Nanopartículas de Ouro Revestidas por Proteína Síntese Verde de Tricholoma crassum: Potenciais Antimicrobiano, Apoptótico e de Entrega Gênica

Resumo

Relatamos a primeira síntese verde de nanopartículas de ouro revestidas por proteína (AuNPs) usando o fungo micorrízico comestível Tricholoma crassum. As AuNPs, 5-25 nm de diâmetro e várias formas, formam-se dentro de uma hora a 28 °C. Espectroscopia UV-vis mostra pico SPR característico a 552 nm, deslocando com tempo de reação e pH. Caracterização detalhada por SEM, TEM, AFM, XRD e DLS confirma monodispersidade e coroa proteica natural de 40 kDa. As partículas exibem potente atividade antimicrobiana contra patógenos Gram-negativos, Gram-positivos e fúngicos, incluindo cepas multi-resistentes, e inibem germinação de esporos. Ensaios cometa revelam indução apoptótica dose-dependente em células vegetais, enquanto a capa proteica de 40 kDa facilita entrega gênica eficiente a células Sarcoma 180, evidenciada por expressão GFP. Testes de hemólise mostram toxicidade sanguínea negligenciável abaixo de 20 µl mL⁻¹, indicando janela terapêutica segura. Produção em larga escala em fermentadores é viável, posicionando estas AuNPs como agentes versáteis para aplicações antimicrobianas, anticâncer e de entrega gênica.

Introdução

A rápida adoção de nanopartículas em agricultura, medicina e produtos de consumo aumentou a necessidade de entender seu perfil de segurança. Síntese verde, que emprega organismos vivos ou suas enzimas, oferece rota ecológica e custo-efetiva que elimina químicos perigosos. Fungos filamentosos, com sua alta secreção enzimática, são particularmente hábeis na produção de nanopartículas metálicas extracelulares. Embora vários fungos tenham produzido nanopartículas de ouro (AuNPs), poucos relatos descrevem capas proteicas naturais nessas partículas, que são críticas para estabilidade coloidal e funcionalização. Nanopartículas de ouro são atraentes para uso terapêutico porque não elicitam resistência e podem ser projetadas para alvejar células tumorais via efeito de permeação e retenção aumentada (EPR). AuNPs com capa proteica aumentam captação celular e fornecem sítios de ancoragem para fármacos ou genes, eliminando necessidade de etapas adicionais de capeamento químico. No entanto, biocompatibilidade, citotoxicidade e riscos de agregação devem ser cuidadosamente avaliados antes de aplicação clínica.

Métodos

Condições de Crescimento de Fungos, Bactérias e Plantas

Tricholoma crassum foi cultivado para síntese de nanopartículas. Testes antimicrobianos usaram E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) e seus derivados multi-resistentes, bem como patógenos vegetais M. oryzae e A. solani. Mudas de tomate e tabaco foram cultivadas sob condições controladas (28 ± 1 °C, 16:8 h luz/escuro, 50 µmol m⁻² s⁻¹).

Síntese de AuNPs

Tapetes miceliais foram incubados em caldo dextrose de batata (PDB) por 7 dias a 28 °C. Após 24, 48 ou 72 h, 1 g de micélio foi agitado com 10 mL de água deionizada por 24 h a 50 RPM. O filtrado (pH 5,2) foi misturado com 1 mM HAuCl₄ e agitado a 28 °C no escuro por 1 h. Ajustando pH do filtrado (3,5-9) e temperatura de reação (0-100 °C), ajustamos tamanho e forma das partículas. Variações em volume de filtrado (×0,5-×2) e concentração de Au³⁺ (0,5-2 mM) refinaram ainda mais a síntese.

Técnicas de Caracterização

• Espectroscopia UV-Vis (450-750 nm) para análise SPR.
• SEM, TEM e AFM para morfologia e distribuição de tamanho.
• XRD para confirmação de fase cristalina.
• DLS para tamanho hidrodinâmico.
• SDS-PAGE para identificação de coroa proteica.

