Melhorando a magnetofecção de nanopartículas magnéticas de polietilenimina em osteoblastos MG-63 usando um novo campo magnético uniforme

Resumo

Este estudo teve como objetivo melhorar a magnetofecção de osteoblastos MG-63, integrando o uso de um novo campo magnético uniforme com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas modificadas com polietilenimina de baixo peso molecular (PEI-SPIO-NPs). As características excelentes de PEI-SPIO-NPs, como tamanho, potencial zeta, a ligação de pDNA e capacidade protetora foram determinadas como adequadas para entrega de genes. O novo campo magnético uniforme permitiu que nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético modificado com polietilenimina / complexos de pDNA (complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA) se distribuíssem rápida e uniformemente na superfície das células MG-63, evitando a transfecção local e diminuindo a ruptura da membrana causada pela centralização de PEI-SPIO-NPs carregados positivamente, aumentando assim a cobertura eficaz de portadores de genes magnéticos durante a transfecção e melhorando a eficiência da magnetofecção. Este campo magnético uniforme inovador pode ser usado para determinar a quantidade ideal entre PEI-SPIO-NPs e pDNA, bem como a tela para o projeto de formulação ideal de portador de gene magnético sob as condições homogêneas. Mais importante ainda, o novo campo magnético uniforme facilita a transfecção de PEI-SPIO-NPs / pDNA em osteoblastos, proporcionando assim uma nova abordagem para a entrega direcionada de genes terapêuticos a tecidos de osteossarcoma, bem como uma referência para o tratamento de outros tumores.

Histórico

O osteossarcoma é o tumor ósseo maligno mais comum que afeta principalmente crianças e adolescentes. Como as terapias convencionais fornecem melhora limitada, uma nova estratégia para seu tratamento é imperativa [1,2,3]. O advento da terapia gênica levou os pesquisadores a avaliar suas aplicações no osteossarcoma [4,5,6]. Um sistema de entrega de genes seguro e eficaz é fundamental para a terapia gênica. Os sistemas de entrega de genes podem ser divididos em sistemas de entrega de genes virais e sistemas de entrega de genes não virais. Os sistemas de entrega de genes virais mostraram ter alta eficiência de transfecção em uma variedade de células primárias e linhas celulares. Os sistemas de entrega de genes virais estão fortemente associados a questões de segurança, como o desencadeamento de respostas inflamatórias e mutações genéticas [7], levando os pesquisadores a desviar seus estudos para sistemas de entrega de genes não virais. No entanto, a maioria das técnicas de transfecção de genes não virais não foram particularmente eficazes na transfecção de linhas de células de osteossarcoma [8, 9].

Na última década, vários métodos físicos, como armas genéticas [10], ultrassom [11] e eletroporação [12], foram usados ​​de forma eficiente para melhorar a transfecção. No entanto, esses métodos físicos também induzem dano celular [13]. Como os campos magnéticos geralmente não causam danos celulares, a tecnologia de transfecção magnética tem atraído a atenção dos pesquisadores. Mah et al. introduziu nanopartículas magnéticas em experimentos de transfecção de genes, ligando a proteína fluorescente verde (GFP) transportando vírus adeno-associados (rAAVs) a nanopartículas magnéticas para alcançar a transfecção aprimorada específica do alvo tanto in vitro quanto in vivo. Em comparação com adenovírus puros, nanopartículas de adenovírus magnético podem reduzir a dosagem de rAAVs portadores de GFP para 1% sob a mesma condição de taxa de transfecção [14]. Scherer et al. cunhou o termo "magnetofecção" para denotar transfecção mediada por ímã usando partículas magnéticas [15]. Posteriormente, Plank et al. descreveram a técnica de transfecção magnética usando vetores não virais [16]. Para melhorar ainda mais a eficiência de magnetofecção de vetores não virais, Fouriki et al. ajustou a frequência e a amplitude de um campo magnético oscilante para induzir um efeito estimulador mecânico dinâmico em nanopartículas magnéticas, aumentando assim a probabilidade de entrar em contato com as células alvo [17]. Oral et al. Eficiência de transfecção melhorada e citotoxicidade reduzida de portadores de genes girando reversamente o eixo hexagonal do ímã para controlar a velocidade e direção do campo magnético [18]. Em outro estudo, Vainauska et al. usou um campo magnético de gradiente dinâmico que foi gerado girando um ímã permanente cilíndrico para direcionar a entrega de portadores de genes magnéticos [19].

