Óxido de Grafeno Funcionalizado com Taurina para Liberação de 5-Fluorouracil: Fabricação, Caracterização e Eficácia Anticâncer

Resumo

Recentemente, sistemas nanocarreadores para fármacos anticâncer, especialmente sistemas de liberação de fármacos baseados em GO, tornaram-se um benefício para pacientes com câncer. Neste estudo, escolhemos Taurina (Tau) para funcionalizar a superfície do GO para melhorar sua biocompatibilidade. Primeiramente, GO nanoescala foi sintetizado pelo método modificado de Hummer e método de descascamento ultrassônico. O carreador de óxido de grafeno modificado com taurina (Tau-GO) foi sintetizado por método químico para obter Tau-GO que tem boa dispersibilidade e estabilidade em água, com potencial zeta de -38,8 mV e tamanho de partícula de 242 nm. Baseado nos critérios de avaliação de eficiência de encapsulamento, a formulação ótima foi determinada para combinar Tau-GO e 5-FU por ligação não covalente. O 5-FU-Tau-GO foi mais estável em ambiente neutro que em ácido, e com certa resposta de pH e efeito de liberação sustentada. In vivo, comparamos administrações oral e intravenosa de 5-FU e 5-FU-Tau-GO, respectivamente, usando testes farmacocinéticos e parâmetros relacionados e mostramos que 5-FU-Tau-GO administração oral ou intravenosa prolonga o tempo de ação do 5-FU no corpo e melhora sua biodisponibilidade. Além disso, a inibição de células HepG2 medida pelo ensaio MTT mostrou que o valor IC₅₀ do 5-FU foi 196 ± 8,73 μg/mL, e o valor IC₅₀ do 5-FU-Tau-GO foi 65,2 ± 0,7 μg/mL, indicando que 5-FU-Tau-GO é mais potente contra células HepG2 e tem efeito inibitório mais forte em células cancerígenas. O efeito na morfologia celular medido pela coloração AO/EB também mostrou que 5-FU-Tau-GO não apenas desestruturou células, mas também induziu apoptose significativamente comparado ao 5-FU. Também verificamos por desenho assistido por computador que Tau-GO pode ligar melhor ao 5-FU que GO não modificado, e que o sistema 5-FU-Tau-GO formado é mais estável, e propício à transferência e liberação de 5-FU in vivo.

Introdução

Quimioterapia ainda é um método comum usado no tratamento de vários cânceres [1]. Um obstáculo significativo da maioria dos agentes quimioterápicos é sua incapacidade de penetrar tecidos tumorais, em concentrações efetivas, ou seus efeitos colaterais indesejados em tecidos normais [2]. Portanto, cientistas concentraram esforços no desenvolvimento de um sistema potente de liberação de fármacos que possa alcançar taxa controlada de liberação do fármaco em tecidos tumorais para garantir liberação e terapia efetivas.

Muitos materiais nanoestruturados incluindo lipossomos [3], polímeros [4], nanopartículas [5], dendrímeros [6], micelas [7] e óxido de grafeno [8, 9] foram desenvolvidos para liberação de vários fármacos. Entre estes nanomateriais, óxido de grafeno (GO) é um nanomaterial de carbono inovador que é esfoliado quimicamente de grafite oxidado e exibe várias propriedades físico-químicas fascinantes, como grupos funcionais abundantes, grande área de superfície específica, alta capacidade de carga de fármaco e excelente capacidade de dispersão em água [10-12]. Além disso, a maioria dos resultados experimentais in vitro mostrou que baixa concentração de GO poderia ser usada como substrato para crescimento celular e ativação de células imunes. Portanto, GO tem sido amplamente usado em diagnóstico de doenças [13], imagem e rastreamento de células cancerígenas [14], terapia fototérmica de câncer [15], engenharia de tecidos [16], liberação de fármacos direcionada [17], e especialmente, como carreador de fármacos anti-tumorais [18, 19]. No entanto, vários grupos de pesquisa relataram que alta concentração de GO tem efeitos citotóxicos óbvios em estudos pré-clínicos e clínicos. O mecanismo pelo qual GO produz efeitos tóxicos in vivo é através de estresse oxidativo e superprodução de espécies reativas de oxigênio intracelulares, induzindo apoptose celular e causando inflamação severa, edema pulmonar e formação de granuloma [20]. Portanto, é de importância crítica resolver a questão da toxicidade do GO.

