Fabricação, Caracterização e Atividade Biológica de Sistemas de Nanotransmissão de Avermectina com Diferentes Tamanhos de Partículas

Resumo

Os sistemas de nanotransmissão dos ingredientes ativos dos pesticidas podem melhorar as taxas de utilização dos pesticidas e prolongar seus efeitos de controle. Isso se deve ao envelope do nanocarreador e à função de liberação controlada. No entanto, as partículas que contêm ingredientes ativos em formulações de pesticidas de liberação controlada são geralmente grandes e têm ampla distribuição de tamanho. Existem estudos limitados sobre o efeito do tamanho das partículas nas propriedades de liberação controlada e nas atividades biológicas dos sistemas de distribuição de pesticidas. No presente estudo, os sistemas de nanotransmissão de avermectina (Av) foram construídos com diferentes tamanhos de partículas e seus desempenhos foram avaliados. A taxa de liberação de Av no sistema de nano-entrega pode ser controlada de forma eficaz alterando o tamanho da partícula. A atividade biológica aumentou com a diminuição do tamanho das partículas. Esses resultados sugerem que os sistemas de nanotransmissão Av podem melhorar significativamente a liberação controlável, fotoestabilidade e atividade biológica, o que aumentará a eficiência e reduzirá os resíduos de pesticidas.

Histórico

Os pesticidas são importantes para controlar doenças de plantas e pragas de insetos e para salvaguardar a segurança alimentar nacional. A maioria das formulações de pesticidas convencionais são sistemas abertos, que apresentam problemas como dispersão pobre, degradação de ingredientes ativos e deriva de gotículas. Ingredientes ativos em pesticidas têm taxas de perda de até 70–90%. Isso ocorre como consequência da pulverização de campo devido à biodegradação, degradação química, fotólise, evaporação, escoamento superficial e água subterrânea percolada, todos os quais levantam preocupações para a segurança alimentar e o meio ambiente [1, 2]. Melhorar a aplicação e entrega de pesticidas tornou-se, portanto, um importante tópico de pesquisa [3,4,5].

Nos últimos anos, o desenvolvimento da nanotecnologia e dos nanomateriais proporcionou uma nova abordagem para melhorar a eficiência da aplicação de pesticidas [6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]. Formulações de nanopartículas de pesticidas têm sido propostas para produzir uma melhor distribuição espacial de pesticidas na superfície das folhas, devido ao pequeno tamanho das nanopartículas e grande área de superfície, o que proporciona melhor eficiência [16,17,18,19]. Os sistemas de nanotransmissão para pesticidas envolvem o aprisionamento dos ingredientes ativos dos pesticidas dentro dos nanomateriais poliméricos, para permitir a liberação lenta e controlada dos ingredientes ativos nas culturas alvo [20,21,22]. Entre os diferentes polímeros, o ácido polilático (PLA) tem sido amplamente utilizado como carreadores de nanopartículas em sistemas de nano-entrega de liberação controlada para muitas moléculas bioativas devido ao seu atóxico, boa biodisponibilidade e biocompatibilidade e aprovação pela Food and Drug Administration para uso humano [23, 24]. Existem estudos limitados sobre o PLA como material de transporte no campo dos pesticidas. O PLA é um material de revestimento muito promissor para encapsular pesticidas devido à sua compatibilidade ambiental, baixo custo e fácil expansão.

Os sistemas de nanotransmissão para pesticidas também fornecem áreas de contato ampliadas entre a praga alvo e as partículas de pesticida [25, 26].

