Stent gastrointestinal com eluição de piperlongumina usando tapetes de nanofibra sensível a espécies de oxigênio reativo para inibição de células de colangiocarcinoma

Resumo

Histórico

O objetivo deste estudo é fabricar stent gastrointestinal (GI) farmacológico usando esteiras de nanofibra sensíveis a espécies reativas de oxigênio (ROS) para o tratamento de células de colangiocarcinoma (CCA). Um agente produtor de ROS, esteiras de nanofibras incorporadas à piperlongumina (PL) foram investigadas para a aplicação de stents farmacológicos (DES).

Métodos

O metoxi poli (etilenoglicol) (MePEG) conjugado com selenocistamina foi conjugado com poli (L-lactídeo) (PLA) para produzir copolímero em bloco (copolímero em bloco LEse). Várias proporções de poli (ε-caprolactona) (PCL) e copolímero de bloco LEse foram dissolvidas em solvente orgânico com PL e, em seguida, esteiras de nanofibra foram fabricadas por técnicas de eletrofiação.

Resultados

A maior quantidade de LEse na mistura de PCL / LEse resultou na formação de grânulos, enquanto o PCL sozinho apresentou estrutura de nanofibras finas. As mantas de nanofibra compostas de mistura de polímero PCL / LEse mostraram liberação de droga sensível a ROS, ou seja, a taxa de liberação de PL das mantas de nanofibra foi acelerada na presença de peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ), enquanto os tapetes de nanofibras de PCL por si só têm pequenas alterações na taxa de liberação de drogas, indicando que as membranas de nanofibras incorporadas a PL têm capacidade de resposta a ROS. O próprio PL e o PL liberado de tapetes de nanofibra mostraram atividade anticâncer quase semelhante contra várias células CCA. Além disso, a PL liberada de tapetes de nanofibra produziu adequadamente a geração de ROS e induziu a apoptose de células CCA, bem como a própria PL. Em camundongos com células HuCC-T1, esteiras de nanofibras incorporadas a PL mostraram melhora na atividade anticâncer.

Conclusão

Tapetes de nanofibras sensíveis a ROS incorporados a PL foram revestidos no stent GI e mostraram atividade anticâncer melhorada com responsividade a ROS. Nós sugerimos esteiras de nanofibras sensíveis a ROS incorporadas a PL como um candidato promissor para o tratamento local de células CCA.

Histórico

O colangiocarcinoma (CCA), que normalmente é derivado da região do ducto biliar, é considerado um dos cânceres mais agressivos [1,2,3]. O motivo da carcinogênese e o aumento da taxa de incidência ainda não estão claros, embora sua taxa de incidência esteja aumentando em todo o mundo [1]. Uma vez que a maioria dos pacientes com CCA são freqüentemente diagnosticados em estado avançado, muito poucos casos de pacientes com CCA são passíveis de ressecção cirúrgica [2]. Várias opções de tratamento, como radioterapia, quimioterapia, deslocamento de stent metálico e terapia imunoadjuvante, foram tentadas para tratar pacientes com CCA [3,4,5,6,7,8,9]. Uma vez que o ducto biliar é bloqueado pelo crescimento do tumor ou inflamação, o deslocamento do stent é freqüentemente empregado para prevenir a oclusão do ducto biliar e para prolongar a sobrevivência do paciente entre os tratamentos mencionados anteriormente [10, 11]. No entanto, o stent de metal não tem função curativa e o crescimento excessivo do tumor dentro do stent normalmente induz obstrução biliar. Para resolver esses problemas, muitos cientistas têm investigado stent farmacológico (DES) [12,13,14,15]. Por exemplo, o grupo de Lee investigou o stent gastrointestinal (GI) eluidor de paclitaxel na última década [12,13,14,15]. Embora o stent eluidor de paclitaxel tenha poucas diferenças na permeabilidade do stent e na sobrevivência do paciente em comparação com um stent de metal recoberto, eles observaram a aceitabilidade do stent eluidor de paclitaxel em estudos de viabilidade e segurança porcino [13,14,15]. Kim et al. investigaram DES usando sorafenibe, um inibidor da proteína tirosina quinase, contra células HuCC-T1 CCA usando modelos de xenoenxerto de tumor animal, e o stent eluidor de sorafenibe tem eficácia para inibir o crescimento tumoral em modelo de xenoenxerto de tumor animal [16]. Kwak et al. relataram que o stent eluidor de inibidor de histona desacetilase (HDAC) (vorinostat) inibe efetivamente a expressão de HDAC, induz histona acetilada (histona Ac) e, em seguida, inibe o crescimento do tumor em modelo de camundongo portador de células CCA [17]. DES com novo agente anticâncer ou agente alvo molecular ainda é uma opção atraente para prolongar a sobrevivência do paciente. Além disso, esteiras de nanofibra sensíveis a estímulos ou nanomateriais também foram especificamente investigados para entregar o agente anticâncer [18,19,20]. Nanofibras com base em polímeros termossensíveis, como poli (di (etilenoglicol) metacrilato de éter metílico) (PDEGMA) ou poli ( N Os copolímeros de -isopropilacrilamida) poli (NIPAM) podem ser aplicáveis ​​na liberação de drogas sensíveis à temperatura no local da doença [18, 19]. Bellat et al. relataram que nanofibras de peptídeo de automontagem foram mostradas em excelente direcionamento de tumor com captura reduzida de RES [20].

