Avaliação das propriedades antimicrobianas, apoptóticas e de entrega de genes de células cancerosas de nanopartículas de ouro protegidas por proteína sintetizadas a partir do fungo micorrízico comestível Tricholoma crassum

Resumo

A biossíntese de nanopartículas de ouro de formas geométricas distintas com revestimentos de proteína altamente funcionais sem etapas de cobertura adicionais raramente é relatada. Este estudo descreve a síntese verde de nanopartículas de ouro revestidas de proteína pela primeira vez a partir do fungo micorrízico comestível Tricholoma crassum (Berk.) Sacc . As nanopartículas tinham tamanho na faixa de 5 a 25 nm e formas diferentes. A análise espectroscópica mostrou desvio para o vermelho dos máximos de absorção com período de reação mais longo durante a produção e desvio para o azul com aumento do pH. Estes foram caracterizados por espectroscopia, SEM, TEM, AFM, XRD e DLS. O tamanho das partículas pode ser alterado alterando os parâmetros de síntese. Estes tinham atividade antimicrobiana potente contra bactérias, fungos e bactérias patogênicas multirresistentes. Eles também tiveram efeito inibitório na cinética de crescimento de bactérias e na germinação de esporos de fungos. Estes mostraram propriedades apoptóticas em células eucarióticas quando testados com ensaios cometa. Além disso, as partículas são tampadas com uma proteína natural de 40 kDa que foi utilizada como locais de fixação para genes a serem entregues em células de câncer de sarcoma. O presente trabalho também buscou otimizar a dosagem segura dessas nanopartículas por meio de ensaios de hemólise, para aplicação em terapia. A produção em larga escala das nanopartículas em fermentadores e outras aplicações possíveis das partículas foram discutidas.

Histórico

Com a aplicação inevitável e generalizada de nanopartículas na agricultura, medicina e produtos domésticos, há uma pressão crescente para entender os efeitos nocivos e as formas de reduzi-los [1]. A síntese verde de nanomateriais utilizando organismos vivos ou suas enzimas tem a vantagem de ser ecologicamente correta, econômica e segura para usos terapêuticos [2]. Entre os micróbios, os fungos filamentosos têm maior capacidade de sintetizar nanopartículas devido à sua capacidade de secretar maiores quantidades de enzimas [3, 4]. Nanopartículas de ouro extracelular (AuNPs) foram produzidas usando vários fungos [5,6,7], mas apenas algumas menções de revestimentos de proteínas naturais sobre essas partículas nesses relatórios [8, 9].

Na medicina, com o advento das bactérias multirresistentes, as nanopartículas são a alternativa de escolha, uma vez que não geram resistência [10]. AuNPs são especificamente promissores em terapia e diagnóstico de células tumorais e entrega de genes baseados em nanocarreadores [11,12,13]. Em condições fisiológicas, AuNPs mostram baixa permeabilidade através da membrana celular, mas em células tumorais, a captação é aumentada devido ao efeito de permeabilidade e retenção (EPR) melhoradas [14]. Essa captação é ainda mais aumentada quando os AuNPs são tampados com proteínas. A tampa protéica ajuda a estabilizar as nanopartículas no estado coloidal e fornece locais de encaixe para drogas ou genes para entrega [14]. No entanto, o processo de nivelamento envolve etapas adicionais. O fornecimento de tampa de proteína natural elimina a aplicação de vias químicas que são principalmente perigosas [5]. Apesar de sua importância, existem relatos limitados envolvendo a síntese verde de nanopartículas de metais nobres com revestimentos de proteínas naturais [15, 16].

Antes da aplicação dos AuNPs na terapia, um aspecto importante a ser testado é a biocompatibilidade de um nanomaterial com as membranas celulares [6]. Outro aspecto é a citotoxicidade e AuNPs podem agregar células vermelhas do sangue [13]. Portanto, a ênfase deve ser colocada nos aspectos perigosos e usá-la dentro de limites seguros [7, 17].

Nosso laboratório relatou até agora o único fungo micorrízico comestível a produzir nanopartículas de prata extracelulares, sendo o fungo Tricholoma crassum (Berk.) Sacc [2]. Aqui, descrevemos a síntese verde de AuNPs de T. crassa da faixa de tamanho 5–25 nm e de diferentes formas. Estes foram caracterizados e testados quanto à atividade antimicrobiana contra bactérias, fungos, bem como bactérias patogênicas multirresistentes (MDR). Estes tiveram efeito inibitório na cinética de crescimento das bactérias e na potência dos esporos dos fungos. Mais importante ainda, as partículas são naturalmente revestidas de proteína. Testamos a eficácia dessas partículas como veículo para a entrega de genes em células cancerosas. O ensaio de hemólise foi realizado para verificar a biocompatibilidade e toxicidade dessas partículas. As propriedades apoptóticas dos AuNPs foram testadas com ensaios cometa em células eucarióticas para estimar uma concentração viável para uso terapêutico com efeitos colaterais mínimos. O presente trabalho, portanto, tenta otimizar a síntese e aplicação dos AuNPs na interface médica e nanotecnológica dentro de limites seguros de modo a causar danos ambientais e biológicos mínimos.