Relatadamente, funcionalização de ligações covalentes ou não covalentes pode reduzir a forte interação hidrofóbica entre GO e células. Isso foi demonstrado por vários estudos que mostraram que funcionalização de GO melhora sua biocompatibilidade e quase elimina sua toxicidade in vivo e in vitro. Yang et al. estudaram, pela primeira vez, a biodistribuição a longo prazo de PEG-GO conjugado covalentemente em camundongos usando método de radiomarcação, e resultados mostraram que PEG-GO poderia ser gradualmente excretado de camundongos, provavelmente na urina e fezes [21]. Zhang et al. compararam GO funcionalizado com DEX com GO e encontraram que GO-DEX poderia reduzir notavelmente toxicidade celular e ser mostly eliminado de camundongos dentro de uma semana [22]. Além disso, ligação não covalente de GO a pluronic F127 resulta em solubilidade e estabilidade benignas em condições fisiológicas, e baixa toxicidade [23]. Embora vários polímeros ou moléculas tenham sido usados para funcionalizar GO, resultados significativos foram alcançados neste campo. No entanto, esforços ainda são necessários para desenvolver métodos simples para construir um bom carreador de fármacos baseado em GO biocompatível.

Taurina (Tau) é um aminoácido semi-essencial com boa estabilidade e solubilidade em água. Tau pode prevenir doenças cardiovasculares e cerebrovasculares, manter função visual, proteger células e regular imunidade. Numerosos estudos propuseram que Tau tem propriedades antitumorais através de sua regulação para cima ou para baixo de fatores de expressão que desempenham papéis importantes em vários cânceres, incluindo pulmão, estômago, colorretal e mama [24]. Assim, GO funcionalizado com Tau pode exercer papel superior como carreador de fármacos anti-tumorais. Neste artigo, usamos, pela primeira vez, GO funcionalizado covalentemente com Tau como nanocarreador e avaliamos sua citotoxicidade in vitro. Além disso, 5-fluorouracil (5-FU) foi usado como fármaco anticâncer que foi carregado não-covalentemente na superfície de Tau-GO para construir sistema de liberação de fármacos. O 5-FU-Tau-GO não só poderia reduzir efeitos colaterais em tecidos normais mas também melhorar biodisponibilidade do fármaco. Consequentemente, Tau-GO foi desenvolvido com sucesso como novo nanomaterial baseado em GO que pode ter aplicações biomédicas significativas no futuro.

Experimentos e Métodos

Materiais

Pó de grafite, tampão fosfato salino (PBS) e dimetil sulfóxido (DMSO) foram comprados da Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Carbodiimida (EDC), N-hidroximida (NHS), ácido clorídrico (HCl) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂ 30%) foram comprados da Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurina (Tau), 5-fluorouracil (5-FU), células de hepatoma humano (HepG2), solução penicilina-estreptomicina e soro fetal bovino (FBS) foram comprados da Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; ácido sulfúrico (H₂SO₄ 98%) e permanganato de potássio (KMnO₄) foram comprados da Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; nitrato de sódio (NaNO₃) e dodecil sulfato de sódio (SDS-Na) foram comprados da Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT foi comprado da Sigma-Aldrich, Inc; DMEM foi comprado da HyClone, Inc; Os ratos foram comprados do Centro Experimental de Animais Benxi Changsheng. Todos os outros reagentes e químicos eram analiticamente puros e comercialmente disponíveis.

Síntese do GO

O GO foi preparado a partir de pó de grafite de acordo com método modificado de Hummer. Primeiramente, 168 mL de ácido sulfúrico 98% foi adicionado ao longo da parede do balão de um balão de três bocas colocado em banho de gelo com termômetro, e 5 g grafite e 4 g nitrato de sódio foram adicionados quando temperatura atingiu 5 °C. Então, 22,5 g de permanganato de potássio foi adicionado lentamente em lotes por 1 h e temperatura mantida abaixo de 5 °C. Após isso, o balão de três bocas foi transferido para banho de óleo e a mistura obtida reagiu a 35 °C por 30 min, então temperatura aumentada para 65 °C e reação agitada por 30 min. Seguindo este passo, temperatura aumentada para 85 °C e mistura further reagiu por 1 h para obter pasta marrom-roxa. Esta mistura ficou em repouso à temperatura ambiente por 1 semana, transferida para béquer com 700 mL de água quente, e peróxido de hidrogênio 30% adicionado gota a gota até ficar marrom-amarelado. A mistura foi centrifugada a 10.000 rpm, lavada com água quente, e este processo repetido várias vezes até pH do sobrenadante ser 7,0. Finalmente, produto foi secado em secador a vácuo por congelamento e nano GO obtido.

