Terapia Inovadora com Nanopartículas de Metotrexato-Folato Melhora Tratamento de Câncer de Mama com Abordagem Fototérmica Assistida por Laser

Resumo

Terapia a laser de baixo nível (LLLT) é conhecida como tipo seguro de fototerapia para tecido/células tumorais. Além disso, uso de nanopartículas direcionadas aumenta sucesso da terapia contra câncer. Este estudo foi desenhado para investigar efeito combinado de nanopartículas (NPs) de ouro revestido com sílica (Au@SiO₂) carregadas com folato (FA)/Metotrexato (MTX) e LLLT no combate ao câncer de mama.

NPs sintetizadas e caracterizadas usando FTIR, TEM e DLS-Zeta. NPs apresentaram morfologia esférica com diâmetro médio ~25 nm e carga positiva (+13,3 mV) enquanto após conjugação com FA e MTX sua carga líquida reduziu para ~ -19,7 mV.

Nossos achados em estudos de captação celular mostraram claramente captação celular aumentada de NPs após carregamento com FA e MTX em ambas linhagens de câncer de mama, especialmente em MDA-MB-231 devido à alta expressão de receptores de folato. Resultados indicaram que LLLT teve efeito proliferativo em ambas linhagens, mas na presença de nanopartículas direcionadas ao câncer de mama, eficácia da quimio-fototerapia combinada aumentou significativamente usando ensaio MTT (p<0,05), coloração DAPI e achados de ciclo celular. Maior efeito apoptótico em linhagens de câncer de mama observado em células expostas a combinação de NP Au@SiO₂ carregada com MTX-FA e LLLT, comprovado por coloração DAPI e ciclo celular (aumentando parada celular em subG0/G1). Em conjunto, combinação de quimioterapia e LLLT melhora potencial da terapia de câncer de mama com efeitos colaterais mínimos.

Introdução

Câncer de mama (CM), como câncer mais frequente em mulheres, recentemente reportado com 1,7 milhão de novos casos mundialmente [1]. Devido à sua etiologia complicada e pobre resposta ao tratamento, frequentemente conhecido como causa central de mortes associadas a câncer em mulheres universalmente [2-5]. Cerca de 40.000 mulheres nos EUA previstas para morrer de CM em 2014 [2, 6, 7] "(www.cancer.org)". Com 522.000 mortes no total, é quinta causa de morte por câncer com cerca de 800.000 casos em regiões menos desenvolvidas e frequência similar em regiões desenvolvidas [1]. Em países asiáticos, maior idade de início está entre adultos de 40 ou 50 anos comparado a países ocidentais frequente entre 60–70 anos [8]. Principais fatores de risco de CM são sexo feminino, histórico familiar, idade, e tendências reprodutivas variáveis, como primeiro parto após 30 anos, menarca precoce e menopausa tardia, e nuliparidade [9].

Objetivo principal no combate ao câncer é desenvolver planos terapêuticos eficazes com baixas toxicidades e altas especificidades para eliminar tumores, principalmente metástases, e prevenir recorrência. Mas abordagens de tratamento atuais, como cirurgia, quimioterapia e radioterapia mostraram vários efeitos colaterais [10-12] e todas falham em atingir esse objetivo [13, 14].

Nas últimas décadas, observaram-se grandes esforços no tratamento de câncer [15, 16]. Entre abordagens terapêuticas atuais, terapia térmica surgiu como método de tratamento prospectivo [17]. Recentemente, terapia fototérmica (PTT), como terapia potencialmente eficaz e não invasiva, atraiu atenção significativa [18, 19]. PTT baseada em nanoestruturas fotoabsorventes tornou-se via diferente aos métodos gerais [20, 21]. Em PTT típica, que usa agentes PTT para destruir tumor obtendo hipertermia suficiente (42°C) sob irradiação laser (luz near-infrared (NIR) na faixa 700–1100 nm), foi estudada como método de tratamento de câncer altamente preciso e minimamente invasivo [22-28].

Várias nanopartículas foram amplamente estudadas como agentes de contraste de imagem, carreadores de fármacos e transformadores de modalidades de energia como laser, ondas de rádio e ultrassom, em fenômenos térmicos responsáveis por efeitos terapêuticos [29-39].

Nanopartículas de ouro atraíram grande atenção na última década devido à sua alta ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) e fácil conjugação de superfície com biomoléculas [40]. Revelaram alta capacidade de conversão fototérmica na região NIR [41-43] sem efeitos colaterais prejudiciais em sistemas biológicos [44].

