Agentes teranósticos de última geração baseados em microcápsulas polieletrólitas codificadas com nanocristais semicondutores:desenvolvimento e caracterização funcional

Resumo

A fabricação de microcápsulas de polieletrólitos e seu uso como transportadores de drogas, marcadores fluorescentes e nanopartículas de metal é uma abordagem promissora para o desenvolvimento de agentes teranósticos. Os pontos quânticos semicondutores (QDs) são caracterizados por brilho e fotoestabilidade extremamente altos que os tornam marcadores fluorescentes atraentes para a visualização da penetração intracelular e entrega de tais microcápsulas. Aqui, nós descrevemos uma abordagem para projetar, fabricar e caracterizar propriedades físico-químicas e funcionais de microcápsulas de polieletrólito codificadas com solubilizado em água e estabilizado com QDs de núcleo / casca de derivados de polietilenoglicol três funcionais. As microcápsulas desenvolvidas foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz, mobilidade eletroforética, microscopia eletrônica de varredura e abordagens de fluorescência e microscopia confocal, fornecendo dados exatos sobre sua distribuição de tamanho, carga superficial, características morfológicas e ópticas. Os tempos de vida de fluorescência das microcápsulas codificadas por QD também foram medidos e sua dependência do tempo após a preparação das microcápsulas foi avaliada. O conteúdo ideal de QDs usado para o procedimento de codificação que fornece as propriedades de fluorescência ideais das microcápsulas codificadas foi determinado. Por fim, foi demonstrada a captação da microcápsula intracelular por macrófagos murinos, confirmando a possibilidade de uso eficiente do sistema desenvolvido para imagiologia de células vivas e visualização do transporte e entrega de microcápsulas dentro das células vivas.

Histórico

O uso de microcápsulas de polieletrólitos como veículos para entrega direcionada e liberação controlada de drogas e agentes de contraste e como sondas fluorescentes para imagens in vitro e in vivo é uma linha promissora de pesquisa em medicina translacional e abordagem personalizada para diagnóstico e tratamento de várias doenças humanas [ 1,2,3,4].

O desenvolvimento de agentes teranósticos combinando as funções de drogas e ferramentas para imagens de biomarcadores, permitindo o diagnóstico precoce de várias doenças, é uma tarefa importante no campo da concepção de sistemas de entrega de drogas [5, 6]. Sistemas baseados em microcápsulas de polieletrólitos são candidatos promissores para combinar as duas funções. As condições de sua fabricação permitem a incorporação de substâncias biologicamente ativas, nanopartículas metálicas, etiquetas fluorescentes, etc. nas microcápsulas [7,8,9]. Arquivo adicional 1:A Figura S1 mostra esquematicamente um agente teranóstico típico baseado em microcápsulas de polieletrólito.

Um dos métodos eficazes para a obtenção de microcápsulas de polieletrólitos consiste na aplicação sucessiva de camadas de polímero com carga oposta sobre um substrato de formato esférico ou outro, que é removido posteriormente [10, 11]. A interação do policatião com carga oposta e do polianião no pH especificado, força iônica e temperatura da solução e polaridade do solvente resulta em um complexo de interpolímero na forma de uma membrana ou revestimento revestindo o substrato [12,13,14].

Os fatores listados acima também afetam a morfologia das microcápsulas resultantes, incluindo sua porosidade e forma e a integridade da parede. Por exemplo, um aumento na força iônica ou pH do ambiente das microcápsulas de polieletrólito facilita mudanças conformacionais ou protonação / desprotonação dos polieletrólitos que formam a parede da cápsula. Isso, por sua vez, leva à sua deformação e aumento da porosidade até o grau de perda de integridade estrutural e transição para o estado "aberto" seguido pela liberação do conteúdo interno das cápsulas e dos componentes embutidos em suas paredes para dentro o microambiente [15, 16]. Essas propriedades tornam as microcápsulas de polieletrólitos bons candidatos para o papel de sistemas de entrega sensíveis a estímulos e uma base promissora para o projeto de agentes teranósticos [2, 17, 18].