A eficiência da magnetofecção melhorou significativamente à medida que os campos magnéticos evoluíram de estáticos e únicos para dinâmicos e sofisticados. No entanto, estudos com foco na uniformidade e alcance efetivo do campo magnético são limitados. Até onde sabemos, a maioria dos dispositivos magnéticos não pode formar campos magnéticos uniformes em um espaço tridimensional específico, resultando assim na distribuição heterogênea das nanopartículas magnéticas, alcançando apenas a eficácia de transfecção local do campo magnético e deixando de abordar as citotoxicidades resultantes. O campo magnético não uniforme também impede as comparações de reagentes de transfecção magnética, bem como diminui a eficiência da transfecção.

Para resolver esses problemas, nosso grupo de pesquisa em colaboração com a Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Chongqing desenvolveu um novo gerador de campo magnético [20, 21]. O gerador de campo magnético pode formar um campo magnético uniforme a uma certa altura e as nanopartículas magnéticas adicionadas são rápida e uniformemente distribuídas na parte inferior da placa de cultura. O campo magnético uniforme não é apenas conveniente para estudos comparativos sobre a relação entre dose e eficiência de transfecção de vários reagentes de transfecção, mas também pode ser utilizado na avaliação da absorção celular de nanopartículas magnéticas.

No presente projeto, objetivamos estabelecer um sistema confiável de entrega de genes não virais com alta eficiência de magnetofecção em linhas de células de osteossarcoma. A polietilenimina linear Mw20000 (PEI-20000) foi selecionada para a preparação de nanopartículas magnéticas, porque vários estudos anteriores confirmaram que os sistemas de entrega PEI linear têm melhor eficiência de transfecção do que os sistemas de entrega PEI ramificada in vivo [22, 23]. As propriedades de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas modificadas com polietilenimina (PEI-SPIO-NPs) foram avaliadas. Um novo gerador de campo magnético foi desenvolvido para formar um campo magnético uniforme, que foi usado para transfectar complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em linhas celulares de osteossarcoma MG-63. Os efeitos de diferentes campos magnéticos na magnetofecção foram investigados sistematicamente.

Métodos

Materiais e Reagentes

Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO-NPs), cloridrato de polietilenimina (PEI) e Hoechst-33.324 foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, EUA). PolyMag-200 (reagente de magnetofecção comercial) foi obtido de Beijing Chief-East Tech Co., Ltd. (Qwbio) (Pequim, China). 1-Etil-3- [3- (dimetilamino) propil] carbodiimida (EDC) e N -hidroxissuccinimida (NHS) foram adquiridos de Chengdu Xiya Reagent Co. (Sichuan, China). PolyMag-200 e placas magnéticas de cultura de células de 96 poços foram adquiridas de Chemicell GmbH (Berlim, Alemanha). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e penicilina-estreptomicina e soro fetal bovino (FBS) foram obtidos da Invitrogen-Gibco (CA, EUA). O isotiocianato de rodamina B foi obtido na Aladdin Ind., Co. (Shanghai, China). LysoTracker Green DND-26 foi obtido de Shanghai Wei Jin Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). O kit de teste CCK-8 foi obtido da Seven Seas Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) e o Plasmid Maxi Kit-25 livre de Endo foi adquirido da OMEGA (GA, EUA). Solução salina tamponada com fosfato (PBS) e outros reagentes foram preparados em nosso laboratório. Todos os solventes e produtos químicos eram de qualidade analítica.