Métodos

Fungos, bactérias e condições de crescimento das plantas

Tricholoma crassum (Berk.) Sacc. foi usado para a produção de nanopartículas. Para ensaios antimicrobianos, E. coli (DH5α), Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), cepas multirresistentes a drogas (MDR) de E. coli (DH5α) e A. tumefaciens (LBA4404). Os fungos fitopatogênicos Magnaporthe oryzae e Alternaria solani foram usados. Mudas de tomate (variedade Pusa Ruby) e tabaco (variedade SR1) foram cultivadas em solo em câmaras de crescimento com fotoperíodos claro / escuro de 16:8 h, 28 ± 1 ° C e intensidade de luz de 50 μmol m ^{- 2} s ^{- 1} .

Síntese de AuNPs

T. crassa o micélio foi cultivado em caldo de dextrose de batata (PDB) por 7 dias a 28 ° C. 1 g de tapete micelial foi agitado com 10 ml de água desionizada em um agitador a 50 RPM por 24, 48 e 72 h a 28 ° C. Os sobrenadantes foram filtrados através de papel de filtro Whatman no. 1. O filtrado celular (pH 5,2) foi incubado com solução aquosa 1 mM de cloroaurato (HAuCl ₄ ) e agitado a 28 ° C no escuro de acordo com nosso relatório [2] por 1 h para cada tipo de filtrado celular feito por 24, 48 e 72 h de incubação com micélio.

Para a biossíntese de AuNPs em diferentes pH, 1 M HCl ou 1 M NaOH foi usado para ajustar o pH do filtrado livre de células para faixa ácida (3,5) e faixa alcalina (7, 8 e 9) antes da incubação. AuNPs também foram sintetizados usando diferentes temperaturas de reação (0, 15, 28, 75 e 100 ° C), diferentes concentrações de filtrado livre de células (× 0,5, × 1, × 2) e íons cloroaurato (0,5, 1, 2 mM )

Espectroscopia UV-visível

A absorvância dos sobrenadantes de cada filtrado celular incubado por 1 h com solução de cloroaurato foi analisada usando espectrofotômetro UV-visível entre 450 e 750 nm foi usado para traçar os espectros de absorvância.

Microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia de força atômica (AFM) e difração de raios-X (XRD)

Essas análises foram feitas de acordo com Chowdhury et al. [15] com poucas modificações. Nanopartículas de ouro produzidas usando filtrados de células de 24 h seguidas por 1 h de incubação com HAuCl 1 mM ₄ solução a 28 ° C (pH 5,5) foi caracterizada usando microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia de força atômica (AFM) e difração de raios-X (XRD). Uma fina película de AuNPs em um stub de vidro foi seca a vácuo e submetida a MEV com FEI Quanta 200 (FEI, EUA).

As formas e tamanhos do AuNP foram determinados por TEM. Uma gota (10 μl) da suspensão de AuNP foi colocada em grades de cobre revestidas com carbono e submetida a dessecação a vácuo antes de carregar em um suporte de amostra. Micrografias TEM dessas nanopartículas foram obtidas usando TECNAI G TEM com uma construção de baixa voltagem (100 kV).

Para a imagem AFM, AuNPs foram depositados em uma folha de mica Ruby de muscovita recém-clivada (Ruby Mica Co. Ltd., Índia) e foram secos usando um secador a vácuo. A AFM no modo de corrente acústica alternativa (AAC) foi realizada usando um Pico mais 5500 ILM AFM (Agilent Technologies, EUA).

Para o estudo de XRD, um filme fino de suspensão de AuNP foi espalhado uniformemente em uma lâmina de vidro e foi seco usando secador a vácuo. Os padrões de XRD foram registrados em um sistema D8 Advance DAVINCI XRD (Bruker AXS Pvt. Ltd.) operado a uma voltagem de 40 kV e uma corrente de 40 mA com radiação CuKα (λ =1,54060 / 1,54443 Å), e as intensidades difratadas foram registradas de ângulos 2θ de 35 ° a 80 °.

Análise de software de computador

A mensuração dos AuNPs e a construção do histograma foram realizadas com a ferramenta MEASURE IT do software OLYMPUS. A concentração de nanopartículas foi calculada de acordo com Sriram et al. [18] e nossa publicação anterior, Chowdhury et al. [15].

Transformação de bactérias para desenvolver resistência a vários medicamentos

A. tumefaciens estirpe LBA4404 e E. coli cepa DH5α foram feitas multirresistentes a drogas por transformação usando os plasmídeos pCAMBIA2301 e pUC19 com pZPY112, respectivamente, usando nosso protocolo publicado [2, 15].

Ensaios antibacterianos e ensaios de crescimento bacteriano

Esses ensaios foram realizados de acordo com nosso protocolo publicado [15]. Nanopartículas de ouro, que foram sintetizadas usando filtrados de células de 24 horas e 1 hora de incubação com HAuCl 1 mM ₄ solução a 28 ° C (pH 5,5), para todos os ensaios biológicos. Para ensaios de disco de papel, quantidades crescentes de AuNPs polidispersos (0,249, 0,498, 0,747, 0,996, 1,245 μg) foram usadas. De culturas frescas durante a noite de cada cepa bacteriana, uma alíquota de 25 μL foi espalhada em placas de ágar LB As séries de diluição da solução de nanopartículas foram feitas usando solução de AuNP de concentração 31,121 mg / L e água desionizada estéril. Discos de papel estéril de 5 mm de diâmetro com quantidade crescente de nanopartículas de ouro em cada disco, como 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 e 1,245 μg (em um volume total de 40 μl) foram colocados nas placas bacterianas e incubados. A. tumefaciens as placas foram incubadas a 28 ° C durante 48 h e E. coli a 37 ° C durante 12 h. Para os ensaios de crescimento de DH5α e LBA4404, 7,5 ml de cultura bacteriana foram suplementados com 2,5 ml de AuNPs.