Os pontos quânticos (QDs) são nanocristais semicondutores fluorescentes de 2–10 nm de diâmetro, caracterizados por um amplo espectro de absorção e um estreito espectro de fluorescência simétrico. Isso permite que QDs com diferentes máximos de fluorescência sejam excitados a partir de uma única fonte de radiação, oferecendo a possibilidade de seu amplo uso como fluoróforos, especialmente para imagens multiplexadas [19, 20]. A alta fotoestabilidade e fluorescência brilhante de QDs determinam sua vantagem sobre fluoróforos orgânicos padrão em aplicações de detecção [21,22,23,24].

Estudos publicados anteriormente dedicados ao desenvolvimento de microcápsulas de polieletrólito polimérico fluorescente demonstram uma abordagem típica para corantes fluorescentes orgânicos clássicos ou pontos de carbono formando in situ sob carbonização hidrotérmica e conversão de dextrano em nanopartículas de carbono luminescentes em retração de revestimento de polieletrólito dentro da estrutura polimérica das microcápsulas de polieletrólito preparadas primárias . A abordagem de aprisionamento de corante orgânico é baseada na difusão do isotiocianato de fluoresceína ou rodamina B, corantes de tetrametilrodamina conjugados com dextrano de baixo peso molecular ou albumina de soro bovino (BSA) na estrutura porosa da membrana formada por polieletrólitos que resulta na carga de corante fluorescente de toda a estrutura da microcápsula de polieletrólito como na cavidade interior e na membrana polimérica. A necessidade de alto tratamento térmico no caso de microcápsulas codificadas por pontos de carbono altera a flexibilidade da estrutura da microcápsula e a torna mais rígida, o que não é indesejável no caso de desenvolvimento de sistemas teranósticos responsivos a estímulos de pH e força iônica [25,26,27, 28,29,30].

Neste estudo, estamos descrevendo todos os aspectos tecnológicos da fabricação de microcápsulas poliméricas codificadas com os QDs solúveis em água altamente fluorescentes, possuindo estabilidade coloidal significativa, descrevendo suas propriedades físico-químicas e funcionais e demonstrando sua aplicação em imagens de células vivas e visualização de microcápsulas transporte e entrega dentro das células vivas. Os dados podem abrir caminho para a próxima etapa para o desenvolvimento da próxima geração de agentes teranósticos com base nas microcápsulas multifuncionais funcionalizadas.

Experimental

Solubilização e caracterização de pontos quânticos

CdSe / ZnS core / shell QDs com um máximo de fluorescência λ _max iguais a 590 nm foram gentilmente cedidos pelo Dr. Pavel Samokhvalov (Laboratório de Nano-Bioengenharia, Universidade Nacional de Pesquisa Nuclear MEPhI (Instituto de Engenharia Física de Moscou), Moscou, Rússia).

Os QDs recentemente sintetizados foram revestidos com óxido de trioctilfosfina (TOPO) e eram insolúveis em água. Sua transferência para a fase aquosa foi realizada substituindo d, l-cisteína por TOPO e, posteriormente, substituindo d, l-cisteína por 12 - derivado de unidade de PEG contendo grupos terminais tiol e carboxila HS− (PEG) ₁₂ −COOH (Thermo Fisher Scientific, EUA) conforme descrito anteriormente [22, 31, 32]. Para tanto, uma amostra de QDs foi dissolvida em 800 μl de clorofórmio, após o que foram adicionados 1200 μl de metanol, e a mistura foi centrifugada por 5 min. O procedimento foi repetido três vezes. Em seguida, o pellet QD foi ressuspenso em 800 μl de clorofórmio. Uma solução de d, l-cisteína em metanol foi adicionada à suspensão com uma razão de peso de QD para d, l-cisteína de 1:0,13, e a mistura foi centrifugada a 16.873 g por 10 min (Centrifuge 5418, Eppendorf, EUA). O sedimento QD foi lavado do excesso de d, l-cisteína com metanol por meio de centrifugação por 3 min na mesma velocidade. O pellet QD foi seco em um concentrador centrífugo Concentrator Plus (Eppendorf, EUA) por 2 min. Os QDs secos foram suspensos em 650 μl de hidróxido de sódio 0,1 M e sonicados por 10 min em um banho de ultrassom Elma Sonic P30H (Elma Schmidbauer, Alemanha). Em seguida, a solução foi centrifugada a 5509 g por 10 min, e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro Millipore com um tamanho de poro de 0,22 μm (Merck, Alemanha). O conteúdo QD das amostras foi determinado espectrofotometricamente no comprimento de onda do primeiro pico de absorção de excitons.