Síntese de PEI-SPIO-NPs

PEI-SPIO-NPs foram preparados conforme descrito anteriormente [24]. Resumidamente, 0,1 g de EDC e 0,5 g de NHS foram adicionados a 15 mL de solução aquosa de SPIO-NPs modificados por carboxil (5 mg / mL, pH ajustado para 5) e a solução foi agitada por 4-6 h em temperatura ambiente para ativar o carboxila de nanopartículas de óxido de ferro. A seguir, o mesmo volume de solução aquosa de cloridrato de polietilenimina (20 mg / mL) foi adicionado para reagir durante várias horas. A solução PEI-SPIO-NPs conjugada resultante foi dialisada usando uma membrana de diálise (MWCO 20.000) submersa em água destilada por 2 dias para remover quaisquer moléculas PEI não conjugadas e intermediários. Uma alíquota da solução de nanopartículas foi liofilizada e armazenada.

Síntese e caracterização de PEI-SPIO-NPs / complexos de pDNA

A síntese de PEI-SPIO-NPs foi conforme descrito acima, PEI-SPIO-NPs e DNA de plasmídeo (pDNA) foram pré-aquecidos separadamente por 10 min a 37 ° C e, em seguida, misturados em diferentes razões N / P para preparar o Complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. A morfologia dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi medida por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, CM100, Philips, Holanda), e o diâmetro hidrodinâmico foi medido por espalhamento de luz dinâmico (DLS, Nicomp 380, PSS, FL, EUA) . Suas propriedades magnéticas de SPION e PEI-SPIO-NPs foram examinadas com um magnetômetro de amostra vibratória EV-11 (PPMS-9, Quantum Design, San Carlos, CA, EUA) a 300 K. As medições foram normalizadas para o peso do ferro em cada amostra, e as medidas foram verificadas por meio de espectrômetro de emissão óptica de plasma acoplado indutivamente (ICP-OES).

As cargas de superfície foram medidas determinando o potencial zeta usando o instrumento de espalhamento dinâmico de luz (Malvern, Southborough, MA, EUA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH =7,4). Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foram preparados em várias razões molares N / P variando de 2,5 a 25, adicionando a solução PEI-SPIO-NPs à solução de pDNA, e a concentração final de pDNA foi ajustada para 30 μg / mL.

Os componentes dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foram detectados usando um microscópio de força atômica (IPC-208B, Chongqing University, Chongqing, China). Um pequeno metal em flocos que foi usado como veículo para observação foi lavado com acetona e seco. Em seguida, algumas gotas da amostra da sonda antisense foram colocadas no metal e secas ao ar. A morfologia da superfície da amostra foi observada em uma área de varredura em grande escala de 700 nm × 700 nm e 1000 × 1000 pixels. A estrutura molecular e a microestrutura da amostra foram observadas em uma área de varredura em pequena escala de 9 nm × 9 nm e 800 × 800 pixels. Os dados da imagem original foram transmitidos para um computador e a reconstrução 3D foi realizada com o software G2DR [25]. As medições foram repetidas três vezes para cada grupo.

A mobilidade do pDNA após ligação com PEI-SPIO-NPs foi analisada por eletroforese em gel. As razões N / P de PEI-SPIO-NPs / pDNA foram 1/5, 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30, onde o conteúdo de DNA foi mantido em 3 μg. Após 15 minutos de incubação a 37 ° C, 10 μL de solução de mistura foram analisados ​​por eletroforese em gel de agarose a 1% (90 V, 30 min). O pDNA nu foi usado como um controle.

Os efeitos de PEI-SPIO-NPs na proteção de pDNA contra DNase I foram avaliados. Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em várias razões N / P e pDNA nu (3 μg) foram incubados a 37 ° C em 5% de CO ₂ ambiente sub-úmido por 30 min com DNase I (4 U) em DNase / Mg ²⁺ tampão de digestão consistindo em Tris-HCl 50 mM (pH =7,6) e MgCl 10 mM ₂ . A DNase I foi então inativada pela adição de solução de EDTA (pH =8,0) até a concentração final ser 2,5 mM. A amostra foi então incubada por 15 min a 65 ° C e 10 μL de 1 mg / mL de heparina de sódio foram adicionados para liberar o pDNA dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA [26]. A integridade do pDNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1% (90 V, 30 min).