Ensaio antifúngico

Suspensão aquosa de M. oryzae esporos foram feitos em 6,1 × 10 ⁵ esporos / ml com um hemocitômetro. 150 μl desta suspensão foram espalhados na placa MEA. Discos de papel estéril de 5 mm de diâmetro com quantidades crescentes de AuNPs polidispersos (0,249, 0,498, 0,747, 0,996 e 1,245 μg) foram colocados nas placas e incubados a 28 ° C. As zonas de inibição foram medidas após 2 dias.

Ensaio antimicrobiano para células bacterianas tratadas com AuNPs

A cultura LBA4404 líquida durante a noite foi tratada com igual volume de suspensão de AuNP (15,56 mg / L) por 12 h em 28 ° C. 50 μl da suspensão foram misturados com volume igual de solução de azul de tripano a 0,4% (0,5 g de azul de tripano, 500 ml de glicerol, 450 ml de H destilado ₂ O, 50 ml de HCL) foi observado sob microscópio composto (Leica DMLS, Alemanha).

Ensaio de germinação de esporos de fungos na presença de AuNPs

Uma série de diluições de nanopartículas foi feita com 20, 40, 60, 80 e 100% v / v usando solução estoque de nanopartículas de concentração de 15,56 mg / L tornando o volume final de 100 μl com água. Volumes iguais dessas suspensões foram adicionados a 50 μl Alternaria solani suspensão de esporos (4,2 × 10 ⁵ esporos / ml) e incubados a 28 ° C. Os esporos foram observados em 0, 2, 4 e 6 h sob microscópio composto (Leica DMLS, Alemanha).

Ensaios de cometa

As propriedades apoptogênicas dos AuNPs foram medidas por ensaio cometa padrão [19] com poucas modificações. As folhas de tabaco ou tomate foram expostas a concentrações crescentes (0, 15, 20 e 30% v / v para tabaco; 5, 10, 15 e 20% v / v para tomate) de AuNPs (estoque de 15,56 mg / L) por 24 h. A eletroforese de núcleos isolados foi conduzida a 0,74 V / cm (25 V, 300 mA) durante 30 min a 4 ° C. As lâminas foram neutralizadas com tampão Tris 0,4 M, desidratadas em metanol, coradas com brometo de etídio (20 μg / ml) e observadas em microscópio de fluorescência com filtro de excitação de 515-560 nm e filtro de barreira de 590 nm. Os dados foram analisados ​​com o software Tritek CometScore.

SDS-PAGE

As proteínas foram isoladas de acordo com nossa publicação [15]. Para análise das proteínas ligadas às nanopartículas, os AuNPs foram lavados com água estéril e fervidos em tampão Laemmli por 10 min e centrifugados a 8.000 rpm por 10 min. As amostras tratadas com SDS e não tratadas foram executadas em SDS-PAGE a 12%.

Cultura de linhagem de células cancerosas

A linha celular Sarcoma 180 foi cultivada em meio RPMI 1640 [20] contendo 10% de soro fetal bovino, 200 U / ml de penicilina e 200 μg / ml de estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO ₂ em incubadora umidificada.

Entrega do complexo plasmídeo DNA-AuNP em células cancerosas

O plasmídeo foi isolado de DH5α contendo pCAMBIA1302 usando protocolo publicado [15]. O plasmídeo contendo a construção de gfp sequência clonada sob o promotor pCaMV35s foi entregue em células Sarcoma 180 usando protocolo padrão [21]. As células foram visualizadas em microscópio de fluorescência usando filtro específico para GFP (excitação máxima =395 nm) (Axioskop-40, Carl Zeiss). As células tratadas com DNA de plasmídeo nu foram mantidas como um controle.

Ensaio hemolítico

O ensaio hemolítico foi feito seguindo o protocolo padrão [22]. Volumes iguais de eritrócitos (1,6 × 10 ⁹ eritrócitos / mL) foram tratados com concentrações variáveis ​​de AuNPs (0,1, 0,5, 1, 5, 10 e 20 μl / mL de um estoque 15,56 mg / L) por 1 he as atividades hemolíticas das nanopartículas em diferentes concentrações foram calculadas.

Resultados e discussão

Biossíntese de AuNPs a pH 5,5

Durante a síntese, a formação do AuNP é indicada pela mudança na cor do filtrado celular de amarelo claro para violeta [23] devido à mudança na ressonância plasmônica de superfície (SPR). HAuCl 1 mM ₄ solução sem filtrado fúngico era amarelo esverdeado (Fig. 1a, ‘A’) e o filtrado celular de T. crassa que era amarelo claro (Fig. 1a, 'B'). Após a incubação, a cor da mistura mudou para violeta dentro de 1 h (Fig. 1a, ‘C’), indicando a formação de AuNPs.