Avermectina (Av) é um biopesticida seguro, de amplo espectro e altamente eficiente que pode controlar uma variedade de pragas agrícolas. Av se degrada facilmente devido à fotoxidação. O Av também tem meia-vida curta na água, o que afeta o controle de pragas em aplicações no campo. O coeficiente de adsorção de carbono orgânico para Av é alto. Isso significa que o Av não migra prontamente no solo porque se liga fortemente à matéria orgânica, o que afeta seu controle de pragas no solo. Muitos esforços têm se concentrado na proteção da atividade biológica de Av por meio de tecnologias de microencapsulação [27, 28]. No entanto, o tamanho das microcápsulas contendo Av é difícil de controlar. Eles são geralmente grandes, com tamanhos de aproximadamente 1–5 μm, e têm ampla distribuição de tamanho [29, 30]. Má dispersão e uniformidade, bem como tamanhos grandes, não são propícios para melhorar a adesão de pesticidas na superfície das folhas ou aumentar a permeabilidade em insetos prejudiciais. Investigações limitadas foram conduzidas sobre a síntese e atividade biológica de sistemas de nanotransmissão de pesticidas para Av com diferentes tamanhos [31,32,33,34]. A construção de sistemas de nanotransmissão para Av por encapsulamento de nanomateriais pode melhorar significativamente sua fotoestabilidade, reduzir sua adsorção no solo ou outros fatores adversos e melhorar o efeito de controle do pesticida. Além disso, os sistemas de nano-entrega da Av também têm melhor penetração e permitem a liberação mais lenta e controlada dos ingredientes ativos nas culturas alvo, em comparação com as microcápsulas convencionais.

O presente estudo teve como objetivo preparar vários tamanhos de partículas de nanossistemas de liberação de Av por polimerização em emulsão usando PLA e caracterizar seu desempenho como um carreador seguro e biodegradável. Nós investigamos o efeito do tamanho da partícula nas propriedades de liberação e na atividade biológica do sistema Av nano-entrega [35,36,37,38,39]. As concentrações da substância ativa e seus precursores e as características do sistema de emulsão são os principais fatores para estabelecer a distribuição de tamanho do sistema de nano-entrega Av final. O sistema de nano-entrega Av mostrou boa dispersão de partículas com tamanho de partícula controlado, alto carregamento de Av, controle de tamanho efetivo e propriedades de liberação sustentada, e boa proteção ultravioleta (UV) e estabilidade.

Experimental

Materiais

PLA e Av foram fornecidos por Nature Works e Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. (Inner Mongolia, P. R. China), respectivamente. Álcool polivinílico (PVA), 87-90% hidrolisado com um M _w médio de 30.000-70.000, foi adquirido da Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co., Ltd. (Xangai, República Popular da China). A gelatina foi adquirida da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pequim, República Popular da China). As membranas de diálise foram adquiridas da Beijing Tianan Technology Co., Ltd. (República Popular da China). Outros reagentes químicos eram de grau analítico e foram adquiridos na Beijing Chemical Works (Pequim, República Popular da China). A água usada em todas as experiências era de grau Milli-Q (18,2 MΩ cm, TOC ≤ 4 ppb) e foi obtida a partir de um sistema Milli-Q Advantage A10 (Millipore, Milford, MA, EUA).

Preparação do sistema de nanotransmissão de Avermectina

O sistema Av nano-entrega foi preparado através de um método de emulsão óleo-em-água (O / W) combinado com um processo de emulsificação ultra-sônica e física de cisalhamento. Resumidamente, PLA e Av foram dissolvidos em cloreto de metileno como a fase oleosa. Para a fase aquosa, a gelatina foi dissolvida em água a 40 ° C, que foi então misturada com solução aquosa de PVA. Em seguida, a fase oleosa foi gotejada lentamente em um grande volume da fase aquosa sob emulsificação de alto cisalhamento (FA25, FLUKO, Ruhr-gebiet, Alemanha), para preparar uma emulsão grosseira. A emulsão grossa foi então uniformemente dispersa por emulsificação ultrassônica (JY 92-IIN, SCIENTZ, Ningbo, República Popular da China). A emulsão uniforme foi então solidificada sob agitação magnética durante a noite (RW20, IKA, Staufen, Alemanha). O sistema endurecido de nano-entrega de Av foi coletado por centrifugação e foi lavado três vezes com água desionizada. Os produtos foram coletados por centrifugação e, em seguida, liofilizados (FD-81, EYELA, Tóquio, Japão) para produzir um pó de fluxo livre. O pó seco foi armazenado a 4 ° C até à utilização.