Síntese do Tau-GO

Um GO pesado precisamente 50 mg foi dissolvido em 50 mL água destilada, e 150 mg EDC e 100 mg NHS foram adicionados para ativar o GO por ultrassonificação em banho de água gelada por 20 min. Em seguida, 10 mL solução aquosa de Tau (0,1 g/mL) foi adicionada lentamente (gotas) na solução aquosa de GO preparada, e pH ajustado para 6-7 por HCl e agitado continuamente por 24 h à temperatura ambiente no escuro. Produto foi coletado por centrifugação a 5000 rpm por 10 min e lavado 3 vezes com água destilada. Tau-GO foi coletado após liofilização.

Carregamento de 5-FU

Quantidade de 20 ml solução Tau-GO foi ultrassonicada por 2 h. Quantidade pesada precisamente de 5-FU foi dissolvida em quantidade apropriada de água destilada, e adicionada lentamente gota a gota na solução Tau-GO preparada sob agitação à temperatura ambiente, então sonicada a 30 °C no escuro por 1,5 h. Produtos foram centrifugados a 5000 rpm por 10 min a 4 °C. Sedimento inferior lavado com 20 mL água destilada e centrifugado (5000 rpm por 10 min a 4 °C), e processo repetido 3 vezes. Camada inferior liofilizada, sobrenadante colocado em béquer, volume pesado, concentração de 5-FU determinada por HPLC 1200 (Agilent, EUA). Condições de detecção: coluna cromatográfica: C18 (4,6 × 250 nm, 5 μm); temperatura da coluna: 25 °C; fase móvel: solução 0,1% KH₂PO₄ com pH 5,5; taxa de fluxo: 1,0 mL/min; volume de injeção: 20 μL; comprimento de onda de medição: 265 nm. Razão de encapsulamento (EE) e eficiência de carga de fármaco (LE) obtidas pela fórmula:

$$\begin{aligned} \text{EE}(\%) &= \frac{M_1 - C_1 \times L_1}{M_1} \times 100\% \\ \text{LE}(\%) &= \frac{M_1 - C_1 \times L_1}{20C_0 + M_1 - C_1 \times L_1} \times 100\% \end{aligned}$$

Dose total de 5-FU registrada como M₁, concentração e volume de 5-FU livre registrados como C₁ e L₁, e concentração do carreador registrada como C₀.

Caracterização

Para caracterizar o nanocompósito preparado, espectros de transformada de Fourier infravermelho (FT-IR) foram varridos de 4000 a 400 cm⁻¹ no espectrômetro IRAffinity-1 (Shimadzu, Japão) para confirmar interações. Espectros de absorção UV-vis foram registrados no Espectrofotômetro de Varredura UV-3600 (Shimadzu, Japão). Amostras dissolvidas em água destilada e tamanhos de partícula, potenciais zeta e valores PDI obtidos no instrumento Nano-ZS 90 Nano (Malvern, UK). Morfologias das amostras analisadas usando microscopia eletrônica de transmissão JEM-2100 (MET) (JEOL, Japão). Análises termogravimétricas (TGA) realizadas usando analisador termogravimétrico (NETZSCH, Alemanha) a taxa de aquecimento 10 °C/min de 0 a 800 °C sob atmosfera de nitrogênio. Medição XRD das amostras realizada por difratômetro de raios X (Bruker, Alemanha) com radiação CuKα de cobre (λ = 1,5406 Å) em ângulo amplo com ângulo 2θ. Medições XPS realizadas usando sonda ESCA Omicron com radiação Al Kar monocromatizada (Thermo, América).