Biossíntese de AuNPs usando Tricholoma crassum e análise espectroscópica. a Mudança de cor durante a reação. A Solução 20 mM de HAuCl ₄ . B Filtrado celular livre de micélio de Tricholoma crassum . C HAuCl 1 mM ₄ com filtrado de células de 24 horas por 1 hora mostrando cor violeta indicando síntese de AuNPs. b Os espectros de UV-vis dos AuNPs sintetizados com diferentes períodos de incubação (24, 48, 72 h). A seta sólida mostra o pico de absorção a 552 nm durante o período de incubação de 24 horas. A seta tracejada mostra um ligeiro desvio para o vermelho dos máximos de absorção com o aumento do período de incubação. c AuNPs sintetizados sob diferentes pH apresentando cores diferentes. d Espectros UV-vis do mesmo. A seta sólida mostra o pico de absorção a 552 nm para pH 5,5 e a seta tracejada indica o deslocamento para o azul dos máximos de absorção com aumento do pH

Uma desvantagem de outros métodos de produção de nanopartículas a partir de microrganismos é que eles são demorados e os organismos produzem toxinas. Anteriormente, Phanerochate chrysosporium extrato livre de células foi utilizado para produzir AuNPs em 90 min [3]. Recentemente, nanopartículas de prata e ouro foram biossintetizadas usando Sporosarcina koreensis usando um tempo de reação estendido de 1-2 dias [24]. Em nosso relatório, o tempo de produção de AuNP foi reduzido para apenas 1 hora.

Espectroscopia ultravioleta para visível

Os espectros de absorção óptica das nanopartículas metálicas são governados pela forma, agregação e SPR, que mudam de acordo com o tamanho e a forma da partícula [25, 26]. A Figura 1b mostra os espectros de UV-vis de AuNPs sintetizados usando filtrados celulares produzidos ao longo de 24, 48 e 72 h, seguido por 1 h de incubação com HAuCl 1 mM ₄ solução (pH 5,5). Aqui, o pico de absorbância está em 552 nm para o filtrado de células de 24 h. A banda de ressonância de plasmão transversal que aparece primeiro em 552 nm muda ligeiramente em direção ao vermelho de 24 a 48 e 72 h (mostrado como linha sólida vs. linha tracejada Fig. 1b), confirmando um desvio para o vermelho com intensidade de absorvância progressivamente amplificada. O alargamento dos picos indica que as partículas estão polidispersas. O forte SPR centrado em ca. 550-560 nm é típico de ouro coloidal (Fig. 1b). À medida que a concentração do filtrado celular aumentou com o aumento dos períodos de incubação (ou seja, 24, 48, 72 h), a absorvância também aumentou proporcionalmente. Quando a reação foi realizada a 28 ° C, ela atingiu o equilíbrio após 1 h e ficou estável por 30 dias sem evidência de agregação, provavelmente devido ao revestimento protéico estabilizador. Em estudos anteriores, AuNPs revestidos com BSA não mostraram agregação [27]. Outros estudos foram feitos usando AuNPs preparados com filtrado de células de 24 h.

Biossíntese de AuNPs em diferentes pH e espectroscopia UV-vis

Os AuNPs foram sintetizados em diferentes pH de 3,5, 5,5, 7, 8 e 9, resultando em coloração rosa a violeta profundo (Fig. 1c). A espectroscopia UV-vis mostrou os máximos de absorbância, e o comprimento de onda SPR aumentou de pH 3,5 para pH 5,5, resultando em um desvio para o vermelho. No entanto, com o aumento do pH de 7 para pH 9, os máximos de absorbância e o comprimento de onda do SPR diminuíram, mostrando um desvio para o azul (Fig. 1d). O pico em pH 9 teve uma amplitude menor e cor inalterada, indicando que apenas pequenas quantidades de AuNPs foram formadas. Sendo esta uma biossíntese enzimática, o pH 9 provavelmente inibiu a reação enzimática necessária para a formação de AuNPs (Fig. 1d). As nanopartículas produzidas em diferentes pH não agregaram após 1 mês em temperatura ambiente.

Produção de AuNPs usando diferentes temperaturas, concentrações de substrato e concentrações de precursor

A otimização das condições físico-químicas durante a biossíntese é crítica para a geração de nanopartículas funcionalmente eficientes [28]. A síntese usando concentrações mais altas de filtrado mostrou produção aumentada de AuNPs com mais intensidade de cor e máximo de absorbância (Fig. 2a, b). Ligeiro deslocamento para o azul da ressonância plasmônica de superfície localizada máxima (LSPR) foi observado para a síntese com filtrado × 2, indicando aumento da distância entre as partículas e diminuição do tamanho do cluster [29, 30].

Biossíntese e espectroscopia UV-vis de AuNPs de Tricholoma crassum usando diferentes parâmetros de síntese. a , b Diferentes concentrações de filtrado celular. c , d Diferentes concentrações de HAuCl ₄ . e , f Diferentes temperaturas de reação. g , h No escuro e sob a luz. A seta sólida mostra o pico de absorção típico em 552 nm para × 1 filtrado de células e HAuCl 1 mM ₄ a 28 ° C pH 5,5 e a seta tracejada indica o desvio para o azul dos máximos de absorção, a seta pontilhada mostra o desvio para o vermelho na banda SPR

Das três concentrações de cloreto de ouro testadas (0,5, 1 e 2 mM), a síntese foi máxima para 1 mM, com absorção máxima em 552 nm. (Fig. 2c, d). 28 ° C foi considerado ótimo para a síntese. As temperaturas mais altas (75 e 100 ° C), embora mediaram a síntese mais rápida de AuNPs, a cor escura e o desvio para o vermelho do máximo de absorção (Fig. 2e, f) indicaram partículas maiores do que a 28 ° C. A 0 e 15 ° C, não houve desenvolvimento de cor ou pico de absorvância dentro de 550–600 nm. A síntese na luz resultou em coloração violeta profunda (Fig. 2g) e um desvio para o vermelho de absorção máxima com um pico largo (Fig. 2h) significando partículas maiores. O tamanho e o número de partículas foram testados com DLS (Fig. 3a-j). Esta variação no tamanho e agregação das nanopartículas depende da natureza e da quantidade de matéria orgânica associada [30], que novamente varia com as condições de síntese.