Caracterização de sistemas de nanodistribuição

A morfologia de cada sistema de nano-entrega Av foi investigada por microscopia eletrônica de varredura (SEM, JSM-6700 F, JEOL Ltd., Akishima-shi, Japão) com uma voltagem de aceleração de 5 kV. Amostras SEM foram depositadas gota a gota na superfície de uma fatia de silício. A gota foi deixada secar à temperatura ambiente e foi então revestida com uma fina camada de platina usando um aplicador catódico (EM ACE600, Leica, Viena, Áustria), para evitar o carregamento durante a observação SEM. Os tamanhos das partículas nos sistemas de nano-entrega Av foram medidos a 25 ° C por dispersão de laser usando um zetasizer (Zetasizer NanoZS90; Malvern, Worcestershire, UK).

Determinação da carga de avermectina nos sistemas de nanotransmissão

A quantidade de Av no sistema de nano-entrega foi medida em um comprimento de onda de 245 nm, usando um espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-vis) (TU901, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). Em detalhes, os espécimes carregados com Av foram pesados e dissolvidos em clorofórmio durante a noite, após o que a solução foi seca por destilação a pressão reduzida. Metanol foi então adicionado para dissolver o Av do precipitado seco. Finalmente, a mistura foi filtrada para produzir uma solução límpida que foi analisada por espectrofotometria UV-vis.

Liberação controlada de Avermectina dos sistemas de nanotransmissão

Os perfis de liberação de Av dos sistemas de nano-entrega de diferentes tamanhos foram investigados como segue. Amostras de nano-entrega Av de cada tamanho foram suspensas em 10 mL de mistura de etanol / água (1:1, v / v ) A suspensão foi então transferida para um saco de diálise, que foi selado em um frasco marrom com 90 mL de mistura de etanol / água (1:1, v / v ) como meio de liberação. O frasco foi incubado em um agitador incubador a 300 rpm em temperatura ambiente. Após intervalos de tempo definidos, 5,0 mL de solução foram removidos e substituídos por 5,0 mL de solvente fresco. A taxa de liberação de Av da amostra de nano-entrega foi calculada medindo as concentrações de Av dissolvido no meio de liberação em diferentes intervalos e foi usada para avaliar a propriedade de liberação sustentada. A concentração de Av foi medida usando um espectrofotômetro UV-vis em um comprimento de onda de 245 nm. Abamectina técnica (TC, ingrediente ativo de grau técnico) foi usada como controle.

Comportamento da fotólise da avermectina no sistema de nanotransmissão

O comportamento fotolítico de Av no sistema de nano-entrega foi avaliado com o Av comercial WDG como controle. As amostras foram dissolvidas em metanol / água (1:1, v / v ) e divididas igualmente em placas de cultura, e as amostras resultantes foram irradiadas por um período desejado a 25 ° C sob uma lâmpada UV (500 W), que tinha uma intensidade máxima em um comprimento de onda de 365 nm. Em intervalos de tempo especificados (12, 24, 36, 48, 60 e 72 h), a placa de cultura foi retirada do reator e a concentração Av das amostras foi analisada.

Testes de estabilidade

A estabilidade do sistema de entrega nano Av foi testada de acordo com CIPAC MT 46 e GB / T 19136–2003. As amostras foram acondicionadas em tubos de vidro e armazenadas a 0 ± 2 ° C por 7 dias e 54 ± 2 ° C por 14 dias. Mudanças na quantidade de Av no sistema de nano-entrega foram então estudadas.