Campo magnético

O novo gerador de campo magnético (Fig. 4) foi desenvolvido por nosso grupo em colaboração com a Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Chongqing [20, 21]. Usamos a imagem CAD 3D para mostrar o arranjo magnético do campo magnético uniforme. A distribuição do plano XOY e a distribuição 3D do campo magnético na região de interesse foram exibidas. A distribuição de PEI-SPION-NPs em diferentes campos magnéticos foi observada, e um campo magnético não uniforme (placa permanente Nd-Fe-B de 96 poços) foi usado como controle.

Cultura de células

A linha celular de osteossarcoma humano MG-63 (originalmente da American Type Culture Collection) foi obtida do Chongqing Engineering Research Center of Stem Cell Therapy (Chongqing, China). As células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina e incubadas a 37 ° C com 5% de CO ₂ e 95% de umidade relativa.

Citotoxicidade in vitro

Os efeitos citotóxicos in vitro de diferentes nanopartículas com ou sem pDNA e as nanopartículas magnetizadas ou não magnetizadas nas células de osteossarcoma MG-63 foram determinados usando o kit de teste CCK-8. As células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 4 × 10 ³ células por poço, e diferentes nanopartículas foram adicionadas e incubadas por 24, 48, 72 e 96 h. Solução de CCK-8 (volume de 10% do meio de cultura) foi adicionada a cada poço em pontos de tempo predefinidos e as células foram cultivadas por mais 2 h. A densidade óptica das células foi avaliada por meio de um leitor de microplacas de fluorescência no comprimento de onda de 450 nm, com o valor de absorbância refletindo a alta viabilidade celular; a observação de alta viabilidade indica que nanopartículas induzem baixos efeitos citotóxicos. PolyMag-200 / pDNA e PolyMag-200 foram usados ​​como controle positivo. Para estudar os efeitos de toxicidade de diferentes campos magnéticos nas células, selecionamos PEI-SPIO-NPs (sem pDNA) como vetores gênicos, e a densidade óptica das células interveio com diferentes campos magnéticos em diferentes pontos de tempo foi investigada.

Análise de microscopia confocal

A captação de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA ou nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs) foi observada por microscopia confocal de varredura a laser. Células de osteossarcoma MG-63 foram semeadas em placas de vidro de 24 mm a uma densidade de 3 × 10 ⁵ por bem. Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA (3 μg) marcados com isotiocianato de rodamina B (RBITC) foram adicionados às células e incubados por 30 min sob a ação de campo magnético uniforme ou campo magnético não uniforme; Complexos PEI-NPs / pDNA marcados com RBITC foram adicionados às células sem a intervenção de um campo magnético. As células foram então imediatamente lavadas duas vezes com PBS (0,01 M) para remover quaisquer complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA marcados com RBITC livres ou complexos PEI-NPs / pDNA marcados com RBITC, e as células tratadas foram incubadas por 6–24 h . O meio foi removido 6, 12 e 24 horas após a transfecção e os núcleos das células foram corados com Hoechst 33342 durante 5 minutos. Após a remoção do resíduo Hoechst 33342, as células foram incubadas em meio pré-aquecido contendo 0,5 mM de LysoTracker Green DND-26 por 1 h e depois lavadas duas vezes com PBS pré-aquecido. As células foram fotografadas em microscopia confocal de varredura a laser (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) com uma objetiva de 40 × para visualizar os fluorocromos com os seguintes comprimentos de onda de excitação (Ex) e emissão (Em) [GFP (Ex:488 nm; Em:530 nm), Hoechst (Ex:350 nm; Em:460 nm), LysoTracker Green (Ex:443 nm; Em:505 nm) e RBITC (Ex:554 nm; Em:576 nm)] [27 ]