DLS mostrando distribuições de tamanho dos AuNPs sintetizados a com × 1 filtrado livre de células, HAuCl4 1 mM a 28 ° C no escuro, b sob luz, c com × 0,5 filtrado livre de células, d com × 2 filtrado livre de células, e a 0 ° C, f a 15 ° C, g a 75 ° C, h a 100 ° C, i com HAuCl 0,5 mM ₄ e j com HAuCl 2 mM ₄

Microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

SEM mostrou AuNPs de tamanhos pequenos e formas geométricas distintas com ampliação de 80000 × (Fig. 4a). A análise TEM mostrou claramente AuNPs polidispersos no intervalo de tamanho de 2–22 nm de diâmetro (Fig. 4b). O gráfico de distribuição de tamanho mostra que AuNPs na faixa de tamanho 5–10 nm foram da maior frequência seguida sucessivamente por 2–5 nm, 10–15 nm, 15–20 nm e 20–22 nm (Fig. 4c). Estes eram de diferentes formas geométricas, como pequenos circulares ou rombóides com diâmetro de 5 nm ou menos, hexágonos, cubóides, triângulos isósceles e triângulos quase equiláteros com lados variando de 4,36 a 22,94 nm (Fig. 4d, e).

Microscopia eletrônica dos AuNPs. a SEM com ampliação de × 80.000. b TEM mostrando partículas dispersas de diferentes tamanhos em um campo microscópico. c Um histograma que mostra a distribuição do tamanho de partícula dos AuNPs. Visão ampliada de AuNPs individuais mostrando diferentes formas geométricas e suas representações diagramáticas com dimensões. d Esférica (esquerda) e romboidal (direita) de pequena variação. e Da esquerda:hexagonal, triangular equilátero, romboidal, poliédrica e triangular isósceles

Microscopia de força atômica (AFM)

A Figura 5a mostra uma imagem AFM dos AuNPs dispersos. A vista bidimensional (Fig. 5a) mostra que as partículas tinham espessura de superfície quase semelhante. As alturas dessas partículas foram visualizadas com AFM 3D de superfície única (Fig. 5b). O gráfico AFM 2D dos AuNPs situados em uma zona linear aleatória (marcada com linha pontilhada, Fig. 5c) mostra alturas que variam de 1 a 4 nm. A banda de plasmon de superfície plana indicou que a espessura das partículas era menor do que o comprimento da borda.

AFM e difração de raios-X das AuNPs. a Imagem AFM:vista superior. b Imagem AFM:vista tridimensional. c Uma imagem AFM de AuNPs e perfil gráfico para alturas das nanopartículas na linha pontilhada no campo. d Padrão de difração de raios-X das nanopartículas mostrando picos típicos de ouro

Estudos de difração de raios-X (XRD)

O padrão de XRD de filme fino das partículas revelou a presença de apenas AuNPs. Um forte pico de difração em torno de 38 ° é geralmente atribuído à faceta {111} da estrutura cúbica centrada na face (FCC) [3]. O padrão de XRD aqui mostrou um pico de difração dominante em 38,23 atribuído à estrutura FCC. Os picos de difração de outras quatro facetas eram mais fracos. Os quatro picos de difração de Bragg distintos em 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 e 81,63 corresponderam de perto aos AuNPs (Fig. 5d, Arquivo adicional 1:Tabela S1).

Cálculo da concentração de AuNPs

A concentração das nanopartículas [15] foi de 15,56 mg / L para partículas produzidas com filtrado de células de 24 h incubado com HAuCl 1 mM ₄ .

Ensaio antimicrobiano dos AuNPs usando bactérias e fungos patogênicos

Os AuNPs exibiram fortes atividades antimicrobianas contra bactérias humanas, bem como bactérias patogênicas de plantas e fungos. A atividade antimicrobiana das nanopartículas foi avaliada usando discos de papel com quantidades crescentes de AuNP, ou seja, 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 e 1,245 μg. Bactéria humana E. coli (DH5α), a bactéria patogênica de plantas A. tumefaciens (LBA4404) e o fungo fitopatogênico M. oryzae foram usados. Os AuNPs foram inibidores para todos esses microrganismos, mesmo nas concentrações mais baixas, e as zonas de inibição aumentaram proporcionalmente ao aumento na concentração de partículas (Fig. 6). A Figura 6a-c mostra que as zonas de inibição para E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) e M. oryzae , respectivamente. A Figura 6f-h mostra o gráfico das zonas de inibição desses três micróbios em função da quantidade de AuNPs usados. O extrato fúngico sozinho não teve nenhum efeito inibitório. A tendência comparativa de inibição para os três micróbios indica um maior efeito inibitório sobre DH5α em comparação com LBA4404 e M. oryzae (Arquivo adicional 2:Fig. S1a).