Bioensaios

Bioensaios do sistema de nano-entrega Av de diferentes tamanhos foram conduzidos usando o método de imersão nas folhas. As amostras foram diluídas com solução aquosa de Triton X-100 em diferentes concentrações de Av. Repolho ( Brassica oleracea L.) as folhas foram imersas na suspensão diluída de Av, depois secas à temperatura ambiente e fixadas em uma placa de Petri. Larvas de afídeos foram introduzidas em cada placa, e os afídeos tratados foram cultivados em uma incubadora a 25 ° C e 75% de umidade relativa. Quatro repetições foram realizadas para comparar com o teste de controle. A mortalidade foi avaliada 48 horas após o tratamento. Os dados de concentração-mortalidade foram analisados usando o software estatístico DPS v12.01. As concentrações letais medianas (LC ₅₀ ) e seus limites de confiança de 95% foram calculados. WDG comercial foi usado como um controle.

Resultados e discussão

Construção e caracterização do sistema de nanotransmissão de avermectina

Os nanossistemas de entrega Av foram construídos de acordo com o procedimento mostrado na Fig. 1. Durante o processo, as fases de água e óleo foram preparadas de acordo com o método mencionado acima. A fase oleosa foi emulsionada em uma fase aquosa (emulsão óleo-em-água) por emulsificação de alto cisalhamento, para preparar uma emulsão grosseira. A emulsão do curso foi então uniformemente dispersa por emulsificação ultrassônica. Seguiu-se agitação, evaporação e centrifugação das nanopartículas resultantes. O tamanho da partícula de um sistema de entrega é um dos fatores mais importantes que afetam as propriedades de liberação e a atividade biológica do pesticida. Como mostrado na Fig. 2, os sistemas de nano-entrega Av com tamanhos de partícula variando de 344 a 827 nm foram construídos controlando os parâmetros de síntese. O tamanho da partícula é um parâmetro importante para as propriedades de liberação controlada de pesticidas. O tamanho de partícula dos sistemas de nano-entrega Av pode ser controlado alterando a razão de concentração de PVA / gelatina. Vários sistemas de nano-entrega de Av foram preparados com tamanhos variando de 344 a 827 nm e conteúdos de Av variando de 33,4 a 57,5% (33,4, 44,9, 45,2 e 57,5%), como mostrado na Fig. 3. Todos os produtos de Av tiveram fluidez superfícies e morfologias de partículas esféricas.

Esquema mostrando a preparação do sistema Av nano-entrega

Imagens SEM ( a - d ) e distribuições de tamanho ( e ) de sistemas de nano-entrega Av com diferentes tamanhos de partícula

Quantidades de Av em sistemas de nano-entrega de Av com diferentes tamanhos de partícula

Liberação de Avermectina do Sistema de Nanodistribuição In Vitro

Nos últimos anos, o desenvolvimento de sistemas de liberação de pesticidas fez a transição para uma liberação precisa e quantitativa, em contraste com os sistemas anteriores de liberação lenta e qualitativa. Para alcançar a liberação controlável, os perfis de liberação dos sistemas de nano-entrega Av com vários tamanhos de partícula foram sistematicamente investigados. A Figura 4 mostra a liberação percentual de Av dos sistemas de nano-entrega com tamanhos de partícula diferentes após o mesmo intervalo de tempo. O Av técnico teve uma taxa de liberação rápida e foi quase totalmente liberado após 25 h. O período de validade duradouro do pesticida precisa da liberação sustentada de pesticidas para manter a eficácia por um longo tempo. Em comparação com a liberação rápida da abamectina técnica, todos os sistemas de nanotransmissão preparados liberaram Av em velocidades relativamente lentas e mantiveram a liberação sustentada por períodos mais longos. Os perfis de liberação Av dos sistemas de nano-entrega consistiam em uma liberação rápida seguida por uma liberação gradual ao longo do período de 240 horas do experimento. Conforme o tamanho do sistema de entrega diminuiu de 827 para 344 nm, a liberação cumulativa aumentou de 53,2 para 79,4% após 240 h. Os resultados indicaram que a taxa de liberação de Av do sistema de nano-entrega aumentou gradualmente com a diminuição do tamanho das partículas. Isso ocorreu devido a uma área de superfície maior sendo exposta ao ambiente, auxiliando na penetração e na efusão do pesticida localizado nas cascas do sistema de nanodistribuição. Os resultados mostraram que a taxa de liberação de Av do sistema de nano-entrega pode ser controlada de forma eficaz, modificando o tamanho da partícula.