As amostras de QD solúveis em água obtidas foram estabilizadas pela adição de HS− (PEG) ₁₂ −COOH a uma razão molar de derivado de QD para PEG de 1:4,6 e incubação da mistura a 2–8 ° C por 24–48 h.

Síntese de micropartículas de carbonato de cálcio

As micropartículas de carbonato de cálcio foram obtidas conforme descrito em outro lugar [33, 34]. Quinze ml de um 0,33 M Na ₂ CO ₃ (Sigma-Aldrich, Alemanha) solução foi adicionada a 15 ml de um 0,33 M СаСl ₂ (Sigma-Aldrich, Alemanha) enquanto se agita. A mistura reaccional foi agitada a taxas de 250, 500 e 750 rpm num agitador magnético RCT Basic (IKA, Alemanha) à temperatura ambiente durante 15 a 60 s. O СаСl ₂ e Na ₂ CO ₃ as soluções foram filtradas preliminarmente através de filtros com tamanho de poro de 0,22 µm.

Depois disso, a agitação foi interrompida e a mistura de reação foi incubada por 10 min. A mistura foi lavada com água MilliQ por ressuspensão e centrifugação alternadamente a 452 g por 5 min usando uma Centrifuge 5810 (Eppendorf, EUA). As micropartículas obtidas foram lavadas quatro vezes. Após a lavagem final, o pellet foi seco em estufa a 60 ° C por 90 min.

Preparação de microcápsulas polieletrólitas codificadas com pontos quânticos

As micropartículas foram codificadas com QDs usando uma técnica modificada de deposição camada por camada de polímeros de carga oposta [31, 35] e QDs solúveis em água carboxilados em micropartículas de carbonato de cálcio preparadas, que serviram como uma matriz. As camadas de polieletrólito consistiam em pares de polímeros:o policatião poli (cloridrato de alilamina) (PAH) com Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, EUA) e o polianion poli (4-estirenossulfonato de sódio) (PSS) com Mw ≈ 70.000 Da ( Sigma-Aldrich, EUA).

As camadas foram aplicadas na seguinte ordem:СаСО ₃ / PAH / PSS / PAH / PSS / PAH / QD-S- (PEG) ₁₂ -COOH / PAH / PSS / PAH / PSS / PAH / PSS.

Uma amostra de micropartículas secas foi ressuspensa em 0,5 ml de água MilliQ e sonicada em um banho ultrassônico por 10 min. Uma alíquota de 0,5 ml de solução de PAH de 2 mg / ml em NaCl 0,5 M foi adicionada à suspensão contendo 3,7 × 10 ⁸ micropartículas de carbonato de cálcio em água MilliQ. A suspensão foi sonicada em um banho de ultrassom por 60 s e então incubada por 20 min com agitação. Depois disso, a suspensão de micropartículas foi lavada do polímero em excesso por centrifugação a 1054 g por 5 min seguido de ressuspensão em água MilliQ. A lavagem das micropartículas de carbonato de cálcio após a estratificação do policatião foi repetida três vezes. Para a aplicação da próxima camada (polianião), as micropartículas foram preliminarmente ressuspensas em 0,5 ml de água MilliQ; a suspensão foi misturada com 0,5 ml de uma solução de PSS 2 mg / ml em NaCl 0,5 M, sonicada em um banho ultrassônico por 60 s, incubada por 20 min com agitação e, em seguida, lavada do polímero em excesso como descrito acima.

