da suspensão ao longo de um período de 24 h. Finalmente, os NPs foram coletados e lavados três vezes com água deionizada para analisar melhor suas caracterizações físicas, incluindo seu diâmetro hidrodinâmico, índice de polidispersidade (PDI), potencial zeta e morfologia usando um Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, EUA) e um microscópio eletrônico de transmissão (JEM-1200EX; JEOL, Tóquio, Japão). A determinação da eficiência de encapsulação de Ats em NPs BSA foi estimada usando um método previamente relatado [27].

Ensaio MTT

Dois tipos de linhas de células tumorais, células SMMC-7721 e células Plc, foram incubadas separadamente com 20% de soro fetal bovino (FBS). A densidade de crescimento celular foi ajustada para l × 10 ⁶ células / mL por contagem de células e, em seguida, as suspensões de células foram diluídas para l × 10 ⁵ células / mL. As suspensões diluídas foram adicionalmente adicionadas separadamente em uma placa de 96 poços (100 μL por poço, cerca de 1 × 10 ⁴ células / poço) para incubação contínua por 24 h a 37 ° C sob condições de 5% CO ₂ e 95% O ₂ . O meio foi substituído por meio sem soro na presença de Ats livres ou BSA NPs carregados com Ats apresentando diferentes concentrações de Ats, e foi subsequentemente incubado por 24 h. Um total de 50 μL de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) (5 mg / mL) foi adicionado a cada poço e incubado por 4 h para o término da cultura. Quando o corante de tetrazólio MTT foi reduzido ao seu formazan insolúvel, placas de 96 poços foram centrifugadas a 1000 rpm por 5 min, e o sobrenadante foi decantado de cada poço, seguido pela adição de 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), que completamente dissolveu os cristais. A absorvância da solução foi medida usando um leitor de microplacas (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) a 490 nm.

Distribuição intracelular do grupo BSA NP em células

As células SMMC-7721 e as células Plc na fase logarítmica foram selecionadas e tratadas com digestão com tripsina; a concentração de células foi ajustada para l × 10 ⁶ células / mL. Em seguida, as células cultivadas foram adicionadas a uma placa de cultura de células de 6 poços para aderência e o meio de cultura foi removido seguido pela adição de BSA NPs marcados com rodamina B. O núcleo foi corado com Hoechst (azul) por 15 min a 37 ° C, e a mitocôndria foi corada com Mitotracker Green FM. A localização de BSA NPs nas células foi rastreada dentro das células usando microscopia confocal de varredura a laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tóquio, Japão).

Alteração do potencial da membrana mitocondrial

O JC-1 pode ser usado para determinar as alterações no potencial da membrana mitocondrial. Quando o potencial da membrana mitocondrial era alto, JC-1 era capaz de passar livremente através da membrana celular e formar agregados dentro da mitocôndria, exibindo uma fluorescência vermelha (comprimento de onda de excitação, 525 nm; comprimento de onda de emissão, 590 nm); quando o potencial da membrana mitocondrial foi diminuído, JC-1 foi transferido da matriz mitocondrial para o citoplasma da célula para formar um monômero fluorescente verde (comprimento de onda de excitação, 490 nm; comprimento de onda de emissão, 530 nm). Células SMMC-7721 e células Plc foram semeadas respectivamente em placas confocais para atingir uma densidade de l × 10 ⁶ células / mL para incubação contínua por 12 h. Em seguida, o meio de cultura foi descartado e o meio de cultura sem soro contendo a dispersão de Ats ou BSA NPs carregados com Ats foi adicionado ao prato. Após 9 h, o meio foi descartado e as células foram lavadas duas vezes com PBS, seguido da adição de 2 mL de JC-1 na concentração de 2 μmol / L; as células foram então incubadas durante 30 min a 37 ° C no escuro. Um microscópio confocal de varredura a laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation) foi usado para observar as alterações de imagem na membrana mitocondrial.

Medição da produção de ROS e coloração do retículo endoplasmático (ER)