Liberação de Fármaco In Vitro

Liberação de fármaco in vitro realizada a pH 1,2 (ambientes gástricos simulados), pH 6,5 (ambiente de célula de câncer de fígado simulado) e pH 7,4 (simular ambiente fisiológico) a 37 °C (temperatura corporal simulada), respectivamente. Em resumo, 15 mg de 5-FU-Tau-GO colocado em membrana de diálise, imerso em 50 mL soluções tampão contendo 0,1% SDS-Na com pH 1,2, 6,5 e 7,4. Todas amostras colocadas em banho de água com agitação contínua a velocidade 100 rpm e temperatura 37 °C. Em pontos de tempo predeterminados (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h), 1 mL de cada amostra retirado e substituído por 1 mL solução tampão fresca contendo 0,1% SDS-Na para manter mesmo volume de meio de liberação. Meio liberado centrifugado e analisado usando HPLC 1200.

Estudos de Citotoxicidade In Vitro

Ensaio MTT

Ensaio MTT usado para avaliar citotoxicidade de 5-FU, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO. Brevemente, células de hepatoma humano HepG2 cultivadas em meio DEME, suplementado com 10% FBS e 1% antibióticos (solução penicilina-estreptomicina) a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% CO₂. Células semeadas em placa de 96 poços a densidade 5 × 10³ células por poço contendo 100 μL meio DEME suplementado com FBS e antibióticos. Placa colocada por 24 h em câmara umidificada a 37 °C contendo 5% CO₂. Após isso, meio de crescimento removido e reposto com 100 μL meio fresco contendo várias concentrações (5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 μg/ml) de 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO, respectivamente. Após incubação 24 h, células tratadas com 20 μL solução MTT e further incubadas por 4 h. Em seguida, meio aspirado, e cristais de formazan dissolvidos em 150 μL DMSO. Finalmente, placas de poços agitadas a 37 °C por 15 min em oscilador de temperatura constante. Densidade óptica (OD) de cada amostra medida a 570 nm usando leitor de microplacas. Experimentos realizados em triplicata. Taxa de inibição celular calculada dos resultados usando fórmula:

$$\text{Taxa de inibição celular} = \frac{\text{OD}_{\text{controle}} - \text{OD}_{\text{tratado}}}{\text{OD}_{\text{controle}}} \times 100\%$$

onde OD_controle é absorbância obtida por células controle não tratadas, OD_tratado é absorbância obtida por células tratadas.

Ensaio de Coloração AO/EB

Coloração dupla AO/EB usada para avaliar mudanças morfológicas das células tratadas com 5-FU, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO. Brevemente, células HepG2 em fase de crescimento logarítmico semeadas em placa de 6 poços a densidade 10.000 células por poço e cultivadas em incubadora a 37 °C sob atmosfera 5% CO₂. Após 24 h, células tratadas com concentração fixa de 5-FU, Tau-GO ou 5-FU-Tau-GO, e further incubadas por 24 h. Meio em cada poço removido e células lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, 1 mL PBS suplementado com 40 μL corantes fluorescentes (1 mg/mL AO e 1 mg/mL EB misturados na razão 1:1) adicionados a cada poço e incubados por 10 min sem luz. Células coradas observadas sob microscópio de fluorescência e imagens tiradas aleatoriamente.

Estudo Farmacocinético

Todos experimentos com animais conduzidos de acordo com políticas e princípios formulados pelo Comitê de Proteção e Ética Animal. Total de 24 ratos SD machos, com pesos corporais 230-270 g, jejuados por 12 h e aleatoriamente divididos em 4 grupos antes da administração do fármaco. Grupos A e B injetados intravenosamente com soluções 5-FU e 5-FU-Tau-GO, e grupos C e D receberam 5-FU e 5-FU-Tau-GO orais, respectivamente. Todos grupos receberam dose de 20 mg/kg. Após administração do fármaco, amostras de sangue (cerca de 0,5 mL) coletadas em tubos anticoagulantes em pontos de tempo dados (15 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h e 48 h). Amostras de plasma separadas por centrifugação a 7500 rpm e 4 °C por 10 min. Então, 200 μL plasma e 50 mg (NH₄)₂SO₄ combinados em tubo (10 μL solução padrão interna 5-BrU 40 μg/mL, seco com nitrogênio em banho de água 40 °C, vortex por 5 min e centrifugado a 10800 rpm por 3 min. Em seguida, tubo adicionado com 900 μL solução acetato de etila/isopropanol (85:15, v/v), vortex por 3 min e centrifugado a 10800 rpm por 15 min. Sobrenadante removido e seco com nitrogênio, 100 μL fase móvel adicionado e tubo vortex por 1 min. Finalmente, solução resultante coletada do sobrenadante medida por HPLC 1200.