Embora nanopartículas de ouro reconhecidas como fotossintetizadores promissores, mas devido à sua pobre estabilidade fototérmica sob irradiação NIR repetitiva, gradualmente perdem capacidade de conversão fototérmica limitando uso na prática clínica. Além disso, nanopartículas de ouro não são bons carreadores de fármacos devido à pobre capacidade de carga e perfil de liberação controlada [45, 46]. Alternativamente, nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN) conhecida como carreador apropriado de fármaco, DNA e proteína devido à sua maior capacidade de carga e falta de conteúdos tóxicos de sua degradação. Também têm grande área superficial, tamanho controlável, volume de poro altamente disponível, e características de superfície desejadas para modificação [47].

Nanopartículas após conjugação a agente quimioterápico e ligante de direcionamento a câncer podem inibir desvantagens da quimioterapia de rotina, como entrega não específica, pobre solubilidade em água, e baixos índices terapêuticos [48, 49].

Agentes com propriedades quimioterápicas como doxorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, fluorouracil e docetaxel são usados isoladamente ou em combinação como tratamentos nucleares principais, ou auxiliados com outros tratamentos como PTT. Maioria dos pacientes de câncer experimenta efeitos adversos de fármacos quimioterápicos devido à sua distribuição não precisa no corpo que afeta todos órgãos. Esses fármacos ferem algumas células normais de crescimento rápido, como células sanguíneas, células de mucosa cobrindo órgãos internos, e folículos pilosos [50-53].

Metotrexato (MTX) tem sido fármaco mais usado para artrite reumatoide e vários tumores como pele, pulmão, cabeça e pescoço, e mama [54, 55]. Inibe redutase de diidrofolato (DHFR), enzima contribuindo para produção de tetrahidrofolato e subprodutos necessários para síntese de timidilato e purina, ambos vitais para crescimento e proliferação celular. Portanto, bloqueando DHFR, metotrexato previne síntese de 4 macromoléculas básicas DNA, RNA, timidilatos e proteínas [56].

Infelizmente, similar à maioria dos agentes PTT convencionais, principal desafio é atingir acúmulo seletivo de GNPs no tecido alvo após injeção sistêmica [57-59]. Terapia direcionada a câncer permite entrega de fármaco quimioterápico a células cancerígenas específicas enquanto diminui exposição de células normais saudáveis. Isso permite entregar maior dosagem de fármaco a células cancerígenas com menor toxicidade sistêmica. Nanopartículas direcionadas por ligante identificam precisamente marcadores de células cancerígenas, altamente expressos na superfície [40].

Ácido fólico (folato ou vitamina B9) é material chave para crescimento e metabolismo celular. Devido à grande afinidade do folato por proteínas receptoras de folato, é utilizado como elemento para direcionamento a câncer. Receptor de folato, como biomarcador de tumor, é superexpresso em células malignas definidas como mama, ovário, pulmão, rim, cérebro e cólon [60]. Sistemas de entrega de fármacos conjugados a folato aumentam captação celular de fármaco via endocitose [61].

Materiais e Método

Reagentes e Materiais

Usamos água duplamente destilada (Ghazi Company, Tabriz, Irã) e reagentes químicos grau analítico para nossos experimentos. Vários reagentes comprados da Sigma-Aldrich incluindo: Tetraetil ortossilicato (TEOS, 98%), (3-Mercaptopropil) trimetoxissilano (MPTES, 95% pureza), ácido fólico e rodamina B. Grupo de materiais comprado da Merck Co: Ácido Clorídrico (HCl, 37%), solução de Amônia (25%), tolueno, Hidróxido de Sódio (NaOH, 98%), e outros solventes. MTX comprado da Zahravi Farma Company, Tabriz, Irã.