As células foram incubadas com 20% de FBS e a densidade de crescimento celular foi ajustada para l × 10 ⁶ células / mL por contagem de células; e então as suspensões de células foram diluídas para l × 10 ⁵ células / mL. As suspensões diluídas foram posteriormente adicionadas em placas de 96 poços (100 μL por poço, cerca de 1 × 10 ⁴ células / poço) para incubação contínua por 24 h a 37 ° C sob 5% de CO ₂ e 95% O ₂ . Em segundo lugar, NPs de BSA carregados com Ats e Ats livres foram incubados com as células por 6, 12 e 24 h, seguido por incubação contínua com 10 μM de diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) por cerca de 30 min. Tampão PBS gelado foi usado para lavar as células três vezes para remover os NPs não internalizados. A intensidade de fluorescência DCF intracelular, que é excitada a 485 nm e emitida a 530 nm, foi detectada usando um leitor de microplaca (Synergy-2; BioTek Instruments) para investigar a extensão do estresse oxidativo. Os grupos de teste foram tratados com células SMMC-7721 e células Plc por 24 h, e a sonda ER-Tracker Blue-White DPX (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) foi adicionada às células para incubação por 30 min. Após descartar a solução de carga e lavar as células com PBS, a mudança morfológica do ER foi observada por microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliação da oncose celular e apoptose por citometria de fluxo

De acordo com o protocolo de nosso estudo anterior [28], um ensaio de coloração com isotiocianato de fluoresceína V-Anexina (FITC) / iodeto de propídio (PI) foi usado para avaliar a oncose celular e apoptose induzida por Ats livres e NPs de BSA carregados com Ats. As células foram lisadas com typsina e semeadas em placas de seis poços a uma concentração de l × 10 ⁶ células / mL por 24 h de incubação contínua. Em seguida, o meio de cultura foi removido e meio sem soro contendo Ats livres e BSA NPs carregados com Ats foi adicionado aos poços. Após o tratamento, as células foram coletadas e suspensas em tampão Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Pequim, República Popular da China) contendo Anexina V marcada com PI e FITC (AV-FITC). A alteração morfológica das células foi observada por microscopia confocal de varredura a laser. Para verificar as taxas de apoptose celular e oncose induzida pelos NPs carregados com Ats, as porcentagens de células apoptóticas precoces (Q4), oncóticas (Q2), necróticas (Q1) e vivas (Q3) foram quantificadas por citometria de fluxo.

Análise de Western Blot de proteínas relacionadas à apoptose e citocromo C em células

Um ensaio de Western blot foi realizado para determinar os níveis de proteínas relativas quando Ats livres ou NPs carregados com Ats foram incubados com células SMMC-7721 por 24 h. As células foram lisadas com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) gelado contendo um coquetel de inibidores de protease e inibidores de fosfatase (Roche, Basel, Suíça). As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio BSA modificado (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e normalizadas antes do carregamento em 10% de dodecil sulfato de sódio (SDS) - eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Os níveis das proteínas alvo foram fotografados e analisados ​​usando um sistema de análise de gel UVP (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, EUA).

Resultados

Características de NPs BSA carregados com Ats e estudo de viabilidade celular

Foi observado na Fig. 1a, b que os NPs de BSA carregados com Ats mostraram uma forma esférica e foram homogeneamente dispersos com um PDI inferior de 0,016. O tamanho médio de partícula de BSA NPs carregados com Ats foi de cerca de 99,9 ± 2,3 nm e o potencial zeta foi negativo e avaliado em cerca de –25,6 ± 4,3 mV. O perfil de liberação mostrou uma liberação suave e sustentada que foi mostrada na Fig. 1c. Em comparação com a liberação rápida de Ats livre em meio in vitro, Ats aprisionado no núcleo de BSA NPs foi lentamente difundido do interior de NPs para o meio e mostrou um padrão de liberação suave e sustentado, devido à degradação contínua de BSA. Mais de 85% dos Ats livres foram liberados completamente nas primeiras 6 h, enquanto a quantidade acumulativa total de droga liberada dos NPs na mídia em um período de 48 h foi de 78,9%. Isso indica que os NPs podem controlar a liberação do fármaco por meio da degradação dos biomateriais em um padrão longo e suave, prolongando assim a meia-vida de eliminação, melhorando a concentração sanguínea efetiva e reduzindo a frequência de dosagem.

Caracterização de NPs BSA carregados com Ats. a Imagem TEM de NPs BSA carregados com Ats. b Análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS) dos NPs BSA carregados com Ats obtidos. c O perfil de liberação in vitro de BSA NPs carregados com Ats em solução salina tamponada com fosfato com um pH de 7,4 a 37 ° C por 48 h. Viabilidade de células SMMC-7721 ( d ) e células Plc ( e ) após incubação com diferentes quantidades de Ats livres e NPs de BSA carregados com Ats por 24 h. Os dados são apresentados como a média ± DP ( n =3). ^# P <0,05 contra os Ats livres correspondentes