Cinco camadas de polieletrólito, a camada externa consistindo em PAH, foram aplicadas nas partículas de carbonato de cálcio antes da codificação. De 0,10 a 2,24 mg de QDs foi adicionado à suspensão das micropartículas. A mistura foi incubada durante 80 min com agitação e depois lavada três vezes por centrifugação como descrito acima. Depois disso, camadas sucessivas de polímeros com carga oposta foram aplicadas. As micropartículas codificadas foram armazenadas a + 4 ° C no escuro.

Para obter microcápsulas de polieletrólito codificadas por QD, o núcleo de carbonato de cálcio foi removido das micropartículas. Para tal, após centrifugação, o pellet de micropartículas codificadas por QD foi ressuspenso em 2 ml de etilenodiaminotetracetato dissódico 0,2 M (pH 6,5) e a suspensão incubada durante 15 min. Para garantir a dissolução do núcleo de carbonato de cálcio, repetimos este procedimento mais duas vezes, cada vez substituindo a solução por uma nova alíquota de 0,2 M EDTA (pH 6,5) após 5 min de centrifugação da amostra a 2152 g . Em seguida, a suspensão de microcápsulas codificadas por QD foi lavada do excesso de EDTA quatro vezes por ressuspensão em água MilliQ e centrifugação nas condições especificadas acima. As microcápsulas de polieletrólito resultantes foram armazenadas a + 4 ° C no escuro.

Ao estudar a interação das microcápsulas de polieletrólitos codificados por QD com as células, modificamos a superfície da microcápsula com BSA (fração de choque térmico, livre de protease, baixa endotoxina, adequada para cultura de células, pH 7, ≥ 98%; Sigma-Aldrich, EUA) . Resumidamente, as micropartículas codificadas com uma camada superior de policatião foram adicionalmente revestidas com um ácido polianiônico poliacrílico (PAA) com Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, EUA), e o núcleo foi removido como descrito acima. Após a lavagem final, as microcápsulas foram dispersas em uma solução tampão de fosfato 50 mM (pH 7,4) contendo 1% de BSA e incubadas a + 4 ° C no escuro. Antes do uso, as microcápsulas foram lavadas para remover o excesso de BSA com uma solução tampão de fosfato 50 mM (pH 7,4).

Caracterização dos pontos quânticos, micropartículas e microcápsulas polieletrólitas codificadas com pontos quânticos

Estudo de tamanho e cobrança

O diâmetro hidrodinâmico dos QDs solubilizados, micropartículas codificadas por QD revestidas com invólucros de polímero e microcápsulas de polieletrólitos codificados por QD foram determinados pelo método de espalhamento de luz dinâmico; a carga superficial foi estimada a partir de sua mobilidade eletroforética usando o efeito Doppler por meio de um Zetasizer NanoZS (Malvern, UK).

Análise de fluorescência

Os tempos de vida de fluorescência (cinética de decaimento fluorescente) dos QDs solubilizados, micropartículas codificadas por QD revestidas com cascas de polímero e microcápsulas de polieletrólito codificadas por QD foram medidos no comprimento de onda do máximo de fluorescência. O segundo harmônico de um YAG:Nd ³⁺ laser com comprimento de pulso de 350 ps e taxa de pulso de 50 Hz foi usado como fonte de excitação. O sinal foi detectado por um detector fotomultiplicador conectado a um oscilógrafo DPO 3054 (Tektronix, EUA) com resolução de tempo de 2 ns. As suspensões de micropartículas e microcápsulas codificadas por QD foram agitadas permanentemente durante as medições por meio de um agitador ecomagnético MIXcontrol (2mag, Alemanha) para evitar a sedimentação da amostra.