Simulação de Dinâmica Molecular

Simulação de dinâmica molecular principalmente usada para analisar força de interação entre fármaco e carreador e comportamento de difusão do fármaco. Estrutura química do 5-FU construída usando Chemdraw do chem office 2014, e estruturas do Tau-GO e GO conduzidas no módulo Polymer and Molecule Builders usando software de simulação molecular Materials Studio (versão 7.0, Accelrys Inc., EUA). Todos compostos construídos geometricamente otimizados sob campo de força COMPASS II, e conformação com menor energia selecionada como conformação estável. Equilíbrio NVT de 10 ps conduzido para cada sistema. Simulação realizada com 100 ps MD para obter estrutura equilibrada a 298 K e 101,325 kPa com tamanho de passo 1 fs. Finalmente, deslocamento quadrático médio (MSD) e densidade de energia coesiva (CED) obtidos para cada sistema, e coeficiente de difusão (D) dado pela fórmula:

$$D = \frac{1}{2d}\lim_{\tau \to \infty} \frac{d}{d\tau}\left[ \left. \vec{r}(t) - \vec{r}(0) \right]^2 \right.$$

onde d é dimensão do sistema, \(\vec{r}(t)\) e \(\vec{r}(0)\) são vetores de posição da molécula de fármaco no tempo t e 0, respectivamente, \(\left[ \vec{r}(t) - \vec{r}(0) \right]^2\) representa MSD.

Resultados e Discussão

Caracterização

O conjugado Tau-GO foi fabricado por ligação amida de GO e Tau. Síntese bem-sucedida do nanocompósito validada por espectros FT-IR (Fig. 1). Presença de funcionalidades de oxigênio no GO confirmada por picos de absorbância em –OH (~3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹) e C–OH (1391 cm⁻¹). Estes resultados provaram preparação bem-sucedida do GO (Fig. 1a) [25]. Além de alguns picos característicos do GO, novos picos a 1638 cm⁻¹ e 3427 cm⁻¹ corresponderam ao grupo amida, e 1164 cm⁻¹ e 1085 cm⁻¹ corresponderam a –SO. Espectro Tau-GO indicou claramente que Tau foi funcionalizado na superfície do GO (Fig. 1b). Na Fig. 2b, pico característico de –SO₃ a 1164 cm⁻¹ foi encoberto pela ação de ligação de hidrogênio e não visível nos espectros FT-IR. Portanto, 5-FU foi carregado com sucesso no Tau-GO.

Os espectros de absorção UV-Vis do GO são mostrados na Fig. 3. Pico de absorção óbvio a 234 nm atribuído à transição π–π* das ligações C=C do grafeno. Além disso, pico de ombro a 300 nm atribuído à transição n–π* das ligações C=O do óxido de grafeno nos grupos carboxila ou carbonila. Dois picos de absorção característicos provaram preparações bem-sucedidas do GO.

Tamanhos do GO, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO mostrados na Fig. 4. Potenciais zeta do GO, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO mostrados na Fig. 5. Tamanho das folhas GO foi aproximadamente 221 nm e valor PDI aproximadamente 0,188, indicando que GO preparado tem distribuição uniforme e boa estabilidade. Potencial zeta aproximadamente -33,3 mV, indicando que carga negativa principalmente devido à presença de muitos grupos contendo oxigênio na superfície. Quando GO modificado com Tau via ligação amida, grupos amino substituíram alguns grupos carboxila e –SO₃ teve maior capacidade de ionização em solução, potencial zeta diminuiu e tornou-se -38,8 mV. Tamanho e valores PDI do Tau-GO aproximadamente 242 nm e 0,190. Em seguida, 5-FU carregado no Tau-GO por ligação não covalente. Potencial zeta aproximadamente -26,7 mV e valor absoluto maior que 20 mV. Além disso, tamanho e valores PDI do 5-FU-Tau-GO aproximadamente 264 nm e 0,182, isso indica que repulsão eletrostática entre partículas é grande, não fácil causar agregação ou precipitação, e que Tau tem boa solubilidade em água, GO também tem boa solubilidade em água porque sua superfície modificada por grupos funcionais contendo oxigênio. Uso de carreador Tau-GO para carregar 5-FU melhora significativamente solubilidade em água do 5-FU, para que 5-FU-Tau-GO possa ser disperso estavelmente em solução aquosa.