Comportamentos de liberação de sistemas de nano-entrega Av com diferentes tamanhos de partícula em etanol / água (50:50, v / v ) mais de 200 h

Atividade biológica

A atividade biológica de Av liberada de sistemas de nano-entrega de diferentes tamanhos de partícula contra pulgões é mostrada na Fig. 5. O LC ₅₀ do sistema Av nano-entrega diminuiu gradualmente com a diminuição do tamanho das partículas. A biodisponibilidade das nanoemulsões é supostamente mais alta do que a das emulsões convencionais devido ao seu menor tamanho de partícula e maior relação superfície-volume. Portanto, as atividades biológicas mais elevadas dos sistemas de nanotransmissão Av com tamanhos de partícula menores foram atribuídas ao aumento da dispersibilidade, molhabilidade e retenção causada por efeitos em pequena escala. Todos os sistemas de nano-entrega da Av tinham LC ₅₀ inferior valores e atividades superiores ao comercial Av WDG. A alta eficácia foi devido às nanopartículas que aumentam a adesão e a penetração do pesticida Av na superfície das plantações, o que reduz a perda de pesticida devido ao vazamento durante a pulverização.

Resultados de bioensaios de sistemas de nano-entrega Av com diferentes tamanhos de partícula

Propriedades de proteção UV da Avermectina no sistema de nanotransmissão

Para verificar as propriedades de proteção UV de Av no sistema de nanotransmissão, a taxa fotolítica de Av foi estimada por irradiação artificial. A análise da taxa de fotólise de Av com o tempo de irradiação é mostrada na Fig. 6. A porcentagem fotolítica de abamectina foi de 18,7% para o sistema de nano-entrega e 46,7% para o Av WDG comercial após 48 h. Após 72 h, a porcentagem fotolítica de abamectina foi de 25,6% para o sistema de nano-entrega e 51,5% para o Av WDG comercial. Estes resultados mostraram que o sistema de nano-entrega exibiu fotólise inibida de Av devido ao efeito protetor do transportador de parede.

Comparação da porcentagem de fotólise Av com o WDG comercial e sistema de nano-entrega sob irradiação UV

Estabilidade de armazenamento

As estabilidades dos sistemas de nano-entrega Av com diferentes tamanhos de partícula foram avaliadas medindo seus conteúdos de carga a temperaturas de 0, 25 e 54 ° C. A Figura 7 mostra que o sistema de nano-entrega permaneceu estável sem grandes mudanças no carregamento de Av durante o armazenamento em temperatura ambiente e baixa temperatura. Uma pequena perda de Av foi observada após 14 dias a 54 ° C, devido à degradação de Av em altas temperaturas. Esses resultados mostraram que o sistema de entrega nanométrica Av tinha boa estabilidade de armazenamento.

Estabilidade do sistema de nano-entrega Av em diferentes temperaturas de armazenamento

Conclusões

Para melhorar a liberação controlada, estabilidade química e bioatividade de Av, um sistema de nano-entrega Av com diferentes tamanhos médios de partícula foi sintetizado usando o método de polimerização em emulsão. O sistema de nano-entrega da Av mostrou um comportamento de liberação consistente. A taxa de liberação de Av do sistema de nano-entrega aumentou gradualmente com a diminuição do tamanho das partículas, devido à maior área de superfície. A atividade biológica do sistema de nano-entrega Av aumentou gradualmente com a diminuição do tamanho das partículas, devido à adesão e penetração aprimoradas. O sistema Av nano-entrega mostrou boas propriedades anti-fotólise e estabilidade. O sistema de entrega supera as deficiências dos biopesticidas atuais, como sua sensibilidade ambiental, adsorção de solo indesejável e curta duração da atividade. Isso melhorará a eficácia do pesticida e diminuirá a frequência de pulverização necessária.

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