Análise de citometria de fluxo

As células MG-63 foram semeadas em placas de 12 poços (1 × 10 ⁵ células por poço) por 24 h, após as quais foram lavadas com PBS duas vezes e pré-incubadas por 1 h com 0,8 mL de meio Opti-MEM a 37 ° C antes da transfecção. Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =10) ou complexos PEI-NPs / pDNA (N / P =10) contendo 3 μg de pDNA foram adicionados a cada poço, e as placas de cultura de células foram colocadas no uniforme ou campo magnético não uniforme por 20 min. PolyMag-200 / pDNA foi usado como controle positivo. Após 4 h, as células foram enxaguadas três vezes com 1 mL de PBS (0,01 M) para remover quaisquer complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA livres ou complexos PEI-NPs / pDNA, e as células foram cultivadas por mais 24 h. Após a incubação, as células foram coletadas e avaliadas quanto à eficiência de transfecção por citometria de fluxo (BD FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), esta parte do experimento foi repetida três vezes.

Análise estatística

Os dados quantitativos foram obtidos em triplicado ( n =5) e expresso como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA unilateral para comparações múltiplas e o t de Student teste para comparação intergrupo. A P valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

Princípio da magnetofecção

A magnetofecção é definida como vetores que estão associados a nanopartículas superparamagnéticas e que se acumulam nas células-alvo pela aplicação de campos de gradiente magnético [15]. A Figura 1 apresenta os componentes e morfologia dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA e o princípio primário da magnetofecção. O acúmulo lento do vetor e, conseqüentemente, a baixa concentração do vetor nos tecidos-alvo foram identificados como barreiras simples, mas fortes, para a entrega eficaz do gene [28]. O principal mecanismo de aumento da eficácia da magnetofecção parece ser a rápida sedimentação da dose total do vetor nas células-alvo, de modo que até 100% dessas células terão partículas de vetor ligadas às suas superfícies em poucos minutos. Assim, a magnetofecção é uma ferramenta adequada para superar a forte barreira do acúmulo lento do vetor e, conseqüentemente, da baixa concentração do vetor nos tecidos-alvo. PEI-SPIO-NPs / pDNA complexos aleatoriamente e é limitado e demorado em sua deposição nas células-alvo na ausência de um campo magnético. No entanto, o complexo PEI-SPIO-NPs / pDNA pode tocar ampla e uniformemente as células-alvo em um período de tempo relativamente curto na presença de um campo magnético, o que pode aumentar a chance de captação endocítica na área unitária das células, de modo a melhorar a taxa de utilização do complexo PEI-SPIO-NPs / pDNA e aumentar a eficiência de transfecção.

Visão geral da magnetofecção usando complexo PEI-SPIO-NPs / pDNA. Polietilenoimina revestida (LPEI) e nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (SPIO-NPs) estão associadas à reação de condensação por desidratação. Para este propósito, SPIO-NPs foram revestidos com LPEI, isto é, o LPEI é fortemente ligado à superfície de SPIO-NPs e eles formam PEI-SPIO-NPs juntos. Se PEI-SPIO-NPs são misturados com pDNA nu, o pDNA carregado negativamente liga-se a PEI-SPIO-NPs carregados positivamente por meio de adsorção eletrostática. As células são incubadas com os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA na presença de um campo magnético que atrai os complexos para as células. O resultado da magnetofecção é que essencialmente todas as células entram em contato com os vetores e uma alta porcentagem de células são rapidamente transfectadas

Caracterização dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA

A Figura 2a mostra que os PEI-SPIO-NPs são aproximadamente esféricos e os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA aparecem agregados, ambos com dispersibilidade favorável, e a atração entre cargas positivas e negativas torna complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA capazes de adquirir um tamanho pequeno. O ciclo de histerese de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA é mostrado na Fig. 2b. O percentual em peso de óxido de ferro em PEI-SPION-NPs medido por um espectrômetro de absorção atômica é 20,33 (± 2,87)%. A magnetização de saturação dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi de 21,5 (± 1,6) emu / g de ferro. Apesar das propriedades magnéticas reduzidas em comparação com as nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas não modificadas, os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA exibiram excelente capacidade de resposta magnética, que é necessária para magnetofecção de alta eficiência.