Estimativa da eficiência de codificação

A eficiência de codificação foi estimada a partir do conteúdo de QD do sobrenadante após a aplicação (adsorção) de QDs na superfície da micropartícula. A quantidade de QDs adsorvidos na superfície da micropartícula (\ ({Q} _ {{\ mathrm {QD}} _ {\ mathrm {abs}}} \)) foi calculada como
$$ {Q} _ {{\ mathrm {QD}} _ {\ mathrm {abs}}} ={Q} _ {{\ mathrm {QD}} _ 0} - {Q} _ {{\ mathrm {QD} } _i}, $$
onde \ ({Q} _ {{\ mathrm {QD}} _ 0} \) é a quantidade inicial de QDs na alíquota usada para codificação, e \ ({Q} _ {{\ mathrm {QD}} _ i} \ ) é a quantidade de QDs no sobrenadante do i ª amostra.

O conteúdo QD das amostras foi determinado espectrofotometricamente usando um leitor de placas multimodo Infinite 200 PRO (Tecan, Suíça).

Microscopia Eletrônica de Varredura

Microfotografias eletrônicas das micropartículas de carbonato de cálcio foram obtidas usando um microscópio eletrônico de varredura JSM-7001F (JEOL, Japão) equipado com um cátodo de Schottky. O pó das micropartículas secas foi aplicado em uma fita adesiva de carbono condutora e varrido a uma média de 50, uma corrente de feixe de 20 pA e uma tensão de aceleração de 15-30 kV.

Para obter microfotografias das micropartículas revestidas com camadas de polieletrólitos, uma gota de uma suspensão de micropartículas diluída contendo ~ 10 ⁶ micropartículas por 0,5 ml foram colocadas sobre um substrato de silício purificado preliminarmente e secas à temperatura ambiente. As amostras resultantes foram escaneadas a uma média de 50, uma corrente de feixe de 20 pA e uma tensão de aceleração de 3-30 kV.

Fluorescência e microscopia confocal

A morfologia e distribuição de tamanho das micropartículas codificadas por QD foram analisadas por meio de microscopia de fluorescência usando um microscópio Carl Zeiss Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Alemanha) equipado com filtro de emissão de fluorescência Texas Red; Solução aquosa de glicerol a 20% foi usada como meio de montagem de lâminas .

As amostras de microcápsulas codificadas por QD também foram estudadas usando um microscópio de varredura a laser confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Alemanha) equipado com lasers para excitação 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 e 633 nm e Leica LAS Software AF versão 2.7.3.9723. A análise foi conduzida no comprimento de onda de excitação 488 nm e conjunto de filtros de coleta cobrindo a faixa de emissão em 555–620 nm usando a objetiva Leica HCX PL APO CS 63 × / 1,20 CORR WATER. Uma solução a vinte por cento de glicerol em tampão PBS pH 7,4 foi usada como meio de montagem de lâmina. O software Image J 1.51 s (EUA) foi utilizado para análise e processamento das imagens.

Captação de microcápsulas polieletrólitas codificadas com pontos quânticos por células vivas in vitro

A linha celular de macrófago alveolar de camundongo imortalizada MH-S (ATCC, EUA) foi mantida em meio RPMI suplementado com 10% de FCS, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol e 2,06 mM de glutamina em uma atmosfera umidificada a 5% de CO ₂ e 37 ° C. As células MH-S cultivadas até 3 × 10 ⁶ células em placas μ de 35 mm e 1,2 × 10 ⁶ das microcápsulas de polieletrólito codificadas por QD revestidas com BSA foram adicionadas a cada μ-dishe. As células foram incubadas adicionalmente a 37 ° C e 5% de CO ₂ por 4 e 24 horas, respectivamente. Em seguida, os núcleos das células foram contrastados usando sonda fluorescente DRAQ5 (ex / em comprimentos de onda 646/697 nm, ThermoFisher, EUA) durante 30 min e depois as amostras de células foram lavadas e analisadas usando microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Alemanha ) As imagens da captação celular das microcápsulas de polieletrólito codificadas por QD foram adquiridas usando HCX PL APO CS 63,0 × 1,30 GLYC / OIL, HCX PL APO azul lambda 40,0 × 1,25 OIL. A fluorescência dos QDs foi excitada em 488 nm e a emissão foi coletada em 555–620 nm, enquanto a fluorescência dos núcleos celulares contrastados com DRAQ5 foi excitada em 633 nm e a emissão coletada em 650–750 nm.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada nos softwares MS Office Excel 2007 e Origin Pro 2015. Todos os dados são mostrados como médias e desvios padrão usando os resultados de, no mínimo, três experimentos independentes.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de micropartículas de carbonato de cálcio