Instrumentação

Neste estudo, para analisar tamanho e morfologia das partículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (LEO 906, Alemanha) empregada. Preparamos ~100 μL de nanopartículas suspensas em solução aquosa à temperatura ambiente. Solução transferida para filme de carbono em grade de cobre de TEM com secagem por congelamento subsequente e observado a 80 kV. Determinação de tamanho de partícula realizada por medida DLS (espalhamento dinâmico de luz) a 25 °C usando Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK. Medidas de potencial Zeta para NPs preparadas realizadas por espectroscopia de correlação de fótons (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK). Espectrofotômetro UV-Vis de duplo feixe (UV-1601 PC model SHIMADZU, Kyoto, Japão) empregado para medida de absorbância por cubeta de quartzo 700 μL com comprimento de caminho 10 mm. Espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR) de espectrômetro Bruker Tensor 27, Alemanha utilizada para método de pellet de KBr. Medidas de pH feitas com medidor Metrohm 713 (Herisau, Suíça). Agitador mecânico Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Alemanha) usado para agitações. Eficiência de encapsulamento de FA e MTX calculada usando sistema HPLC consistindo de módulo de separação Waters 2690 equipado com detector UV-vis Waters 2500 Pump 1000 detectors (Waters, Milford, MA). Separação cromatográfica implementada à temperatura ambiente usando coluna de cromatografia C18 m Bondapak (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irlanda).

Preparação de Nanopartículas Au@SiO₂

NPs de SiO₂ sintetizadas baseadas no método sol-gel relatado anteriormente [62, 63]. No próximo passo, nanopartículas de sílica revestidas funcionalizadas com tiol (TFSNPs) preparadas segundo método mencionado em estudo prévio [64]. Nanopartículas de Au produzidas por método de redução por citrato (método Turkevich) [65]. Finalmente, superfície de TFSNPs coberta por AuNPs. Primeiro TFSNPs dispersas em água com auxílio de banho ultrassônico por pelo menos uma hora e adicionadas à solução de AuNPs e sonicadas por 30 min adicionais. Reação feita em condição escura por dois dias em agitação dinâmica a 25 °C. Nanopartículas Au@SiO₂ com aparência roxa coletadas por centrifugação (10000 rpm, 10 min) e secas em estufa a vácuo.

Carregamento de MTX e FA

MTX e FA carregados no nanocarreador Au@SiO₂ como segue: MTX (10 mg) adicionado a 10 mL suspensão bem dispersa de nanocarreador em PBS (5 mg/mL, pH 7,4) e agitado moderadamente à temperatura ambiente por um dia em condições escuras. Nanocarreador Au@SiO₂ carregado com MTX coletado por centrifugação. Sobrenadante coletado para medida de MTX não carregado. Então nanocarreador Au@SiO₂ carregado com MTX disperso em PBS (5 mg/mL, pH 7,4) e FA (10 mg) adicionados à solução e agitado moderadamente à temperatura ambiente por outro dia em condições escuras. Nanocarreador Au@SiO₂ carregado com FA-MTX reunido por centrifugação e sobrenadante separado para cálculo de FA não ligado na etapa final. Nanocarreador Au@SiO₂ carregado com FA-MTX liofilizado e armazenado para próximos experimentos. Quantidades de MTX e FA não ligados calculadas usando método HPLC por protocolo relatado anteriormente [66]. Ácido fólico dissolvido em hidróxido de amônio (10% p/p) e diluído com fase móvel. Tempo de retenção para MTX e ácido fólico foram 10,5 e 5,95 min, respectivamente. Amostras em triplicata aplicadas. Eficiência de carga de fármaco (DLE) calculada pelas fórmulas:

$$ ee\left(\%\right)=\frac{\left( initial\ total\ drugs- Unabsorbed\ drugs\right)}{Initial\ total\ drugs}\times 100 $$ (1)

Seleção e Cultura de Linhagens Celulares

Duas linhagens de câncer de mama de interesse com níveis relatados de expressão de superfície de receptor de folato (FR) [67] incluindo MCF-7 e MDA-MB-231 selecionadas e compradas do Banco de Células Pasteur (Teerã, Irã) para investigações de citotoxicidade. Linhagens selecionadas cultivadas em meio completo contendo RPMI1640 (Thermoscientific), 10% Soro Fetal Bovino (FBS), e 1% Penstrep (Thermoscientific) em condições térmicas e atmosféricas de 37°C, 5% CO₂, e 95% umidade.

Ensaio de Citotoxicidade Celular

Ensaio de viabilidade realizado para medir proliferação celular após diferentes tratamentos com NPs sem irradiação laser. Brevemente: células MCF-7 ou MDA-MB-231 semeadas em microplacas de 96 poços com densidade de 1,5×10⁴ por 24 h, então tratadas com MTX, Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas com FA-MTX. Células sem tratamento consideradas controle. No próximo passo, corante tetrazólio MTT (Sigma) a concentrações finais de 5 μg/mL adicionado às células e incubado a 37°C por 4 h. Então, solução MTT removida e cristais de Formazan sedimentados dissolvidos em Dimetil Sulfoxido (DMSO) (BioIdea, Irã) sob agitação suave por 10 min. Finalmente, absorbância medida a 570 nm por leitor ELISA. Viabilidade normalizada a células controle e fundo removido por subtração de medidas em branco.