Características dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. a TEM de PEI-SPIO-NPs e complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. b Loops de histerese de complexos SPIO-NPs e PEI-SPIO-NPs / pDNA. c Potencial zeta e diâmetro hidrodinâmico de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em várias razões N / P. d Imagem em tons de cinza de AFM e a estrutura molecular dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. Os pontos vermelhos representam a localização do grupo químico SPIO, os pontos verdes indicam átomos de nitrogênio, os pontos amarelos significam átomos de carbono e o átomo de fósforo é representado por um círculo branco e preto. e (a) Distribuição de tamanho de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA e e (b) potencial zeta de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA conforme medido por um instrumento de espalhamento de luz dinâmico Malvern Zetasizer. Os resultados são expressos como a média ± DP ( n =5)

O diâmetro hidrodinâmico e o potencial zeta foram considerados os parâmetros indispensáveis ​​dos portadores de genes. A Figura 2c mostra que o diâmetro hidrodinâmico dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi de 200 (± 21,7) nm com uma razão N / P (NH ₂ —Grupo em PEI / PO ₄ —Grupo em pDNA) de 2,5 e 175 (± 16,4) nm quando a razão N / P era 5, indicando que a mudança rápida no tamanho ocorreu durante a transição do potencial de negativo para positivo. Depois disso, as forças repulsivas entre os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA aumentaram com razões N / P mais altas, indicando que o tamanho das nanopartículas havia aumentado.

Analisamos os tipos de ligações químicas de acordo com o arranjo dos átomos, e posteriormente especulamos sobre a estrutura molecular dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. A estrutura molecular dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi indiretamente divulgada por microscopia de força atômica (AFM, Fig. 2d), que mostrou que os grupos carboxila de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético combinados com a amina primária de PEI pela ligação amida. Além disso, o pDNA foi envolvido em uma cadeia molecular PEI via ligação eletrostática entre os grupos fosfato da cadeia de nucleotídeos e os grupos amina de PEI, formando complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA. Na imagem AFM em escala de cinza, o ponto vermelho representa a localização dos átomos de ferro, o ponto verde indica átomos de nitrogênio, os pontos amarelos significam átomos de carbono e o átomo de fósforo é representado por um círculo branco com um ponto preto.

Como mostrado na Fig. 2e, o potencial de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi detectado usando o instrumento de espalhamento de luz dinâmico. Em pH =7, o potencial das nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO-NPs) foi de - 6,6 (± 1,1) mV, o que indicou a presença de grupos carboxílicos em sua superfície. O potencial de PEI-SPIO-NPs foi de + 18,2 (± 1,5) mV. O potencial de PEI modificado com SPIO-NPs foi transformado em uma superfície carregada positivamente, que poderia ser usada como um carreador de gene que se combina com pDNA carregado negativamente. Nós avaliamos a mudança nas cargas superficiais de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em diferentes razões N / P. Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA mostraram uma carga superficial negativa mesmo em uma razão N / P baixa de 2,5, que gradualmente se traduziu em uma carga superficial positiva conforme a razão N / P aumentou para 5. Este aumento nas razões N / P em complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA resultou em um aumento na carga superficial positiva de poliplexos. A uma razão N / P de 10, o potencial dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =10) foi de + 11,9 (± 1,2) mV, e a carga superficial atingiu um platô. Os complexos carregados positivamente entraram em contato com a membrana celular carregada negativamente e permitiram a captação celular das nanopartículas complexadas [29]. PEI-SPIO-NPs não só podem ser usados ​​como portadores de genes de pDNA carregados negativamente, mas também contribuem com um certo nível de magnetismo para a entrega de drogas direcionadas e se tornam o agente de contraste usado para imagens de contraste por ressonância magnética (MRI) [30, 31] .

Um requisito fundamental dos transportadores de genes é que o transportador de transfecção deve formar de forma eficiente um complexo estável com os ácidos nucleicos. Para avaliar sua capacidade de ligação, volumes semelhantes de solução de PEI-SPIO-NPs e solução de pDNA foram misturados em diferentes razões N / P e agitados em vórtice. Uma alíquota de 10 μL da mistura foi então analisada por eletroforese em gel de agarose (Fig. 3a). Em contraste com o pDNA nu, a migração do plasmídeo foi completamente bloqueada a uma razão N / P de 5, indicando que os PEI-SPIO-NPs concentraram totalmente o pDNA [32].