O MTT foi usado para examinar os efeitos de inibição de Ats livres e BSA NPs carregados com Ats em células SMMC-7721 e células Plc em diferentes intervalos de tempo. Os resultados (Fig. 1d, e) mostraram que a citotoxicidade dos Ats livres aumentou com o aumento da concentração do fármaco, e os NPs BSA carregados com Ats mostraram a citotoxicidade aumentada gradual. Isso provou que os NPs de BSA carregados com Ats e Ats inibiram o crescimento de células tumorais e que a taxa de inibição era dependente da dose de Ats. Em comparação com Ats livres, BSA NPs carregados com Ats demonstraram maior citotoxicidade e maior sensibilidade em ambas as células, e resultaram em maior inibição celular. Como mostrado na Fig. 1d, e, o tratamento de ambas as células com BSA NPs carregados com Ats causou uma diminuição significativa na viabilidade celular em 24 h quando comparado com aquele de Ats livre. Os valores de concentração inibitória máxima de 50% (IC50) para as células SMMC-7721 e células Plc tratadas com NPs BSA carregados com Ats foram 50,1 e 44,9 μg / mL em 24 h, respectivamente, que são comparados com os valores obtidos de 69,2 e 74,9 μg / mL em 24 h em células tratadas com Ats livre. Isso indicou que quando Ats foi carregado em BSA NPs, ele pode mudar sua localização intracelular, como mediada pelos NPs e, finalmente, matou mais células.

Captação celular in vitro de NPs BSA

A distribuição intracelular e a localização de BSA NPs em ambos os tipos de células tumorais foram observadas por microscopia confocal de varredura a laser, como mostrado na Fig. 2. Após NPs marcados com rodamina B serem co-cultivados com células por 3 h, fluorescência vermelha foi claramente vista no citoplasma; com o passar do tempo, a maioria dos NPs de BSA foram internalizados intracelularmente e difundidos no citoplasma, exibindo fluorescência vermelha dependente do tempo aumentada. Também foi observado que BSA NPs localizados no citoplasma haviam sido co-localizados com a mitocôndria, como evidente pelo aparecimento de fluorescência amarela, que serviu para indicar que a fluorescência vermelha inerente de NPs marcados com rodamina B e a fluorescência verde emitida por o indicador mitocondrial MitoTracker® green FM foi mesclado. Isso provou que os NPs de BSA internalizados poderiam ser especificamente acumulados dentro das mitocôndrias, destacando a possibilidade de que os Ats pudessem ser entregues às mitocôndrias com a mediação de NPs de BSA.

A distribuição celular in vitro de BSA NPs após serem incubados com diferentes células tumorais. Imagem fluorescente de células SMMC-7721 ( a ) e células Plc ( b ) Barra de escala , 100 μm

Análise do potencial da membrana mitocondrial

Para esclarecer se os NPs de BSA carregados com Ats interferiram com a função mitocondrial após a entrega de Ats na mitocôndria, foram determinadas as alterações no potencial da membrana mitocondrial. A Figura 3 demonstrou que após a coloração com JC-1, a maioria das mitocôndrias em células tumorais tratadas com Ats livre exibiu forte fluorescência vermelha e fraca intensidade de fluorescência verde. Isso sugeriu que a maioria do JC-1 existia em um estado agregado, reforçando a integridade da membrana mitocondrial e um potencial maior. Pelo contrário, quando JC-1 corou as células tratadas com BSA NPs carregadas com Ats, a mitocôndria em ambas as células tumorais exibiu fluorescência verde mais forte, indicando que a membrana mitocondrial foi seriamente danificada e seu potencial foi significativamente diminuído. Tomados em conjunto, provou que Ats foi entregue com sucesso às mitocôndrias com a mediação de BSA NPs, resultando na despolarização da membrana mitocondrial.

Alteração de imagem do potencial de membrana mitocondrial após incubação de Ats livres e NPs de BSA carregados com Ats com células SMMC-7721 e células Plc. Barra de escala , 100 μm

Medição de produção de ROS e coloração do ER

Foi amplamente confirmado que a geração de um grande número de ROS pode causar peroxidação de fosfolipídios na membrana mitocondrial interna e que também pode induzir uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial, resultando na rápida liberação de citocromo C. Usamos DCFH- DA como uma sonda fluorescente para detectar a mudança de ROS. O DCFH-DA passou livremente através da membrana celular para dentro da célula e foi transformado em DCFH por hidrólise de esterase. O DCFH gerado não pode passar pela membrana celular e pode ser facilmente carregado nas células. ROS intracelulares oxidaram DCFH não fluorescente em DCF com uma cor verde fluorescente. Portanto, a detecção de fluorescência DCF pode indicar o nível de ROS intracelular.