Terapia a Laser In Vitro

Para Terapia a Laser de Baixo Nível (LLLT), laser NIR de 810 nm (Laser diodo Mustang 2000, Rússia) com potência de saída 185 mW usado para destruição de células cancerígenas. Primeiro células MCF-7 e MDA-MB 231 com densidade 1,5×10⁴ tratadas com Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas com FA-MTX então expostas a irradiação laser com diferentes doses (30, 60, 75, 90 e 105 J/cm²) e tempo de exposição fixo (139 seg). Células expostas apenas a irradiação laser (sem NPs) e células sem NPs e tratamentos laser consideradas controle positivo e negativo, respectivamente. Após 24 h de irradiação laser, viabilidade medida por método de ensaio MTT [64].

Ensaio de Captação Celular de Nanopartículas

Verificação detalhada da internalização celular de NPs essencial para confirmar efeito específico de nanocarreador modificado na superfície para cada linhagem. No presente trabalho, empregamos tanto citometria de fluxo como quantitativa e microscopia de fluorescência para verificação qualitativa da captação de NPs por linhagens MCF-7 e MDA-MB-231.

Para suspensão de NPs, solução de rodamina B (RhoD) em PBS adicionada junto com agitação por 24 h à temperatura ambiente e quarto escuro (prevenindo fotobranqueamento). Então, NPs carregadas com RhoD separadas por Filtro Amicon com limite de peso molecular nominal (NMWL) de 30 kDa e centrifugadas por 15 min a 5000 rpm e lavadas com buffer PBS para eliminar RhoD não ligado. Células semeadas em placas com densidade de 5×10⁵ por poço e deixadas atingir confluência. Células tratadas com NPs marcadas com Rodamina B por 30, 90 e 180 minutos, células não tratadas usadas como controle. Depois, tripsinizadas e lavadas com PBS, e fluorescência quantificada com análise citométrica de fluxo (BD Biosciences FCASCalibur flow cytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Captação intracelular de nanocarreador marcado com rodamina B ou NPD confirmada por microscopia de fluorescência. Células MCF-7 e MDA-MB-231 cultivadas em lamínulas e após 24 h tratadas com NPs Au@SiO₂ livres e NPs Au@SiO₂ carregadas com MTX-FA. Após incubação por 30, 90 e 180 minutos, células lavadas com PBS e captações de nanocarreador marcadas com rodamina B observadas usando microscópio de fluorescência (Olympus microscope Bh2- FCA, Japão).

Estudo de Apoptose por Microscopia de Fluorescência

Um método para estudo qualitativo nuclear de apoptose é corante fluorescente DAPI que liga a DNA e detectável por microscópio apropriado. Usamos protocolo relatado anteriormente para coloração DAPI [68], brevemente: células MCF-7 ou MDA-MB-231 semeadas em recipientes de 6 poços a densidade de 5 ×10⁵ e deixadas aderir e crescer por 24 horas. Após tratamento com MTX, NPs Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas com MTX-FA com e sem tratamento laser, células lavadas com PBS (Sigma) e submetidas a fixação por 10% formaldeído (Merck), depois: células permeabilizadas com Triton X-100 (Sigma) por 15 minutos. Após lavagens adequadas, células coradas com DAPI (sigma) por 5 min. Finalmente, núcleos apoptóticos (fragmentados ou enrugados) visualizados por microscópio de fluorescência (Olympus). Células sem tratamento consideradas controle negativo e células que receberam apenas irradiação laser como controle positivo.

Investigação de Perturbações do Ciclo Celular

Distribuições de ciclo celular de MCF-7 e MDA-MB-231 determinadas por análise citométrica de fluxo. Neste sentido, células semeadas com populações iniciais de 5 × 10⁵ e permitidas atingir 80% confluência. Subsequentemente, células tratadas com MTX, NPs Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas com MTX e FA com e sem irradiação LLLT realizada. Células sem tratamento consideradas controle negativo e células que receberam apenas irradiação laser como controle positivo. Então, células colhidas por tripsinização seguida de lavagens adequadas com PBS. Em seguida, células fixadas por Etanol (Merck) por 48 horas. No próximo passo, células fixadas lavadas, então tratadas com Ribonuclease A (Cinaclone), com adição subsequente of iodeto de propídio (PI) (Sigma) no escuro. Sinais de fluorescência detectados por conjunto FACS da Beckton Dicinson Company.