Ensaio de propriedades antimicrobianas de AuNPs em bactérias patogênicas, fungos e bactérias multirresistentes (MDR). a , f Placas e gráficos correspondentes mostrando o ensaio de difusão em disco das nanopartículas com zonas de inibição crescentes para E. coli . Zonas de inibição obtidas em ensaios semelhantes com b , g Agrobacterium tumefaciens . c , h Magnaporthe oryzae . d , i MDR E. coli . e , j MDR A. tumefaciens . Todos os experimentos foram feitos com quantidades crescentes de AuNPs em discos de papel; no sentido horário a partir do topo:0,249 μg (20%), 0,498 μg (40%), 0,747 μg (60%), 0,996 μg (80%) e 1,245 μg (100%) de AuNPs. Os dados são médias ± SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras ( P <0,05, teste HSD de Tukey). Efeito de AuNPs na curva de crescimento de k E. coli , l A. tumefaciens , m MDR E. coli e n MDR A. tumefaciens . Os asteriscos indicam diferenças significativas para o controle (Student’s t teste, P <0,05). o Microscopia de controle A. tumefaciens células. p A. tumefaciens mostrando perda de integridade celular após o tratamento com AuNPs

Ensaio de atividade antimicrobiana de AuNPs usando bactérias multirresistentes a humanos e plantas patogênicas

Foram produzidos DH5α e LBA4404 multirresistentes a fármacos (MDR), contendo plasmídeos com genes de resistência. O MDR DH5α contendo pUC19 era resistente a 100 μg / ml de Ampicilina e 35 μg / ml de Cloranfenicol. LBA4404 transformado com pCAMBIA2301 foi resistente a 25 μg / ml de rifampicina e 50 μg / ml de canamicina. Os AuNPs mostraram atividade inibitória potente contra MDR DH5α e MDR LBA4404 (Fig. 6d, e). As Figuras 6i, j são os gráficos que mostram o aumento da inibição com o aumento da concentração das nanopartículas. A tendência comparativa de inibição para as duas bactérias MDR indica maiores zonas inibitórias para A. tumefaciens em comparação com a de E.coli (Arquivo adicional 2:Fig. S1b).

Ensaio de crescimento bacteriano ao longo do tempo na presença de AuNPs

A curva de crescimento de DH5α tratada com AuNPs foi significativamente diferente do conjunto de controle (Fig. 6k, m). Nos conjuntos de controle de DH5α e MDRDH5α, a fase log da curva de crescimento começou dentro de 2 h após a inoculação, enquanto em DH5α tratada com AuNP e MDR DH5α, nenhum crescimento foi observado até 6 h após a inoculação. As curvas de crescimento atingiram a fase estacionária após 12 h nas células controle e tratadas, mas o crescimento foi significativamente reduzido no caso das bactérias tratadas. A curva de crescimento LBA4404 mostrou o início da fase log em 4 h após a inoculação no conjunto de controle versus 6 h no conjunto tratado com AuNP. Efeito semelhante na curva de crescimento de MDR LBA4404 foi observado, embora no controle MDR LBA4404, a fase log começou dentro de 2 h (Fig. 6l, n).

Efeito de AuNPs na morfologia e viabilidade das células bacterianas

Em geral, a maioria das nanopartículas pode aderir com eficiência às membranas celulares, ser adsorvidas e, posteriormente, afetar a integridade celular [31]. Normal A. tumefaciens as bactérias são em forma de bastonete com contornos claros (Fig. 6o). As bactérias quando incubadas com AuNPs apresentaram morfologia distorcida, desintegração da membrana externa resultando em contorno irregular e perda de integridade da forma e tamanho da célula (Fig. 6p). Isso está de acordo com o observado anteriormente em E. coli células tratadas com nanopartículas de sílica [32]. Descobrimos que a incubação de células bacterianas com as nanopartículas por períodos mais longos mostrou a desintegração completa das células.

Ensaio de germinação de esporos de fungos

Os AuNPs foram um potente supressor de virulência do fungo fitopatogênico Alternaria solani . O tratamento de conídios fúngicos com doses crescentes de AuNPs para diferentes períodos de incubação mostrou diminuição gradual das frequências de germinação e do comprimento dos tubos germinativos (Fig. 7a). As imagens representativas dos conídios (Fig. 7a) e os gráficos mostram que a porcentagem de germinação (Fig. 7b) e os comprimentos médios dos tubos germinativos (Fig. 7c) emergindo dos conídios fúngicos diminuíram com o aumento das doses das partículas e o aumento da incubação períodos. Assim, esses AuNPs possuem propriedade antifúngica significativa, que é mediada pela supressão da germinação de esporos e retardo no crescimento de hifas.

Efeito dos AuNPs na germinação de esporos de fungos fitopatogênicos Alternaria solani ; a Esporos após tratamento com AuNPs (barra =30 μm). Linhas de cima para baixo:esporos de controle seguidos por esporos tratados com diferentes diluições de AuNPs (estoque 15,56 mg / L). Colunas da esquerda para a direita:aumento do tempo de incubação com AuNPs mostrando menos germinação em 6 h de incubação com 100% de AuNPs. b Frequência de germinação de esporos (%) em diferentes concentrações de AuNPs em função do tempo de incubação. Os asteriscos indicam diferenças significativas para o controle (Student’s t teste, P <0,05). c Comprimento médio do tubo germinativo em diferentes concentrações de AuNPs em função do tempo de incubação. Os dados representam as médias ± SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras ( P <0,05, teste de intervalo múltiplo de Duncan). A frequência de germinação de esporos e o comprimento médio do tubo germinativo diminuíram com o aumento das doses de AuNPs e o aumento do período de incubação

Assim, esses AuNPs têm funções antimicrobianas em bactérias, bem como em fungos, o que raramente é relatado para AuNPs. Esses AuNPs sendo tóxicos para bactérias humanas resistentes a múltiplos fármacos podem ser utilizados no tratamento de MDR ou doenças humanas relacionadas com bactérias extensivamente resistentes a fármacos (XDR) que são difíceis de tratar. Além disso, o efeito antimicrobiano contra fitopatógenos típicos como Agrobacterium e fungos, torna as partículas adequadas como bactericidas e fungicidas na forma de nanoagroquímicos. Isso permitiria o manejo sustentável da perda de safra por meio da eliminação do uso excessivo e indiscriminado de agroquímicos, causando deterioração da saúde do solo, degradação do agroecossistema, poluição ambiental e resistência em patógenos [33].