O ensaio de ligação de pDNA e o ensaio de proteção de pDNA de PEI-SPIO-NPs. a Eletroforese em gel de agarose de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em várias razões N / P. b Análise de mobilidade eletroforética de PEI-SPIO-NPs / pDNA após tratamento com DNase-I. PEI-SPIO-NPs em várias razões N / P e pDNA (3 μg) foram incubados a 37 ° C em 5% de CO ₂ ambiente sub-úmido por 30 min com DNase-I (4 U) em DNase / Mg ²⁺ tampão de digestão consistindo em Tris-HCl 50 mM (pH =7,6) e MgCl 10 mM ₂ . A DNase I foi então inativada pela adição de solução de EDTA (pH =8) até a concentração final ser 2,5 mM. A amostra foi então incubada por 15 min a 65 ° C e 10 μL de heparina de sódio a 1 mg / mL foram adicionados para liberar pDNA de PEI-SPIO-NPs / pDNA. A integridade do pDNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1% (90 V, 30 min)

Outra característica dos PEI-SPIO-NPs como potenciais portadores de genes é que eles poderiam proteger o pDNA da degradação por nucleases, favorecendo assim a transfecção. A Figura 3b mostra que o pDNA nu é significativamente degradado pela DNase-I. Os complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA em uma razão molar N / P <5 foram totalmente digeridos, enquanto o pDNA liberado de complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =5:1) permaneceu intacto. Os resultados desses ensaios de proteção de DNase-I mostraram que os PEI-SPIO-NPs protegeram eficazmente o pDNA da digestão com DNase-I, implicando assim em suas aplicações potenciais para terapia gênica.

Como mostrado acima, quando N / P era <5, PEI-SPIO-NPs não podiam proteger pDNAs da degradação de nuclease. Os tamanhos dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA aumentaram quando N / P era> 10, o que era inadequado para o transporte do vetor [33, 34]. O tamanho dos complexos PEI-SPIO-NPs / pDNA foi o menor e exibiu estabilidade em N / P =5. Além disso, o potencial zeta dos PEI-SPIO-NPs não aumentou significativamente quando N / P> 10. Portanto, para garantir a estabilidade de PEI-SPIO-NPs / pDNA, uma razão N / P de 10 foi selecionada para os experimentos subsequentes.

Geração de um campo magnético

O novo gerador de campo magnético Halbach (Fig. 4a, b) foi desenvolvido por nosso grupo, em colaboração com a Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Chongqing [20, 21]. O novo gerador de campo magnético é composto por nove módulos de ímã permanente cubóide idênticos e duas folhas de calços passivos (Fig. 4c), que geram um campo magnético altamente uniforme no plano horizontal.

O gerador de campo magnético e sua uniformidade de campo magnético e PEI-SPIO-NPs distribuídos nos diferentes campos magnéticos. a Medição da uniformidade do campo magnético por Graussmeter. b Gerador de campo magnético uniforme. c Imagem 3D do arranjo do ímã do gerador de campo magnético uniforme (onde cada ímã tem um tamanho de 40 × 40 × 200 mm ³ ) d Gerador de campo magnético de 96 poços. e Uniformidade de campo magnético do gerador de campo magnético de 96 poços. f Uniformidade de campo magnético do gerador de campo magnético uniforme. g Distribuição de PEI-SPIO-NPs em campo magnético de 96 poços. h Distribuição de PEI-SPIO-NPs em campo magnético uniforme. eu A distribuição do plano XOY de campo magnético uniforme (50 mm × 50 mm) e j Distribuição 3D de campo magnético uniforme