Estatísticas do Estudo

Experimentos para cada etapa realizados em três repetições e resultados reportados como média ±DP. ANOVA usado para comparação de significância entre grupos. Diferenças refletiram significâncias onde valor de probabilidade calculado <0,05 por software SPSS.

Resultados e Discussão

Caracterização de NPs Sintetizadas

NPs Au@SiO₂ produzidas em quatro etapas: 1-síntese de nanopartículas de SiO₂, 2-adição de ligante contendo tiol a NPs de SiO2, 3-síntese de nanopartículas de ouro, e 4-fixação das nanopartículas de ouro na superfície dos complexos SiO2-ligante (Fig. 1). Síntese bem-sucedida de Au@SiO₂ confirmada por FTIR (Fig. 2a). Pico Si–O–Si apareceu em torno de 1088 cm^-1. Pico largo em 3000–3700 e 803 cm^–1 creditado a estiramento e dobra fora do plano de grupos silanol livres O–H, respectivamente. Vibração de estiramento C–H alifático mostrado como pico forte a 2950 cm^–1. C–O de três grupos metoxissilano mostrado por pico a 1191 cm^–1.

Esquema sintético passo a passo para preparação de NPs Au@SiO₂ biocompatíveis carregadas com folato e metotrexato

a) Espectros FTIR de nanopartículas Au@SiO₂, b) distribuição de tamanho de NPs Au@SiO₂ conjugadas FA-MTX medida por espalhamento dinâmico de luz (DLS) c) Potencial zeta de Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ conjugadas FA-MTX medido por DLS a pH=7,4 e T=25 °C, d) Cromatograma de MTX e FA não carregados separados de NP Au@SiO₂ conjugado FA-MTX medidos simultaneamente por HPLC

Medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicaram que NPs Au@SiO₂ conjugadas FA-MTX tamanho na faixa nanométrica (105±2,3 nm) com distribuição de tamanho estreita (Fig. 2b).

Potencial zeta é parâmetro físico-químico importante que influencia estabilidade de nanossuspensões. Valores de potencial zeta extremamente positivos ou negativos causam maiores forças repulsivas. Por outro lado, alta carga das partículas, seja positiva ou negativa, causa absorção das NPs por fagócitos do fígado e disposição do corpo. No caso de estabilização eletrostérica e estérica combinada, potencial zeta mínimo de ± 20 mV é desejável [69-71]. Dados de potencial zeta de NPs comparados antes e após carregamento com MTX-FA a pH=7,4 e T=25 °C (Fig. 2c). Potenciais zeta obtidos de NPs Au@SiO₂ foram +13,3 mV que após carga dual de fármacos diminuiu para -19,7 mV que estavam na faixa desejável. MTX e FA tiveram carga líquida negativa a pH (7,4) acima de seus pka (3,8 e 4,8, 3,5 e 4,3), devido à desprotonação de dois grupos ácido carboxílico em sua estrutura ([72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Portanto, após carregamento simultâneo de MTX e FA em NPs Au@SiO₂, carga líquida tornou-se negativa.

Análise TEM fornece tamanho de partícula individual definitivo. Nanopartícula de Au vista como esferas escuras dispersas sobre NPs de SiO2 como camada de base cinza. Imagens TEM confirmaram que NPs Au@SiO2 sintetizadas com forma esférica homogênea em que tamanho médio das partículas foi ~25 nm (Fig. 3).

Imagem TEM de nanopartículas Au@SiO₂

Carregamento de Fármaco

Aqui, folato medeia captação aumentada de GNPs em certos tipos de células cancerígenas que superexpressam receptor de folato via endocitose mediada por receptor para superar baixa eficácia de internalização de GNPs, portanto receptor de folato conhecido como marcador tumoral e folato usado cada vez mais para direcionamento tumoral [67, 73].

Após conjugação de moléculas MTX e FA em NPs Au@SiO₂, potencial zeta mudou de +13,3 para -19,7 mV. Valores estimados de pKa dos dois grupos ácido carboxílico de MTX são 3,8, 4,8 e FA 3,5 e 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Portanto, devido à desprotonação de dois grupos ácido carboxílico de MTX e FA a pH 7,4 acima de seus pka, carga líquida tornou-se negativa indicando conjugação bem-sucedida de MTX e FA em NPs Au@SiO₂. De Ying Tian et al mostram que carregamento de MTX em nanopartículas de Au por 18 e 30 mm diâmetro são 15 ± 0,4% e 10 ±1,0% respectivamente [74]. Neste estudo FA e MTX carregados em NPs Au@SiO2 com eficiência de encapsulamento de 22,6 e 77,5%, respectivamente. Cromatograma de pico de avaliação simultânea MTX e FA mostrado na Fig. 2d.