Quando ambas as células foram tratadas com Ats livres e BSA NPs carregados com Ats por um determinado período de tempo, a quantidade de ROS intracelulares também aumentou, mostrando uma relação dependente do tempo. Em comparação com Ats livres, a geração de ROS em células SMMC-7721 e células Plc tratadas com BSA NPs carregados com Ats foi significativamente aumentada. As Figuras 4a demonstraram que os níveis de ROS em células SMMC-7721 e células Plc expostas a BSA NPs carregados com Ats por 48 h foram aumentados para 1,53 vezes e 1,28 vezes, respectivamente, quando comparados com células SMMC-7721 e células Plc tratadas com Ats grátis. Isso apoiou a ideia de que os NPs aceleraram a produção de ROS intracelulares. Em comparação com o grupo de controle e Ats livres, e depois de ser tratado com BSA NPs carregados com Ats, a intensidade de coloração de fluorescência do ER-Tracker Blue-White DPX como um corante específico de ER foi significativamente aumentada, sugerindo que o estresse ER também foi desencadeado nas células tratadas com NPs carregadas com Ats com um aumento correspondente no nível de ROS. Este achado destacou que Ats estava especificamente localizado na mitocôndria, mediada por NPs de BSA; isso levou a um aumento significativo no nível de radicais livres de oxigênio dentro das células, desencadeando assim a indução de estresse ER e ativando a via mitocondrial para induzir a apoptose celular dependente de caspase.

Quantificação da geração de ROS em células tratadas com Ats livres e NPs de BSA carregados com Ats em momentos diferentes ( a ) Coloração ER com a sonda ER-Tracker Blue-White DPX ( b ) Barra de escala , 100 μm. Os dados são apresentados como a média ± DP ( n =3). ⁺ P <0,05 versus o grupo de controle às 12 h, * P <0,05 versus o grupo de controle em 24 h, ^# P <0,05 versus o grupo controle em 24 h

Avaliação de apoptose e necrose celular

As células foram tratadas por um ensaio de coloração com Anexina V-FITC / PI. As células vivas não se ligaram à anexina V-FITC / PI, portanto, não apareceu fluorescência. As células apoptóticas não se ligaram ao PI, mas foram coradas com Anexina V-FITC, produzindo fluorescência verde. Ao contrário, para as células oncóticas, suas membranas celulares foram danificadas em certa medida, e os núcleos celulares foram dilatados para se quebrar em pedaços, apresentando fluorescência verde e vermelha. Como mostrado na Fig. 5a, em comparação com o grupo de controle, quando NPs carregados com Ats e Ats livres foram incubados com células por 24 h, fluorescência verde e vermelha forte foi observada nas células, indicando que NPs BSA carregados com Ats e Ats livres oncose e apoptose de células tumorais induzidas. Especialmente depois de ser tratado com BSA NPs carregados com Ats, as intensidades de fluorescência de coloração obtidas a partir de Anexina V-FITC e PI foram significativamente aumentadas, sugerindo que os graus de oncose e apoptose foram significativamente aumentados nas células tratadas com NPs carregados com Ats.

Morfologia das alterações ultraestruturais de células tratadas com Ats livres e NPs de BSA carregados com Ats usando o ensaio de coloração com Anexina V-FITC / PI ( a ) Barra de escala , 100 μm. Análise de citômetro de fluxo da apoptose celular e oncose após 24 h de incubação com os NPs de BSA carregados com Ats e Ats livres, respectivamente ( b )

As porcentagens de células apoptóticas precoces (Q4), oncóticas (Q2), necróticas (Q1) e vivas (Q3) foram mostradas na Fig. 5b. Este achado demonstrou que quando as células foram tratadas com Ats livres, as taxas oncóticas foram gradualmente aumentadas para 24,4 e 4,6%, e a taxa apoptótica permaneceu em 4,9 e 7,1% em células SMMC-7721 e células Plc, respectivamente, sugerindo que Ats livres desencadeados a ocorrência de oncose e apoptose para levar à morte celular. Pelo contrário, os NPs de BSA carregados com Ats melhoraram significativamente a taxa de apoptose e oncose celular. As razões apoptóticas aumentaram significativamente para 10,9% nas células SMMC-7721 e para 11,5% nas células Plc. As razões oncóticas aumentaram para 29,0% nas células SMMC-7721 e para 21,6% nas células Plc. Isso indicou que a entrega mitocondrial de Ats com a mediação de BSA NPs acelerou a morte de células tumorais, aumentando os efeitos oncóticos e apoptóticos. NPs de BSA carregados com Ats desencadearam o processo de transdução de sinal apoptótico e promoveram a reação em cascata mediada pela mitocôndria de apoptose celular.