Morfologias do GO, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO caracterizadas por MET (Fig. 6). GO é estrutura plana com rugas na superfície, ilustrando que é estrutura bidimensional planar (Fig. 6a). Comparado com GO, tamanho do Tau-GO ligeiramente aumentado, mas ainda mostrou estrutura lamelar (Fig. 6b). Imagem 5-FU-Tau-GO mostrou que materiais não agregaram ou mudaram com estrutura lamelar inicial do GO permanecendo intacta (Fig. 6c). Consequentemente, Tau-GO e 5-FU-Tau-GO tiveram boa estabilidade.

Análise termogravimétrica usada para quantificar composições dos compostos. Curvas TGA do GO e Tau-GO mostradas na Fig. 7. GO e Tau-GO têm massas remanescentes de 39,73% e 34,22% em atmosfera de nitrogênio a 800 °C. Portanto, comparando valores de mudança de peso, conteúdo de Tau no Tau-GO determinado como aproximadamente 13%.

Padrões XRD de Tau, GO e Tau-GO mostrados na Fig. 8. Pico característico do GO observado a 10,7° do valor 2θ, confirmando formação de GO com oxidação completa por forte oxidação química e processo de esfoliação. Após funcionalizado com Tau na superfície do GO, padrão de difração de pico ligeiramente diminuiu a valor 2θ 8,2. Isso significa que GO foi funcionalizado com sucesso por Tau.

Espectros C1s XPS do GO e Tau-GO mostrados na Fig. 9. Espectros C1s XPS do GO indicam grau considerável de oxidação, com presença de quatro átomos de carbono correspondentes a diferentes grupos funcionais. Espectros C1s XPS do Tau-GO também exibem estes mesmos átomos de carbono. Além disso, aparição de picos de componentes relacionados a ligação C-N atribuídos a grupos amino, amida. Estes resultados também indicam que GO funcionalizado com sucesso por Tau.

Comportamentos de Carga e Liberação de Fármaco

5-FU adsorvido no nanocarreador Tau-GO através de interações não covalentes. Curva de calibração do 5-FU foi y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), e faixa de 6,5 ~ 250 µg/mL. Razão de encapsulamento (EE) e eficiência de carga de fármaco (LE) determinadas por concentrações de fármaco não ligado para avaliar desempenho de carga de fármaco. Resultados mostraram que EE aumentou com aumento na concentração do fármaco, e maior valor de EE foi 83,2%. Segundo fórmula, LE foi 33,7%, ou seja, 508,52 μg de 5-FU podem ser adsorvidos em 1 mg de Tau-GO. Portanto, Tau-GO é carreador de fármacos promissor que pode alcançar grande carga de fármacos. Os possíveis mecanismos da alta capacidade de carga de 5-FU no Tau-GO podem ser resumidos: primeiro, Tau usado para funcionalizar GO e introduzir grupos funcionais ativos (–SO₃). –SO₃ tem forte capacidade de ionização em solução, reduzindo aglomeração entre GO e facilitando carga de 5-FU no Tau-GO. Segundo, potencial zeta do 5-FU-Tau-GO é 12,1 mV diferente do Tau-GO, indicando que 5-FU carregado na superfície do Tau-GO, e interação eletrostática desempenha papel importante na carga de 5-FU. Por fim, existem muitas formas de ligações de hidrogênio entre 5-FU e carreador Tau-GO, incluindo –COOH no Tau-GO e –NH– no 5-FU, –COOH no Tau-GO e C=O no 5-FU, –OH no Tau-GO e –NH– no 5-FU, –OH no Tau-GO e –C=O no 5-FU, –COOH e 5-FU no Tau-GO –F no Tau-GO, –COOH no Tau-GO e –F no 5-FU, estas ligações de hidrogênio tornam 5-FU-Tau-GO estável em solução.