Captação Celular

Como agentes fototérmicos intracelulares podem melhorar eficiência de terapia fototérmica de câncer [75], acredita-se que internalização celular de materiais fototérmicos é necessária. Teste de captação celular in vitro realizado usando células humanas de câncer de mama MDA-MB-231, conhecidas por superexpressar altamente receptor de folato [40]. Para estudar papel de FA como agente direcionador e eficiência do revestimento de superfície na captação de NPs Au@SiO₂ por células alvo, células MCF-7 e MDA-MB-231 tratadas com NPs Au@SiO2 e NPs Au@SiO2 carregadas MTX-FA. Resultados de intensidade fluorescente média de captação celular mostrados na Fig. 4. Resultados mostraram que captação de NPs Au@SiO2 em ambas MCF-7 e MDA-MB-231 aumentou sobre tempo de cultura para todas amostras (Figs. 4 e 5). Também, após decoração de superfície de NPs Au@SiO2 com MTX e FA, captação celular aumentou significativamente em ambas MCF-7 e MDA-MB-231 como células expressando receptor de folato. Captação de NPs Au@SiO2 carregadas MTX-FA em células MDA-MB-231 maior que MCF-7. Porque células MDA-MB-231 expressam níveis mais altos de receptores de folato de superfície, então alta porção de NPs direcionadas a receptor de folato entraram via mecanismo de endocitose mediada por receptor resultando em maior captação celular. Em outro estudo, captação celular aumentada de NPs conjugadas a folato ocorre apenas em células cancerígenas que superexpressam aHFR e não em células saudáveis que têm menor expressão de aHFRs de superfície [40]. Conjugação de NPs Au@SiO2 com FA pode facilitar captação de NPs e metotrexato, levando a toxicidade aumentada para células MDA-MB-231 [76].

Ensaio quantitativo de captação celular de NPs Au@SiO₂ marcadas com rodamina B (NP) ou NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA marcadas com rodamina B (NPD) em MCF-7 (a) e MDA-MB-231(b) para durações de exposição de 0,5 h, 1,5 h e 3h obtidas por citometria de fluxo. Células não tratadas de ambas linhagens empregadas como controle negativo. c Comparação de intensidade fluorescente média de NPs Au@SiO₂ marcadas com rodamina B (NP) ou NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA marcadas com rodamina B (NPD) para durações de exposição de 0,5 h, 1,5 h e 3h obtidas por citometria de fluxo

A Ensaio qualitativo de captação celular usando NPs Au@SiO₂ marcadas com Rodamina B (NP) em MCF7 com durações de exposição de 30 (a), 90 (b) e 180 (c) min ou NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA marcadas com Rodamina B (NPD) com durações de exposição de 30 (d), 90 (e) e 180 (f) min e (B) Ensaio qualitativo de captação celular usando NPs Au@SiO₂ marcadas com Rodamina B (NP) em MDA-MB-231 com durações de exposição de 30 (a), 90 (b) e 180 (c) min ou NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA marcadas com Rodamina B (NPD) com durações de exposição de 30 (d), 90 (e) e 180 (f) min capturadas por microscopia de fluorescência

Ensaio de Citotoxicidade

Estudos de citotoxicidade celular in vitro de MTX livre, NPs Au@SiO₂ em branco e NPs Au@SiO₂ conjugadas MTX-FA, avaliados por ensaio MTT por 24, 48 e 72 h (Fig. 6). Resultados de ensaio MTT mostraram que NPs Au@SiO₂ não tiveram efeito citotóxico em linhagens MCF-7 e MDA-MB-231. Além disso, para comparar efeitos citotóxicos de MTX livre e NPs Au@SiO₂ conjugadas MTX-FA, mesma concentração de MTX (25, 50, 100 e 200 μg/mL) usada para todos tempos de tratamento. Resultados de citotoxicidade indicam que MTX livre ou NPs Au@SiO₂ conjugadas MTX-FA mostraram taxa de mortalidade ~10-25% em ambas linhagens após 24h de tratamento. Estudos prévios reportaram efeito proliferativo de nanopartículas de ouro em diferentes linhagens como osteoblastos murinos MC3T3-E1 e células-tronco de ligamento periodontal humano sob condições in vitro. Nossos resultados alinham com esses estudos e Figura 6a e b mostram efeito proliferativo de NPs Au@SiO2 livres. Portanto, efeito citotóxico igual de MTX e NPs Au@SiO2 carregadas FA-MTX (NPD) pode ser devido a este fenômeno [77, 78].