O desequilíbrio entre a produção de ROS e o sistema de defesa antioxidante celular em doenças tem sido extensivamente investigado no campo biomédico [21,22,23,24]. Especialmente, o estresse oxidativo em cânceres também foi extensivamente investigado e aplicado em sistemas de entrega de drogas sensíveis a redox [23,24,25]. Por exemplo, grupos tioéter na estrutura do polímero das nanopartículas podem ser alterados de hidrofóbico para hidrofílico, quando foi exposto a ROS, e nanopartículas comutáveis ​​de ROS podem ser aplicáveis ​​em doenças com ambiente rico em ROS [25, 26]. Yu et al. relataram que a entrega endossômica específica em células cancerosas pode ser alcançada por micelas de polímero responsivas a ROS, ou seja, o copolímero pode ser convertido de hidrofóbico em hidrofílico em ambiente rico em ROS, e este fenômeno induziu liberação rápida de medicamento anticâncer após maior atividade anticâncer [27] . Também relatamos anteriormente que os nanofotossensibilizadores redox-responsivos liberam especificamente o fotossensibilizador com responsividade à glutationa (GSH) e, então, induzem uma geração de ROS mais alta em comparação com o próprio fotossensibilizador [28]. Em estudos recentes, micelas de polímero com ligação de disseleneto são conhecidas por terem liberação de droga desencadeada por ROS através da desintegração das ligações de diselênio e por mostrar atividade anticâncer específica de ROS [29]. Nanopartículas desencadeadas por ROS são consideradas uma plataforma promissora para a quimioterapia anticâncer.

Piperlongumina (PL), um produto químico natural originado de Piper longum , tem atividades anticâncer promissoras com baixa citotoxicidade contra células normais [30]. Raj et al. relataram que a toxicidade seletiva de células cancerosas de PL é devido ao fato de que PL produz seletivamente ROS em células cancerosas em relação à célula normal; PL induz dano ao DNA e alterações na morfologia / função mitocondrial em células cancerosas [30]. A atividade anticâncer da PL contra várias células cancerosas foi investigada [31,32,33,34,35]. Xiong et al. relataram que a PL aumentou acentuadamente as ROS e então inibiu efetivamente as células de leucemia mieloide primária por meio da indução de proteínas apoptóticas [35]. Embora a PL tenha baixa toxicidade contra células e órgãos normais, ela tem alguns efeitos adversos nos rins [36, 37]. Além disso, a meia-vida curta da PL na corrente sanguínea também deve ser melhorada [38].

Neste estudo, nós fabricamos um stent revestido de nanofibra responsivo a redox e o PL foi carregado nas esteiras de nanofibra. Para responsividade redox, o copolímero de bloco LEse com ligação de disseleneto foi sintetizado e usado para fabricar tapetes de nanofibra para DES. O conteúdo aumentado de ROS na região do tumor pode acelerar a taxa de liberação da droga e promover a morte de células cancerígenas mediada por ROS.