A utilização de cristais esféricos inorgânicos, em particular microesferólitos de carbonato de cálcio, como substrato é determinada pela sua biocompatibilidade, bem como pela possibilidade de sua remoção no decurso da formação de microcápsulas de polieletrólitos sem a utilização de solventes agressivos para os sistemas vivos. As micropartículas de carbonato de cálcio per se também podem ser utilizadas como sistema de liberação de fármacos com liberação modificada ou prolongada, servindo como matriz para carregamento de fármacos e controle de sua liberação no microambiente, ou seja, possuem múltiplos usos potenciais em sistemas de liberação [36,37 , 38,39,40,41,42,43,44,45,46].

Os principais fatores que determinam o tamanho e a forma dos microcristais são a taxa e a duração da agitação e o tempo de incubação da mistura de reação [33, 41]. Determinamos experimentalmente as condições para a obtenção de microesferólitos de carbonato de cálcio com uma distribuição de tamanho ideal. CaCO único ₃ micropartículas têm uma forma arredondada quase regular. Arquivo adicional 1:A Figura S2 mostra as distribuições de tamanho de micropartículas de carbonato de cálcio obtidas em diferentes taxas de agitação. Como visto a partir desses dados, a heterogeneidade de tamanho das partículas aumentou com o aumento da taxa de agitação. Se a taxa de agitação foi de 250 rpm, o tamanho das partículas obtidas variou de 4,0 a 6,0 μm. Nesse caso, todas as micropartículas da amostra estavam separadas e sua distribuição de tamanho estava próxima do normal (Arquivo adicional 1:Figura S2a). No entanto, se a mistura foi agitada a 500 rpm, observamos partículas de formato irregular que eram agregações de partículas menores, o tamanho médio das partículas individuais variando de 2,7 a 5,6 μm (Arquivo adicional 1:Figura S2b). A uma taxa de agitação de 750 rpm, a dispersão do tamanho de partícula foi aumentada. Esta amostra também continha agregações de formato irregular, com o tamanho médio das micropartículas individuais na faixa de 3,8 a 5,7 μm (Arquivo adicional 1:Figura S2c).

Assim, a agitação da mistura de reação a uma taxa de 250 rpm tornou possível obter partículas com uma distribuição de tamanho ótima e uma forma quase regular e evitou agregações de partículas. Portanto, estimamos o efeito da duração da agitação na distribuição do tamanho das micropartículas nesta taxa de agitação (Arquivo adicional 1:Figura S3). A agitação da mistura de reação por 15 s produziu um número maior de partículas maiores em comparação com a agitação de 30 s. Um aumento na duração da agitação para 60 s teve um efeito semelhante. Ou seja, a duração da agitação foi insuficiente no primeiro caso (Arquivo Adicional 1:Figura S3a) e excessiva no último caso (Arquivo Adicional 1:Figura S3c). Assim, consideramos a taxa de 250 rpm e a duração de 30 s como condições ideais de agitação.

De acordo com dados de microscopia eletrônica de varredura (MEV), a superfície das micropartículas de carbonato de cálcio era heterogênea, caracterizada por porosidade (Fig. 1a). Com um aumento de 40.000 ×, pode-se observar que as micropartículas eram, por sua vez, formadas por partículas submicrométricas menores (Fig. 1b). Assim, as micropartículas obtidas tinham uma estrutura porosa e matrizes representadas que não só são adequadas como substratos, mas também podem ser usadas per se como sistemas de entrega e devido à sua estrutura de superfície particular podem ser facilmente utilizadas como uma matriz para camada por camada deposição de polímero.