a MCF-7 e (b) MDA-MB-231 taxas de inibição de crescimento após tratamento com diferentes concentrações de NP, MTX e NPs Au@SiO₂ carregadas FA-MTX (NPD) após tempo de exposição de 24, 48 e 72h

Irradiação Laser

Neste estudo, viabilidade de células MCF-7 e MDA-MB 231 tratadas com NPs Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA após irradiação laser com dose na faixa 30-105 J/cm² investigada por ensaio MTT. Taxa de mortalidade de células MCF-7 e MDA-MB-231 tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (concentração MTX 100 μg/mL) após LLLT a dose de 75 J/cm² foram ~39 e 45,5%, respectivamente. Enquanto na mesma condição, células tratadas com NPs Au@SiO₂ após irradiação laser ou laser isolado não mostraram morte celular óbvia. Também aumentando dose laser para 105 J/cm², taxa de mortalidade de ambas linhagens aumentou para 60-75%, enquanto ambas linhagens tratadas com NPs Au@SiO₂ +laser ou laser isolado na mesma dose de irradiação não mostraram efeito citotóxico. Valor IC50 para MCF-7 e MDA-MB-231 após terapia combinada com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (dose MTX 100 μg/mL) e LLLT obtidos a dose de 90 e 75 J/cm², respectivamente. Por outro lado, taxa de mortalidade de MTX e NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA sem irradiação laser a dose MTX 100 μg/mL (dose selecionada para estudo de terapia laser) foi entre 15-25% em ambas linhagens. Esses resultados indicaram que combinação de NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA e terapia laser mostrou efeito sinérgico em ambas linhagens e diminuiu significativamente viabilidade celular (p<0,001) comparado a células que receberam apenas irradiação laser. Esses resultados indicaram que tratamento com NPs, especialmente com estratégia de direcionamento, pode melhorar eficácia de terapia laser na destruição de células de câncer de mama (Fig. 7).

Comparação de taxas de inibição de crescimento expostas a diferentes potências de laser (30, 60, 75, 90 e 105 J/cm²) para grupos de tratamento laser isolado, laser + NPs Au@SiO2 e laser + NPs Au@SiO2 carregadas MTX-FA direcionados para duas linhagens MCF-7 (a) e MDA-MB-231(b) com verificação subsequente após 24h

Estudo de Apoptose por DAPI

Apoptose estudada em células MCF-7 e MDA-MB-231 após tratamento com NPs Au@ SiO₂; NPs Au@ SiO₂ carregadas MTX-FA com ou sem laser para saber se tratamento laser poderia aumentar eficácia da quimioterapia. Nossos resultados resumidos na Fig. 8 indicaram que células MCF-7 e MDA-MB-231 normais sem tratamento como controle bem como células tratadas apenas com laser ou NPs Au@SiO₂ livres sem irradiação laser tiveram núcleos típicos, sem apoptose. No entanto, células MCF-7 e MDA-MB-231 tratadas com MTX livre, NPs Au@ SiO₂ com irradiação laser e NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA sem irradiação laser mostraram núcleos parcialmente apoptóticos (Fig. 8). Células tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA em combinação com irradiação laser (810 nm, 75 J/cm², 139 seg) mostraram grande queda na população de células MCF-7 e MDA-MB-231. Portanto, eficácia de irradiação laser foi aumentada após captação de NPs Au@SiO₂ carregadas MTX/FA em células MCF-7 e MDA-MB-231. Portanto, NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA recém-desenvolvidas têm capacidade de aumentar efeitos fototérmicos por núcleos celulares altamente fragmentados, aumento radical na perda celular e dano completo das células.