Os AuNPs têm propriedades apoptogênicas potentes

O ensaio eletroforético em gel de célula única ou ensaio cometa é um método sensível para comparar os efeitos apoptóicos de materiais [34, 35]. O tratamento das células da folha do tabaco com 7,78 mg / L de AuNPs por um período de 15, 20 e 30 min resultou em aumento gradual na apoptose indicada pelo aumento na porcentagem de DNA na cauda (Fig. 8a, 'A', 'B' , 'CD'). A migração máxima de DNA ocorreu após 30 min de tratamento mostrando um valor de DNA de cauda 28,44 ± 0,74% que foi significativamente maior do que o das células de controle não tratadas (1,7 ± 0,59%). Os períodos de incubação de 15 e 20 min causaram menor migração de DNA com valores de DNA de cauda de 7,25 ± 2,56 e 19,19 ± 1,54%, respectivamente (Fig. 8b). Portanto, esses AuNPs têm a capacidade de induzir apoptose em células eucarióticas em doses mais elevadas. Recentemente, nanopartículas estão sendo usadas em novas estratégias para direcionar e matar células cancerosas. Conforme ilustrado por imagens dinâmicas e quantitativas, a aplicação bem-sucedida de nanopartículas como uma terapia alternativa para o câncer depende das propriedades apoptóticas das partículas [36]. Portanto, o presente achado mostra propriedades apoptogênicas potentes desses AuNPs que são promissores na terapia futura do câncer.

Ensaio das propriedades apoptóticas dos AuNPs. a Ensaio de cometa e imagens microscópicas fluorescentes de núcleos de folhas de tabaco tratadas com AuNPs para A 0 min. B 15 min, C 20 min e D 30 min (bar =5 μm). Nos conjuntos de controle (0 min de incubação), a maior parte do DNA está localizada na cabeça do cometa, enquanto as células submetidas a um tratamento mais longo mostram danos crescentes no DNA e caudas de cometa mais longas. b Média de% de DNA da cauda ± SE após diferentes períodos de incubação. Os dados representam as médias ± SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras ( P <0,05, teste HSD de Tukey). c Ensaio de dosagem limite de AuNPs para apoptose mostrando imagens de núcleos de células de folhas de tomate tratadas com A 0% (controle), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% de suspensão de AuNP por 24 h (bar =10 μm). d % Média de DNA de cauda ± SE após 24 h de tratamento com diferentes concentrações de AuNPs. Os dados representam as médias ± SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras ( P <0,05, teste HSD de Tukey). Dosagens abaixo de 10% mostram danos insignificantes ao DNA, enquanto superiores a 20% mostram início de danos ao DNA

Esses AuNPs não são apoptogênicos em doses mais baixas

A aplicação segura de nanopartículas metálicas como agente terapêutico necessita de uma pré-determinação do efeito biológico das partículas na toxicidade limítrofe [37]. Um nível de limiar de nanopartículas necessário para apoptose foi obtido através do tratamento de células da folha de tomate com diferentes concentrações de AuNP por 24 h (Fig. 8c). Baixa concentração, por exemplo, 5% v / v de suspensão de estoque de AuNP (15,56 mg / L) não mostrou efeito apoptogênico significativo em células de tomate, mesmo após 24 h de exposição. Os núcleos após o tratamento de AuNP de 10% mostraram 6,52 ± 0,63 porcentagem de DNA na cauda, ​​que foi maior do que os núcleos de controle não tratados (0,95 ± 0,66 porcentagem de DNA na cauda) e aqueles tratados com suspensão de AuNP 5% (1,04 ± 0,89 porcentagem de DNA na cauda ) O tratamento das células da folha do tomate com 15 e 20% de AuNP resultou em um ligeiro aumento no dano ao DNA mostrando 7,15 ± 1,70 e 13,47 ± 2,16 porcentagem de DNA na cauda, ​​mostrando efeito apoptogênico significativo (Fig. 8d). Assim, em doses mais baixas, o efeito apoptogênico é negligenciável, mantendo a possibilidade de essas nanopartículas serem usadas como agente antimicrobiano ou veículo de entrega de fármaco / gene em células eucarióticas.