Materiais e métodos

Materiais

O PL foi adquirido da LKT Labs. Co., (Minnesota, EUA). Poli (L-lactídeo) (PLA, PLA-0005, M.W. =5000 g / mol a partir dos dados do fabricante) foi adquirido de Wako Pure Chem. Co. Ltd. (Osaka, Japão). O metoxi poli (etilenolicol) -succinimidilglutarato (MePEG-NHS, M.W. =5000 g / mol) foi adquirido a Sunbio Co. Ltd. (Seul, Coréia). O stent revestido com membrana de silicone para o trato biliar foi obtido da M.I. Tech. (Pyeongtaek, Coréia). Poli (ε-caprolactona) (PCL, número médio de MW =80.000 g / mol), N-hidroxisuccinimida (NHS), N- (3-dimetilaminopropil) -N′-etilcarbodiimida cloridrato (EDAC), tetrahidrofurano (THF), clorofórmio , dimetilsulfóxido (DMSO), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) e dicloridrato de selenocistamina foram adquiridos de Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO , EUA). A membrana de diálise ou dispositivo de diálise (tamanho de corte M.W. (MWCO) 1000 g / mol e 8000 g / mol) foi adquirido a Spectrum / Por Lab., Inc. (CA, EUA). Todos os solventes orgânicos e outros produtos químicos foram usados ​​como grau extra puro. Suprimentos de cultura de células, como meio RPMI1640 e soro fetal bovino (FBS), foram adquiridos na Life Tech. Inc. (Grand Island, NY, EUA). Todos os reagentes e solventes orgânicos usados ​​eram de qualidade para HPLC.

Síntese do copolímero de bloco LEse

Conjugados de MePEG-selenocistamina

MePEG-NHS (500 mg) foi dissolvido em 20 mL de DMSO. Mais de cinco equivalentes de selenocistamina foram dissolvidos separadamente em 15 mL de água desionizada e misturados com 5 mL de DMSO. Depois disso, a solução de selenocistamina foi lentamente gotejada na solução de MePEG-NHS e, em seguida, agitada magneticamente por 24 h. Em seguida, os reagentes foram introduzidos em um tubo de diálise (MWCO 1000 g / mol) e então dialisados ​​contra bastante água por 2 dias. A solução dialisada foi liofilizada durante 2 dias. O sólido liofilizado foi usado para sintetizar o copolímero em bloco.

Síntese de copolímero em bloco

PLA (500 mg) foi dissolvido em 20 mL de DMSO com quantidade equivalente de EDAC e NHS. Esta solução foi agitada magneticamente durante 12 h. A esta solução, foi adicionado mPEG-selenocistamina sólido (530 mg) e posteriormente agitado durante 2 dias. Em seguida, os reagentes foram introduzidos em um tubo de diálise (MWCO:8000 g / mol) e então dialisados ​​contra bastante água por 2 dias. A solução dialisada foi liofilizada durante 2 dias. Os produtos liofilizados foram precipitados em metanol para remover mais uma vez o mPEG-selenocistamina que não reagiu. O rendimento final foi superior a 94%. Rendimento =[(peso do sólido liofilizado) / (peso de PLA + peso de mPEG-selenocistamina)] × 100.

Caracterização de polímeros

Para monitorar a síntese de polímero, ¹ A espectroscopia de ressonância magnética nuclear H (NMR) foi empregada. Os polímeros foram dissolvidos na forma DMSO-d e medidos com ¹ Espectroscopia de H-NMR (500 MHz Superconducing FT-NMR Spectrometer, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, EUA).

O peso molecular dos polímeros foi medido com cromatografia de permeação em gel (GPC, sistema Waters GPC, MA 01757, EUA):bomba de solvente Waters 1515 HPLC, detector de índice de refração Waters 2414 e três colunas Waters Styragel de alta resolução (HR4, HR2, HR1 ) Os polímeros foram dissolvidos em THF de grau extra puro contendo LiBr 0,1 N como eluente (taxa de fluxo 1,0 mL / min). Poliestirenos foram usados ​​para fazer uma curva de calibração.