A liberação cumulativa in vitro de 5-FU do 5-FU-Tau-GO, a temperatura 37 °C em pH 1,2, 6,5 e 7,4 solução PBS (simular ambiente gástrico, ambiente de célula de câncer de fígado e ambiente fisiológico, respectivamente) mostrada na Fig. 10. Encontra-se que comportamento de liberação de 5-FU afetado pelo valor de pH do ambiente. Em tampão pH 7,4, liberação do fármaco foi lenta e contínua, e quantidade total de fármaco liberado aproximadamente 70,84% após 72 h. Em contraste, quantidade de fármaco liberado a pH 7,4 significativamente menor que a pH 1,2 e pH 6,5 no mesmo ponto de tempo. Carga total de fármaco liberada do 5-FU-Tau-GO alcançada aproximadamente 90,29% e 85,75% a pH 1,2 e pH 6,5, respectivamente. Pode ser atribuído às interações π-π e ligações de hidrogênio entre 5-FU e Tau-GO. Quanto menor valor de pH, maior grau de protonação da ligação de hidrogênio. Portanto, força da ligação de hidrogênio controlada por valor de pH, levando à liberação de 5-FU. Este sistema de liberação de fármacos sensível a pH desempenha papel importante em fármacos anti-tumorais e pode alcançar liberação do fármaco na célula tumoral.

Estudos de Citotoxicidade In Vitro

Para avaliar toxicidade potencial e eficácia de terapia tumoral do nanocarreador, viabilidade celular in vitro realizada em células HepG2 usando ensaios MTT (Fig. 11). Tau-GO não mostrou citotoxicidade significativa em diferentes concentrações. Após carga de 5-FU, 5-FU-Tau-GO mostrou efeito inibitório óbvio, e de maneira dependente da dose, portanto, nanocarreador teve capacidade de liberar fármacos antitumorais. Valor IC₅₀ do 5-FU-Tau-GO foi 65,2 ± 0,7 μg/mL, que foi mais tóxico que 5-FU livre (196 ± 8,73 μg/mL). Isso pode ser devido à capacidade da taurina de induzir apoptose em células tumorais, aumentando indiretamente efeito inibitório do 5-FU nas células. Além disso, visto do experimento de liberação in vitro que 5-FU carregado no Tau-GO poderia ser liberado gradualmente nas células. Portanto, tempo efetivo do 5-FU-Tau-GO nas células foi maior que 5-FU livre, e assim produziu melhor inibição.

Agente fluorescente AO podia emitir fluorescência verde quando passava através de membranas celulares intactas e coloria núcleos, enquanto EB apenas marcava núcleo de células danificadas que emitiam fluorescência vermelha/alaranjada. Células com apoptose inicial e tardia apresentaram núcleos verde-amarelados ou alaranjados com coloração AO/EB, respectivamente. Portanto, coloração AO/EB realizada para investigar se morte celular associada à apoptose usando características de mudanças morfológicas celulares. Resultados obtidos da coloração AO/EB apresentados na Fig. 12. Células controle em forma de fuso e com núcleos verdes. No grupo celular cultivado com Tau-GO sozinho, pequenas partes dos núcleos invaginadas e com coloração verde-escuro ou vermelho-alaranjado. Células apoptóticas significativas alaranjadas ou vermelhas com fragmentos de cromatina e corpos apoptóticos observadas no grupo 5-FU sozinho. Comparado com 5-FU, 5-FU-Tau-GO causou mais dano à morfologia de células HepG2, que não apenas quebrou células, mas também causou grande quantidade de apoptose em células cancerígenas. Como visto nas imagens, quase todas as células tratadas com 5-FU-Tau-GO tiveram mudanças morfológicas, grande número de detritos celulares e corpos apoptóticos, indicando que sistema nano de liberação de fármacos 5-FU-Tau-GO teve bom efeito de morte em células HepG2.

Estudos Farmacocinéticos

Estudos farmacocinéticos de 5-FU e 5-FU-Tau-GO realizados em ratos SD. Perfis de concentração de 5-FU no plasma vs. tempo, após administração oral, apresentados na Fig. 13a. Encontramos que tendência das duas curvas similar, mas concentração de 5-FU no plasma do nanocarreador 5-FU-Tau-GO foi maior que 5-FU sozinho e isso observado em cada ponto de tempo medido. Figura 13b mostra perfis de liberação in vivo de 5-FU via veia da cauda. 5-FU-Tau-GO pôde alcançar liberação sustentada do fármaco por 24 h, e concentração do fármaco diminuiu gradualmente nas primeiras horas, indicando que 5-FU foi liberado lentamente.