Ensaios Antimicrobianos e Antifúngicos

Ensaios de difusão em disco e curva de crescimento quantificaram inibição contra cepas bacterianas e fúngicas. Germinação de esporos fúngicos foi avaliada com concentrações variadas de AuNPs. O método envolveu incubação padrão e observação microscópica.

Avaliação de Apoptose

Ensaios cometa em núcleos de folhas de tabaco e tomate mediram fragmentação de DNA após exposição a AuNPs. Diferentes concentrações (0-30% v/v) e tempos de incubação (15-30 min) foram testados.

Entrega Gênica em Células Sarcoma 180

Plasmídeo pCAMBIA1302 (marcador GFP) foi complexado com AuNPs e incubado com células Sarcoma 180. Expressão GFP confirmou transfeção bem-sucedida. Ensaios de hemólise com eritrócitos humanos avaliaram compatibilidade sanguínea.

Resultados e Discussão

Formação de AuNPs e Características Espectroscópicas

A transição de amarelo pálido a violeta dentro de 1 h indica formação de AuNPs. Espectros UV-Vis mostram pico SPR a 552 nm para filtrado de 24 h, deslocando para vermelho com incubação mais longa e para azul com pH mais alto. Síntese ótima ocorre a 28 °C com 1 mM HAuCl₄, resultando em partículas monodispersas estáveis por >30 dias.

Efeito de Parâmetros de Síntese

Aumentar volume de filtrado ou concentração de Au³⁺ eleva intensidade de cor e absorbância, com leve deslocamento para azul a ×2 filtrado. Temperaturas mais altas (75-100 °C) produzem partículas maiores, menos estáveis. Exposição à luz aumenta tamanho de partícula e alarga pico SPR.

Morfologia e Distribuição de Tamanho

SEM e TEM revelam AuNPs de 5-22 nm em formas variando de esferas e losangos a hexágonos e triângulos. AFM confirma alturas sub-10 nm, e XRD confirma ouro cúbico de faces centradas com difração {111} dominante a 38,23°.

Atividade Antimicrobiana

AuNPs inibiram crescimento de E. coli, A. tumefaciens e M. oryzae com zonas de inibição dose-dependentes. Cepas multi-resistentes também foram suprimidas, indicando eficácia de amplo espectro. Análises de curva de crescimento mostraram fase log atrasada e densidade celular reduzida com tratamento de AuNPs.

Germinação de Esporos Fúngicos

Concentrações crescentes de AuNPs reduziram progressivamente germinação de esporos e comprimento de tubo germinativo de A. solani, demonstrando potência antifúngica.

Propriedades Apoptogênicas

Ensaios cometa revelaram dano significativo de DNA a >20% exposição a AuNPs, enquanto 5-10% causaram apoptose negligenciável. Assim, janela terapêutica existe para aplicações antimicrobianas ou de entrega gênica sem citotoxicidade.

Identificação de Coroa Proteica

SDS-PAGE de nanopartículas fervidas mostra banda única de 40 kDa idêntica à proteína extracelular de T. crassum. Capa proteica estabiliza partículas e fornece sítios de ligação para DNA.

Entrega Gênica e Hemólise

Complexos AuNP-plasmídeo alcançaram expressão GFP em células Sarcoma 180, enquanto plasmídeo nu não. Hemólise permaneceu abaixo de 8% em concentrações até 20 µl mL⁻¹, confirmando baixa toxicidade sanguínea.

Conclusões

Fungo micorrízico comestível Tricholoma crassum permite síntese verde rápida de AuNPs revestidas por proteína com formas diversas e robustas propriedades antimicrobianas, apoptóticas e de entrega gênica. A coroa proteica natural de 40 kDa garante estabilidade coloidal e funcionalização, enquanto dados de hemólise suportam uso terapêutico seguro. Produção em larga escala em fermentadores é viável, oferecendo plataforma escalável para aplicações antimicrobianas, anticâncer e de nanomedicina.