A otimização da estrutura do ímã pode gerar um campo magnético que se distribui de maneira plana na direção horizontal da área de 50 mm × 50 mm no plano YOZ. O gradiente é distribuído na direção vertical com um gradiente de 2 mT / mm. O campo magnético é uniformemente distribuído em uma área XOY de 50 mm × 50 mm com uniformidade de 1,3 × 10 ⁻³ e um campo magnético de 0,0739 T, as forças magnéticas do plano coronal e planos sagitais onde a placa de cultura de células foi colocada são, respectivamente, 0,0632 T e 0,07 T. A diferença de uniformidade de cada poço na placa magnética de cultura de células de 96 poços foi de aproximadamente 80% (Fig. 4d, e). No entanto, a diferença de uniformidade de cada poço no novo campo magnético de Halbach é menor que 2 ‰, então a diferença de uniformidade entre os dois campos magnéticos é> 100 vezes (Fig. 4f). Neste caso, definimos uma placa magnética de cultura de células de 96 poços como um campo magnético não uniforme, e o novo campo magnético de Halbach é um campo magnético relativamente uniforme, que foi usado como uma ferramenta experimental para estudos subsequentes.

A distribuição de PEI-SPIO-NPs foi significativamente afetada pelo campo magnético. PEI-SPIO-NPs afundaram gradualmente devido à gravidade e foram distribuídos aleatoriamente na ausência do campo magnético. Após a aplicação de um campo magnético, os PEI-SPIO-NPs afundaram rapidamente no fundo das placas. Além disso, a distribuição também pode ser alterada significativamente em diferentes campos magnéticos. No campo magnético não uniforme convencional (placa magnética de cultura de células de 96 poços), PEI-SPIO-NPs foram reunidos em massas ou bandas e distribuídos junto com as linhas de força magnética (Fig. 4g). No entanto, os PEI-SPIO-NPs foram uniformemente distribuídos no campo magnético uniforme que foi induzido pelo novo gerador de campo magnético (Fig. 4h). Como pode ser visto a partir da distribuição do plano XOY e distribuição 3D do campo magnético (Fig. 4i, j), a área vermelha na figura é um campo magnético relativamente uniforme, com uniformidade de cerca de dois milésimos ( Z  = 10 mm), and it can be seen that the gradient of the magnetic field in the target region is about 1.3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P  < 0.05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P <0,05, ** P < 0.01). a The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. a At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P <0,05, ** P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.

Conclusões

The novel magnetic field generator has been developed to induced a uniform magnetic field, in which the PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes are rapidly and uniformly distributed on the surface of MG-63 osteoblasts, thereby averting local transfection and decreasing disruption of the membrane caused by centralization of positively charged PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, ultimately resulting in an increase in the effective coverage of the magnetic gene carriers during transfection, and improving magnetofection efficiency. This innovative uniform magnetic field could be used to determine the optimal amount of PEI-SPIO-NPs and pDNA, and screen for the optimal formulation design of a magnetic gene carrier under homogeneous conditions. Most importantly, the novel uniform magnetic field facilitates the transfection of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes into osteoblasts, which provides a novel approach for the targeted delivery of therapeutic genes to osteosarcoma tissues and serves as a reference for the treatment of other tumors. However, a series of comprehensive studies are warranted to establish the therapeutic potential of PEI-SPIO-NPs that are integrated into a novel uniform magnetic field in combating osteosarcoma.

Abreviações

AFM:

Força atômica microscópica

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS:

Dynamic light scattering

DMEM:

Meio Eagle modificado por Dulbecco

EDC:

1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide

FBS:

Soro fetal bovino

GFP:

Green fluorescent protein

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectrometer

MF:

Magnetic field

MG-63:

Human osteoblasts

MRI:

Imagem de ressonância magnética

MWCO:

Molecular weight cut off

NHS:

N -hydroxy succinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

pDNA:

Plasmid DNA

PEI:

Polyethylenimine

PEI-NPs:

Polyethylenimine nanoparticles

PEI-SPIO-NPs:

Polyethylenimine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles

RBITC:

Rhodamine B isothiocyanate

SPIO-NPs:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

VSM:

Vibrating sample magnetometer

Nanomembranas de TiO2 fabricadas por deposição de camada atômica para eletrodo supercapacitor com capacitância aprimorada Fabricação controlada por morfologia de nanoestruturas de prata dendríticas em grande escala para aplicações de catálise e SERS