Modelo de dois compartimentos usado para analisar parâmetros farmacocinéticos de administração oral ou intravenosa em ratos. Parâmetros farmacocinéticos apresentados na Tabela 1. Comparado com 5-FU, 5-FU-Tau-GO mostrou T_1/2β maiores que foram 2,3 vezes por administração oral, e 3,0 vezes por injeção intravenosa, respectivamente. Além disso, área sob curva de concentração-tempo (AUC_0-t) dos nanocomplexos 5-FU-Tau-GO foi aproximadamente 2,1 vezes maior via administração oral, e 2,8 vezes maior via injeção intravenosa quando comparado ao da solução 5-FU, respectivamente. Portanto, concluímos que 5-FU-Tau-GO poderia estender significativamente tempo de retenção do 5-FU in vivo e melhorar biodisponibilidade. Além disso, T_1/2β dos nanocomplexos 5-FU-Tau-GO administrados oralmente (1,67 ± 1,15 h), foi maior que injeção intravenosa (1,33 ± 0,64 h); no entanto, AUC_0-t da administração oral (36,02 ± 1,83 mg/L*h) foi menor que injeção intravenosa (96,50 ± 8,70 mg/L*h). Estes resultados podem ser devidos a dois aspectos: por um lado, quando administrado por injeção intravenosa, fármaco entra diretamente no sistema sanguíneo para circulação sem passar por barreira gastrointestinal para redistribuição; por outro lado, porque 5-FU facilmente causa certo dano ao sistema gastrointestinal, também pode afetar uso efetivo do fármaco no corpo.

Simulações MD

Acoplamento molecular e dinâmica molecular de GO não modificado, Tau-GO e 5-FU simulados por acoplamento molecular e simulação de dinâmica molecular. Resultados de acoplamento molecular de GO, Tau-GO e 5-FU mostrados na Fig. 14, onde pode-se ver que comprimentos de ligação de 5-FU com GO e Tau-GO são 3,66 Å e 2,602 Å, respectivamente. Além disso, dos resultados de cálculo, energias de ligação de 5-FU a GO e Tau-GO foram 47,69 kcal/mol e 25,04 kcal/mol, respectivamente. Estes indicaram que força de ligação de Tau-GO e 5-FU foi mais forte que GO e 5-FU. Isso se deve a átomos polares de Tau, como S e N, formando ligação não covalente mais forte com 5-FU, que torna força entre Tau-GO e 5-FU mais forte.

Diagramas da simulação de dinâmica molecular de GO, Tau-GO e 5-FU mostrados na Fig. 15. Segundo resultados de cálculo, CED de 5-FU-GO e 5-FU-Tau-GO foram 2,67×10⁸ e 2,83×10⁸, respectivamente. Estes resultados mostraram interação mais forte entre fármaco e Tau-GO. Gráficos entre MSD e tempo plotados (Fig. 16) para obter coeficiente de difusão via MSD. Coeficientes de difusão do fármaco obtidos pela inclinação dividida por 6 como segue: 0,094 m²/s e 0,058 m²/s. Estes mostram que força entre Tau-GO e 5-FU é mais forte, consistente com resultados do acoplamento molecular. Portanto, GO funcionalizado torna todo carreador mais abundante em átomos e grupos; portanto, tornando ligação não covalente com 5-FU mais forte, e todo sistema mais estável.

Conclusões

Em resumo, preparamos com sucesso nanocompósito Tau-GO através de método químico simples. Funcionalização do GO com Tau tem boa estabilidade e melhora sua biocompatibilidade. A estrutura única e propriedades brilhantes dos nanocarreadores Tau-GO oferecem grandes oportunidades para carga e liberação de 5-FU. O 5-FU-Tau-GO tem potencial habilidade anti-tumor e excelente tempo de circulação de fármacos. Portanto, acreditamos que modificação do GO pelo carreador Tau para carga de 5-FU, é ferramenta eficaz e aplicável para construir sistema nano de liberação de fármacos 5-FU-Tau-GO para liberação de fármacos anticâncer e terapia anti-tumor.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Os conjuntos de dados usados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis do autor correspondente mediante solicitação razoável.

Abreviações

GO:

Óxido de grafeno

Tau:

Taurina

5-FU:

5-Fluorouracil

5-FU-Tau-GO:

Óxido de grafeno funcionalizado com taurina carregando 5-fluorouracil

EE:

Razão de encapsulamento

LE:

Eficiência de carga de fármaco

FT-IR:

Transformada de Fourier infravermelho

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão

TGA:

Análises termogravimétricas

MSD:

Deslocamento quadrático médio

CED:

Densidade de energia coesiva