Microfotografias eletrônicas de varredura de micropartículas de carbonato de cálcio ( a ) e sua superfície em uma ampliação maior ( b )

Preparação e caracterização de microcápsulas polieletrólitas codificadas com pontos quânticos

Os QDs solúveis em água preparados foram caracterizados por um amplo espectro de absorção e um estreito espectro de fluorescência com uma emissão máxima de 590 nm (Fig. 2). O diâmetro hidrodinâmico dessas amostras QD variou de 23,96 a 28,2 nm. Arquivo adicional 1:A Figura S4 mostra a distribuição de tamanho dos QDs estabilizados com HS− (PEG) ₁₂ −COOH. A modificação da superfície QD com HS− (PEG) ₁₂ −COOH garantiu a estabilidade de QD na fase aquosa, bem como a carga negativa de superfície suficiente para a adsorção efetiva de QDs entre camadas de polieletrólito carregadas positivamente durante o procedimento de codificação [22, 47].

Características ópticas dos pontos quânticos de núcleo / casca de CdSe / ZnS solubilizados com HS− (PEG) ₁₂ Ligantes −COOH

Os valores de carga superficial medidos das amostras de micropartículas de carbonato de cálcio durante cada etapa de deposição das camadas de polieletrólitos e QDs (Tabela 1) confirmaram que a carga superficial da matriz original, os QDs solubilizados, bem como a recarga da superfície após cada deposição de polímeros são suficientes para a absorção efetiva de cada camada subsequente.

A carga superficial intrínseca e a estrutura superficial porosa das micropartículas de carbonato de cálcio sintético permitiram que fossem usadas como uma matriz para o polieletrólito com carga oposta e deposição QD (Fig. 3). A aplicação de polímeros PAH e PSS em microcápsulas poliméricas de polieletrólitos codificados por QD é determinada por sua biocompatibilidade e não toxicidade e também não biodegradabilidade que adicionalmente ajuda a reter QDs dentro do invólucro. A biodegradabilidade da poli-l-arginina, poli-l-lisina, quitosana, sal de sódio de ácido algínico e sulfato de dextrano, que também são amplamente utilizados na formação de microcápsulas de polieletrólito, irão induzir a difusão QD para fora da membrana polimérica que deve resultar na diminuição das propriedades fluorescentes das micropartículas [3, 11, 39, 48,49,50,51,52]. O policatião PAH e o polianião PSS utilizados neste estudo contêm, respectivamente, grupos amina e sulfato garantindo a interação eletrostática entre as camadas de polímero, que resulta na formação de complexos interpolímeros [16, 25, 36, 37]. A escolha da primeira camada de polímero foi determinada pelo valor de carga superficial das micropartículas de carbonato de cálcio sintetizadas.

Procedimento de preparação de microcápsulas codificadas com pontos quânticos:formação das camadas do policatião (1) e do polianião (2), os polieletrólitos PAH e PSS, respectivamente, na superfície da matriz; codificação das micropartículas resultantes com pontos quânticos e posterior deposição de polímeros camada por camada (3); remoção do núcleo de carbonato de cálcio (4)

A Figura 4 mostra imagens de SEM dos estágios de formação do invólucro de polímero na superfície do substrato. Como visto nas microfotografias, as micropartículas continham um núcleo de grãos de carbonato de cálcio e uma casca, que se tornou mais distinta com o aumento do número de camadas de polímero adsorvido. A superfície das micropartículas revestidas com as camadas de polieletrólitos seguia a forma do substrato com sua homogeneidade característica, o que sugeria ser também poroso (Fig. 4a, b) [44]. Conforme a casca do polímero se tornou mais espessa, a superfície da micropartícula tornou-se mais plana e lisa (Fig. 4c, d).