Tapetes de nanofibra carregados com PL e revestidos no stent GI

Esteiras de nanofibra carregadas com PL

Vorinostat (100 mg) foi dissolvido em 10 mL de solução de acetona. A esta solução, LEse (100 ~ 400 mg) e PCL (600 ~ 900 mg) foram então adicionados e agitados magneticamente durante 2 h. Esta solução foi usada para fabricar tapetes de nanofibras e revestir o stent coberto por membrana de silicone usando uma máquina de eletrofiação (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seul, Coreia do Sul). A máquina de eletrofiação é composta por uma fonte de alimentação de alta tensão, bomba de seringa, sistema robótico X-Y e coletor de tambor. A solução de polímero / droga em uma seringa (NanoNC, 24G) foi pulverizada sobre o stent de metal coberto por membrana de silicone (diâmetro 1 cm, comprimento 10 cm, velocidade de rolamento 500 rpm, taxa de pulverização 100 μL / minuto, voltagem 15 kV) que é colocado no coletor de rolamento. Membrana de nanofibra carregada com PL foi revestida no stent. Para remover o solvente restante, o stent revestido com nanofibra carregado com PL foi seco em um forno de secagem a vácuo durante 24 h. Stents revestidos com nanofibras carregados com PL foram armazenados a 4 ° C até o estudo seguinte.

Esteiras de nanofibra carregadas com PL foram cuidadosamente separadas do stent para liberação da droga e estudo em animais. Membrana de nanofibra vazia foi preparada na ausência de PL com um procedimento semelhante.

O conteúdo da droga foi medido da seguinte forma:5 mg de mantas de nanofibras incorporadas a PL foram dissolvidas em DMSO por 2 h. O espectrofotômetro de UV (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japão) foi usado para medir a concentração do fármaco a 325 nm. Esteiras de nanofibras vazias também foram dissolvidas em DMSO e usadas para o teste em branco.
$$ \ mathrm {Drug} \ \ mathrm {content} \ \ left (\%, w / w \ right) =\ left (\ mathrm {PL} \ \ mathrm {weight} / \ mathrm {total} \ \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {nanofibra} \ \ mathrm {tapetes} \ certo) \ vezes 100. $$
O estudo de liberação da droga foi realizado com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4) in vitro. Esteiras de nanofibra foram cortadas em discos e 10 mg de discos foram imersos em 40 mL de PBS (0,01 M, pH 7,4) em um tubo cônico de 50 mL. Este foi colocado em uma incubadora com agitação a 100 rpm (37 ° C). Meios inteiros foram tomados para medir a concentração de PL liberado de tapetes de nanofibras em intervalos de tempo específicos. A concentração de PL no meio foi medida com espectrofotômetro de UV (325 nm). Esteiras de nanofibras vazias também foram utilizadas como teste em branco. No estudo de liberação, o peróxido de hidrogênio foi adicionado ao meio de liberação para investigar o efeito das ROS na taxa de liberação da droga.

Morfologia

A morfologia dos tapetes de nanofibras foi observada com um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (S-4800; Hitachi, Tóquio, Japão) a 25 kV.

Cultura de células

As linhas de células CCA humanas, tais como SNU478, SNU245 e SNU 1196 CCA, foram obtidas no Korean Cell Line Bank (Seul, Coréia). A linha de células humanas CCA HuCC-T1 foi obtida do Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japão). Todas as células foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com 10% de FBS inativado por calor e 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO ₂ incubadora.

Estudo de atividade anticâncer

Várias células CCA (1 × 10 ⁴ ) semeados em placas de 96 poços foram usados ​​para avaliar a atividade anticâncer do próprio PL, esteiras de nanofibra incorporadas a PL ou PL liberado de esteiras de nanofibra. As células foram mantidas durante a noite em 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C. Para o tratamento PL, os PL dissolvidos em DMSO (10 mg PL / mL DMSO) foram diluídos com meio RPMI1640. A concentração final de DMSO foi inferior a 0,5%. Para o tratamento de PL liberado de esteiras de nanofibra, as esteiras de nanofibra incorporadas à PL foram imersas em 40 mL de PBS em tubo cônico de 50 mL. No dia 5 e no dia 15, a concentração de PL foi medida com espectrofotômetro UV como descrito acima e usado para tratar células. A nanofibra vazia também foi adaptada para o experimento de lançamento para comparação. As células foram expostas ao próprio PL ou ao PL liberado de esteiras de nanofibras por 2 dias. A viabilidade das células CCA foi avaliada com o ensaio de proliferação MTT. Solução de MTT de trinta microlitros (5 mg / mL PBS, pH 7,4) foi adicionada aos poços e, em seguida, as células foram incubadas por 4 h em 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C. O meio foi descartado e adicionado 100 μl de DMSO. A viabilidade celular foi analisada com um leitor de microplacas a 570 nm (leitor de microplacas Infinite M200 Pro, Tecan, Mannedorf, Suíça). A viabilidade celular foi expressa como média ± desvio padrão de oito poços.