Ensaio de apoptose usando coloração DAPI para células MCF-7 ou MDA-MB-231, imagens capturadas usando microscópio invertido. Células não tratadas como controle negativo (a), células tratadas com laser (75 J/cm²) como controle positivo (b) células tratadas com NPs Au@SiO₂ (NP (c), células tratadas com laser (75 J/cm²) e NPs Au@SiO₂ (NP) (d), células tratadas com MTX sem irradiação laser (e), células tratadas com MTX e irradiação laser (f), células tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (NPD) sem exposição laser (g), e células tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (NPD) com exposição laser (h)

Ciclo Celular

Distribuições de ciclo celular após tratamento com MTX, NPs Au@SiO₂ e NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA seja em combinação com LLLT (75 J/cm²) ou sem irradiação laser estudadas em ambas MCF-7 e MDA-MB-231 usando citometria de fluxo e coloração PI de DNA. Nosso estudo indicou que em células MDA-MB-231 ou MCF-7, porcentagem de células não tratadas (grupo controle) estavam ativamente em fase S (Fig. 9a, b). Usando tratamento laser 75 J/cm² reduziu porcentagem de células em fase S de forma não significativa. Por outro lado, células irradiadas com LLLT sem tratamento com NP e fármaco mostraram aumento significativo em população Go/G1 indicando segurança de LLLT isolado. Também tratamento com NPs não perturbou ciclo celular em ambas linhagens. Tratamento de células com MTX livre na ausência ou presença de irradiação laser mostrou algumas perturbações em ciclos celulares, incluindo redução de células em fase S. Uso de NPD isolado reduziu células em fase S. E interessantemente uso de NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA (NPD) aumentou porcentagem de células em sub Go/G1 como sinal de apoptose [72]. Também porcentagem de células MDA-MB-231 presentes em sub Go/G1 (~18%) foram significativamente maiores que células MCF-7 (12%) no grupo de tratamento NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA (NPD) devido à maior captação de NPs em células MDA-MB-231.

Distribuições de ciclo celular investigadas para MCF-7 (A) ou MDA-MB-231 (B) células. Células não tratadas como controle negativo (a), células tratadas com laser (75 J/cm²) como controle positivo (b) células tratadas com NPs Au@SiO₂ (NP) (c), células tratadas com laser (75 J/cm²) e NPs Au@SiO₂ (NP) (d), células tratadas com MTX sem irradiação laser (e), células tratadas com MTX e irradiação laser (f), células tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (NPD) sem exposição laser (g), e células tratadas com NPs Au@SiO₂ carregadas MTX-FA (NPD) com exposição laser (h), C) Resultados quantitativos de parada de ciclo celular e sua distribuição

Ramos et al, mostraram que em células tumorais, LLLT aumenta porcentagem de células em fases S e G2/M, também detectaram redução em proliferação e aumento em senescência [79]. Estudo de ciclo celular após LLLT (15 J/cm2) mostrou parada em G1, alinhado com parada de crescimento em células TK6 irradiadas [80]. Outro grupo reportou que PTT perturba principalmente células em fase S e aumenta população e parada em fase G2/M [81]. Como resultado, PTT pode induzir radio-sensibilização de células via perturbação de ciclo celular [82]. Seus resultados estão de acordo com nosso estudo, que mostrou perturbação de ciclo celular e redução de células em fase S. Nosso estudo também mostrou aumento em população de células apoptóticas (sub Go/G1) após terapia quimio-fototérmica combinada. Portanto, aplicação de combinação de LLLT e NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA (NPD) como nanopartículas direcionadas a câncer de mama pode aumentar eficácia da terapia de câncer de mama.

Conclusões

Neste estudo, NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA desenhadas para terapia direcionada de câncer de mama em combinação com LLLT como terapia a laser não invasiva, aprovada pelo FDA. NPs Au@SiO₂ carregadas MTX e FA com morfologia esférica e diâmetro médio 25 nm e carga superficial -19,7 obtidas. Este tamanho e carga superficial em faixa adequada para aumentar biodistribuição de NPs. Estratégia de direcionamento bem-sucedida destas NPs recém-desenvolvidas aprovada com maior porcentagem de captação celular de MDA-MB-231 comparado a MCF-7 como duas linhagens de câncer de mama com diferente expressão de receptor de folato. Resultados de ensaio MTT, coloração DAPI e estudo de ciclo celular indicaram que combinação de quimio-fototerapia mostrou efeito sinérgico e efeito citotóxico e apoptótico em ambas linhagens de câncer de mama, especialmente em células MDA-MB-231, aumentou significativamente (p<0,001). Como NPs Au@SiO₂ ou LLLT não mostraram efeitos citotóxicos, pode-se concluir que nosso desenho terapêutico tem efeitos sinérgicos no sítio alvo. Achados deste estudo podem ser úteis para desenhar futuros programas de terapia de câncer usando bio-quimioterapia combinada com lasers de baixo nível.