Imagens de microscopia eletrônica de varredura de micropartículas de carbonato de cálcio após a aplicação de quatro ( a , b ) e dez ( c , d ) camadas de polieletrólito

A etapa final de preparação de microcápsulas de polieletrólito codificadas por QD incluiu a remoção do núcleo de carbonato de cálcio e a formação da estrutura final das microcápsulas. Para dissolver a matriz constituída por grãos de carbonato de cálcio, as micropartículas foram lavadas com EDTA. O EDTA foi usado principalmente porque forma complexos solúveis em água mediante interação com sais de metais divalentes, incluindo cálcio, e seu baixo peso molecular garante a permeabilidade do invólucro de polieletrólito para EDTA e sua complexação com Ca ²⁺ . Isso leva à dissolução do núcleo das partículas de polieletrólito e à formação de uma estrutura oca [45, 46].

As micropartículas codificadas por QD e as microcápsulas de polieletrólitos obtidas em nosso estudo tinham uma forma esférica ou quase esférica e um tamanho de 3,8 a 6,5 ​​μm (Fig. 5). A análise da morfologia e estrutura das micropartículas e microcápsulas no modo fluorescente mostrou cavidades dentro das microcápsulas de polieletrólitos, como evidente por sua maior transparência em comparação com as micropartículas (Fig. 5b). Isso demonstrou que o procedimento de dissolução do núcleo com EDTA foi eficaz. Os dados de microscopia confocal também mostraram a estrutura oca das microcápsulas de polieletrólito fluorescentes obtidas (Fig. 6). Estas microcápsulas podem ser distinguidas como partículas únicas (Fig. 6a, b) que podem ser caracterizadas como partículas esféricas com superfície rugosa devido à sua modificação de superfície por revestimento BSA.

Imagens de microscopia de fluorescência de micropartículas de carbonato de cálcio revestidas com polieletrólito e codificadas com ponto quântico ( a ) e microcápsulas de polieletrólito obtidas a partir deles ( b )

Imagens de microscopia confocal das microcápsulas de polieletrólitos codificadas com pontos quânticos e revestidas por BSA:cortes transversais das microcápsulas ( a ); Projeção 3D de uma única microcápsula de polieletrólito ( b )

Estimativa de eficiência de codificação

A eficiência da codificação foi estimada pela quantidade de QDs adsorvidos na superfície do polímero com carga positiva da micropartícula. A estimativa das quantidades de QDs na solução original usada para a codificação de micropartículas e no sobrenadante antes e após a incubação das micropartículas com a solução QD mostrou que o número de QDs ligados à superfície da micropartícula aumentou linearmente com o aumento do conteúdo de QD na mistura de reação de 0,36 a 2,241 mg (Fig. 7a). Um aumento adicional na quantidade de QDs na solução levou a uma diminuição no número de QDs adsorvidos. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ) Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p  > 0.05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:
$$ I(t)={A}_1\bullet {e}^{-x/{t}_1}, $$
Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

where I (t ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , and t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a - d ) The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –h ) The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.

Conclusions

Our study has demonstrated the feasibility of fabrication of stable QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with optimized fluorescence characteristics and a narrow size distribution. The technique for incorporation of water-soluble and stabilized with three-functional polyethylene glycol derivatives core/shell QDs into the polymer wall of the microcapsules and detailed characterization at each stage of experimental procedure ensured efficient fluorescent encoding of microcapsules. The efficient intracellular uptake of developed QD-encoded microcapsules by murine macrophages was demonstrated, thus confirming the possibility of efficient use of developed system for live cell imaging and visualization of microcapsules transportation and delivery within the living cells.

Abreviações

EDTA:

Disodium ethylenediaminetetraacetat

PAA:

Polyacrylic acid

PAH:

Polycation poly(allylamine hydrochloride)

PEG:

Polyethylene glycol

PSS:

Polyanion poly(sodium 4-styrenesulfonate)

QD:

Quantum dot

RPMI medium:

Roswell Park Memorial Institute medium

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

TOPO:

Trioctylphosphine oxide

Evolução de hidrogênio fotocatalítico aprimorada carregando Cd0.5Zn0.5S QDs em nanofolhas Ni2P porosas Morfologia, estrutura e propriedades ópticas de filmes semicondutores com Nanislands GeSiSn e camadas deformadas