Medição de ROS

A geração de ROS em células CCA foi avaliada pelo método DCFH-DA. Células CCA (1 × 10 ⁴ células) semeadas em uma placa de 96 poços foram tratadas com várias concentrações do próprio PL ou PL liberado de tapetes de nanofibra em meio RPMI sem vermelho de fenol com DCFH-DA (concentração final de 20 μM). Seis horas ou 12 horas depois, as células foram lavadas com PBS duas vezes e substituídas por 100 μL de meio RPMI livre de vermelho de fenol fresco. O conteúdo de ROS nas células foi analisado por alterações de intensidade de fluorescência usando o leitor de microplaca Infinite M200 pro (comprimento de onda de excitação 485 nm, comprimento de onda de emissão 535 nm).

Western Blotting

O Western blotting de células CCA foi realizado conforme descrito anteriormente [31]. As células foram expostas ao próprio PL ou ao PL liberado de esteiras de nanofibras por 24 h. Depois disso, as células foram colhidas por tripsinização, lavadas com PBS frio e coletadas por centrifugação. Os peletes foram lisados ​​em tampão de lise contendo 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% de ácido desoxicólico, 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) com fluoreto de fenilmetilsulfonil e um coquetel inibidor de protease (Roche Diagnostics, Basel, Suíça ) Esta solução foi centrifugada durante 30 min a 4 ° C (14.000 × g ); os lisados ​​celulares (sobrenadante) foram então usados ​​para medir a concentração de proteína usando o kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, EUA). A proteína (50 μg) foi carregada em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), transferida para uma membrana de difluoreto de polivinila (PVDF), bloqueada com 5% de leite desnatado em TBS-T, sondada com um anticorpo primário apropriado e, em seguida, tratada com um anticorpo secundário conjugado com HRP por 1 h. Os immunoblots foram detectados por quimioluminescência e, em seguida, quantificados com análises digitais usando o programa de software ImageJ.

Estudo in vivo usando modelo de xenoenxerto de tumor

Camundongos com HuCC-T1 (camundongo nu BALB / c, 5 semanas de idade, macho, 18-23 g de peso; Orient, Seongnam, Coreia do Sul) foram usados ​​para avaliar a atividade antitumoral in vivo do stent de nanofibra incorporado com PL. 1 × 10 ⁶ Células HuCC-T1 em 100 μL de PBS foram administradas por via subcutânea (s.c.) nas costas de camundongos nus. Discos de nanofibra incorporada a PL e nanofibra vazia foram implantados sob o tumor sólido quando o tumor sólido se tornou aproximadamente 4 ~ 5 mm de diâmetro. A dose de PL foi de 10 mg de PL / kg. Para comparação, o PL foi dissolvido em solução de mistura de Cremophor EL® / etanol (0,5% v / v Cremophor EL® e 0,5% v / v etanol em PBS (pH 7,4, 0,01 M)). Os grupos de controle foram injetados por via subcutânea com PBS ao lado do tecido tumoral. Para nanofibras incorporadas a PL e grupo de nanofibras vazio, os discos de nanofibras foram preparados como segue; wafers de nanofibra com o mesmo peso foram cortados em discos redondos e, em seguida, a parte de trás da pele do camundongo foi cuidadosamente excisada (0,5 cm de comprimento). Em seguida, wafers de nanofibra foram cuidadosamente implantados sob o tecido tumoral sólido. Para fazer uma condição de igualdade, camundongos com tratamento de controle e injeção de PL também excisaram a pele ao lado do tumor (0,5 cm de comprimento). Cada grupo consistia em cinco camundongos. O volume do tumor foi medido com intervalos de 5 dias, e o primeiro dia de implantação da nanofibra foi definido como o dia 0. O volume do tumor foi calculado pela seguinte equação: V =( a × [ b ] ² ) / 2. a :maior diâmetro; b :menor diâmetro.

Todo o estudo em animais foi realizado cuidadosamente de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Universidade Nacional de Pusan ​​(PNUIACUC). O protocolo animal utilizado neste estudo foi rigorosamente revisado pelo PNUIACUC quanto aos seus procedimentos éticos e cuidados científicos, e foi aprovado (Número de Aprovação:PNU-2017-1608).