Análise de Western Blot

Para explorar a dependência da morte celular na apoptose induzida por Ats livres e NPs carregados com Ats, um ensaio de western blot foi realizado para detectar a expressão de proteínas de apoptose. Verificou-se que em células SMMC-7721 tratadas com NPs carregadas com Ats, o nível de expressão intracelular da proteína Bax foi significativamente aumentado (Fig. 6). Este achado sugeriu que, com a ajuda de NPs BSA, Ats foi acumulado na mitocôndria e causou disfunção mitocondrial. A proteína monomérica citoplasmática Bax foi transferida para a membrana externa da mitocôndria e passou por oligomerização, formando um canal de proteína na membrana externa da mitocôndria, conduzindo assim ainda mais a um aumento na permeabilidade da membrana. O nível de expressão do citocromo C no citoplasma também foi particularmente e significativamente aumentado, e as expressões da caspase-3 e caspase-9 demonstraram uma tendência ascendente. Portanto, devido à maior permeabilidade da membrana da mitocôndria, o citocromo C foi rapidamente liberado no citoplasma, ativando proteínas sinalizadoras de morte celular (caspases) e promovendo a reação em cascata da apoptose celular. Em contraste, os Ats livres não tiveram diferença significativa na expressão de proteínas relacionadas à apoptose e do citocromo C, sugerindo que os Ats livres não desencadearam a apoptose celular mediada pela mitocôndria e dependiam principalmente da oncose para levar à morte celular. Os NPs de BSA aumentaram o acúmulo da droga na mitocôndria e ativaram os efeitos apoptóticos mediados pelas mitocôndrias, levando assim a apoptose significativa e aumentando as expressões das proteínas primárias relevantes para a apoptose, como mostrado em nossas análises de western blot.

Análises de Western blot dos níveis de expressão de caspase-3, caspase-9, Bax e citocromo C clivadas em células SMMC-7721. * P <0,05 versus a expressão da proteína Bax do grupo controle; ^# P <0,05 versus a expressão da caspase-3 clivada do grupo de controle; ⁺ P <0,05 versus a expressão da proteína caspase-9 do grupo controle; ^x P <0,05 versus a expressão da proteína do citocromo C do grupo de controle. Os dados foram apresentados como a média ± DP ( n =3)

Discussão

Oncose e apoptose representam as duas maneiras diferentes pelas quais as células morrem. A apoptose é um processo ativo de morte celular programada que ocorre em organismos multicelulares. A oncose, por outro lado, descreve uma morte celular independente da caspase que é caracterizada por edema, aumento da permeabilidade e ruptura da membrana, que costuma ser chamada de necrose. Acredita-se que essa forma de morte celular seja acidental e não controlada. Com base em nossa investigação, descobrimos que os Ats inibiram o crescimento das células tumorais e que a taxa de inibição era dependente da dose de Ats. As Ats dependiam principalmente do grau de oncose e levavam à morte celular; também ativou a morte celular independente da caspase na forma de oncose. Por outro lado, e separadamente da ocorrência de morte semelhante à oncose óbvia, quando as células tumorais foram tratadas com BSA NPs carregados com Ats, BSA NPs carregados com Ats foram internalizados no citoplasma e foram rapidamente localizados dentro da mitocôndria para liberar Ats, conforme mediado por os NPs. Os Ats nas mitocôndrias geraram ROS e desencadearam estresse no ER; ele ativou ainda mais a via apoptótica de células dependentes de caspase meditada por mitocôndrias, reduzindo o potencial de membrana mitocondrial, liberando citocromo C e promovendo as expressões de proteínas de Bax, caspase 3 clivada e caspase 9. Juntos, NPs BSA carregados com Ats aumentaram o A entrega mitocondrial de Ats e aumentou o grau de oncose e apoptose para induzir a morte celular, aumentando assim a citotoxicidade do fármaco e induzindo morte celular significativa.

Conclusões

Resumidamente, esclarecemos que os Ats livres nas células tumorais eram fortemente dependentes do grau de oncose para inibir a proliferação de células tumorais na forma de uma morte semelhante à oncose; assim, a citotoxicidade do fármaco era limitada e indesejável. Em contraste, os NPs de BSA carregados com Ats ativaram a via apoptótica mitocondrial e simultaneamente desencadearam efeitos oncóticos; juntos, eles aumentaram a eficácia antitumoral sinérgica de Ats. The results of this study highlighted the significance of Ats-loaded BSA NPs in the enhancement of the cytotoxic and apoptotic effects of Ats, and they further signify the role of BSA NPs in diversifying the pathways of cell death induced by Ats. Compared with free Ats, Ats-loaded BSA NPs induced greater cytotoxicity and significant cell apoptosis effects in tumor cells.

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