Os AuNPs são revestidos de proteína

Alguns estudos anteriores mencionaram nanopartículas revestidas com proteínas de origem natural [15]. A ampliação menor TEM mostrou que os AuNPs estão rodeados por material semelhante a uma proteína (Fig. 9a, b). A fim de confirmar a natureza do material, os AuNPs foram lavados e executados em SDS-PAGE junto com extratos livres de células em outras vias (Fig. 9c). A fervura em SDS serviu para separar as proteínas ligadas à superfície das nanopartículas. As nanopartículas fervidas (pista 4) mostraram a presença de uma única banda intensa de 40 kDa que era semelhante a uma banda de proteína presente na pista 2 (filtrado celular). No entanto, na amostra que não foi fervida (pista 3), uma fraca banda de proteína ligada ao AuNP foi vista no nível de 116 kDa. Embora outra banda fraca tenha aparecido no nível de 40 kDa devido à dissociação das proteínas de cobertura das partículas. Os revestimentos de proteína são conhecidos por promover a estabilidade das nanopartículas em solução e sua atividade catalítica [28, 38]. O revestimento protéico formado naturalmente em torno das nanopartículas torna-as funcionalmente eficientes para usos biomédicos, incluindo fácil adsorção e entrega de DNA ou drogas hidrofóbicas [39]. Peptídeos e entrega auxiliada por proteínas de AuNPs têm sido usados ​​com sucesso para superar a barreira hematoencefálica no tratamento de distúrbios do sistema nervoso central [14]. Portanto, esses AuNPs biocompatíveis podem ser potencialmente adequados para várias aplicações biomédicas devido ao tamanho pequeno, propriedades físico-químicas exclusivas e outras vantagens.

Análise do cap de proteínas. a , b Imagens TEM mostrando a camada protéica de cobertura (setas) em torno de AuNPs. c SDS-PAGE de proteína extracelular secretada por T. crassa e proteína associada a nanopartículas. Pista 1, marcador de tamanho molecular. Pista 2, proteína extracelular total. Pista 3, nanopartículas carregadas sem ebulição mostram banda fraca de proteína ligada aos AuNPs na marca de 116 kDa. Há também uma banda de proteína destacada na marca de 40 kDa. Pista 4, nanopartículas após fervura com tampão de carregamento de SDS a 1% mostrando o desaparecimento da banda de 116 kDa e uma banda distinta de 40 kDa. A seta indica 40 kDa

Os AuNPs podem entregar o gene da proteína fluorescente verde (GFP) em linhas de células cancerosas de Sarcoma 180

DNA de plasmídeo pCAMBIA1302 abrigando gfp gene marcador, complexado com AuNPs, foi usado para tratar Sarcoma 180 células. As células produziram fluorescência verde indicando a absorção do complexo de DNA / AuNPs de plasmídeo e subsequente expressão do gene na célula cancerosa, enquanto as células tratadas apenas com DNA de plasmídeo nu não mostraram a fluorescência (Fig. 10a, b). Isso confirma o alto potencial dessas partículas para não apenas entregar genes às células cancerosas, os genes foram expressos de forma estável e permaneceram funcionais depois de entregues nas células.

Entrega de genes usando AuNPs em células cancerosas Sarcoma 180 e ensaio de hemólise com eritrócitos humanos; imagem microscópica de fluorescência de a células cancerosas que expressam a proteína fluorescente verde após a absorção do complexo DNA-AuNP e b células de controle tratadas com DNA de plasmídeo livre (barras =20 μm). c Porcentagem de hemólise com diferentes diluições de AuNPs. Os dados representam as médias ± SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras ( P <0,05, teste HSD de Tukey)

Nanopartículas metálicas anteriores demonstraram exibir imenso potencial terapêutico no tratamento de várias doenças como neovascularização da retina, HIV, linfoma de Dalton e atividade exibida contra o vírus da hepatite, vírus sincicial respiratório e vírus herpes simplex [18]. Congruente com esses relatórios, a entrega de drogas com base em nanocarreadores de ouro no presente estudo usando AuNPs pode ser considerada como um mediador em potencial em várias aplicações médicas, incluindo diagnósticos, entrega de drogas e terapêutica do câncer.

Compatibilidade dos AuNPs com eritrócitos humanos e ensaio de toxicidade

Os eritrócitos são modelos simples e convenientes do sistema de membrana celular e usados ​​para estudar as interações nanopartícula-membrana [40]. O ensaio hemolítico elucida a atividade lítica de membrana dos AuNPs em diferentes concentrações. A Figura 10c mostra que a atividade lítica da membrana das nanopartículas era desprezível em baixas concentrações. A atividade hemolítica mais alta encontrada em concentrações mais altas de suspensão de nanopartículas (até 20 μl / mL) foi inferior a 8%, o que indica toxicidade sanguínea muito baixa. O aumento gradual da atividade hemolítica com o aumento da concentração de AuNPs é provavelmente devido ao aumento da afinidade e adesão de maior número de partículas com os eritrócitos. Espera-se que essa afinidade das partículas com as membranas celulares facilite seu transporte celular. A baixa atividade hemolítica junto com a efetiva captação celular tornam as nanopartículas altamente adequadas para o desenvolvimento de agentes teranósticos seguros e eficientes [41].

Conclusões

O uso de fungo micorrízico comestível para sintetizar AuNPs de diferentes formas geométricas em um curto tempo de reação com o revestimento de proteína natural torna este método simples e único. A capa protéica proveniente do fungo comestível não teve efeitos tóxicos apreciáveis ​​e favoreceu a fácil fixação do DNA na superfície das partículas. No geral, esses AuNPs mostram-se promissores como agentes antimicrobianos e apoptóticos para a entrega de genes em células cancerosas.

Uma vez que fungos filamentosos podem suportar pressão de fluxo ou agitação [15], T. crassa pode ser cultivado em fermentadores para produzir AuNPs em grande escala usando resíduos agrícolas não tóxicos, permitindo a fácil retirada do produto e opções de reposição do sistema [2]. Uma vez que os AuNPs são de diferentes formas geométricas, existe a variedade de escopo com base na forma com meios mecânicos, como a centrifugação [42] e podem ser utilizados de acordo com suas propriedades específicas baseadas na forma.

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