Imunohistoquímica

Os tecidos tumorais foram isolados 30 dias depois. Em seguida, os tecidos tumorais foram fixados em formaldeído 4%, embebidos em parafina e fatiados para coloração com hematoxilina e eosina (H&E). A coloração imunohistoquímica foi realizada com proteínas relacionadas à apoptose, como caspase-3 e anticorpos caspase-9. Os anticorpos foram usados ​​em uma diluição de 1:100 ou 1:200 e, em seguida, a coloração foi realizada usando um kit Envision (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise estatística

As análises estatísticas dos dados de células tratadas e não tratadas foram realizadas usando o t de Student teste. A p valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de polímeros

Para fabricar o stent GI eluidor de PL, o copolímero em bloco LEse foi sintetizado como mostrado na Fig. 1. MePEG-NHS foi reagido com selenocistamina e, em seguida, o grupo amina terminal foi conjugado com o grupo terminal carboxila de PLA. A selenocistamina não reagida de conjugados MePEG-selenocistamina foi removida por procedimento de diálise. Além disso, os conjugados de MePEG-selenocistamina não reagidos do copolímero em bloco sintetizado também foram removidos por procedimento de diálise e precipitação em metanol. Picos específicos de selenocistamina foram confirmados em 1,7 ppm e 2,9 ppm, respectivamente, enquanto o pico específico de MePEG também foi confirmado em 3,5 ~ 3,7 ppm. Quando o PLA foi conjugado, o grupo metil do PLA foi confirmado em 1,4 ppm. O homopolímero PCL e a mistura de copolímero em bloco LEse foram misturados para fabricar esteiras de nanofibra. M.W. e composição do copolímero em bloco LEse e homopolímero PCL foram medidos com ¹ Espectroscopia de H-NMR e GPC. Os resultados da estimativa de M.W. foram mostrados na Tabela 1. Conforme mostrado na Tabela 1, M.W. de copolímero de bloco de LEse foi estimado com base no M.W. de PEG usando ¹ Espectroscopia de H-NMR como 9760 g / mol. A medição de GPC mostrou que o copolímero em bloco LEse tem 8210 g / mol de Mn, 9530 g / mol de Mw e 1,16, respectivamente.

Esquema de síntese de copolímero de bloco LEse

Caracterização do Stent GI Revestido com Nanofibra Incorporada com Piperlongumina

Conforme mostrado na Fig. 2 e na Tabela 2, várias razões de copolímero em bloco PCL e LEse foram usadas para fabricar nanofibras e revestir o stent GI. O homopolímero PCL resultou em tapetes de nanofibras finas e finas com forma agregada minimizada. Quando o copolímero em bloco de LEse foi adicionado, parte da forma agregada, como grânulos e partículas, foi observada como mostrado na Fig. 2. Na razão LEse mais alta (75/25 e 60/40), os tapetes de nanofibras exibiram uma forma mais espessa e irregular de fibras estrutura. Quando consistia em mais de 50% de razão de LEse em seus conteúdos, os polímeros foram agregados significativamente e as mantas mostraram irregularidade severa (dados não mostrados). A estrutura nanofibrosa dificilmente foi obtida a partir do copolímero de bloco LEse sozinho. Portanto, a estrutura nanofibrosa pode ser obtida por mistura com homopolímero PCL. Os conteúdos da droga nas esteiras de nanofibras incorporadas com PL preparadas foram quase semelhantes ao valor teórico, conforme mostrado na Tabela 2. Estes resultados indicaram que as esteiras de nanofibras incorporadas com PL foram fabricadas com sucesso a partir de misturas de homopolímero PCL e copolímero em bloco LEse e, em seguida, revestidas no stent GI.

a Stent GI coberto com nanofibras com incorporação de PL. b Foto FE-SEM de nanofibra incorporada a PL

A Fig. 3 mostra a cinética de liberação de drogas a partir de esteiras de nanofibras. Conforme mostrado na Fig. 3a, PL foi continuamente liberado de tapetes de nanofibras ao longo de 25 dias. A liberação de estouro de PL dos tapetes de nanofibra foi observada até 4 dias, e então PL foi continuamente liberado dos tapetes de nanofibra até o dia 25. Teores mais elevados de copolímero de bloco LEse em tapetes de nanofibra resultaram na liberação mais rápida de PL dos tapetes de nanofibra. Uma vez que o copolímero em bloco LEse é menos hidrofóbico do que o homopolímero PCL, os tapetes de nanofibra PCL / LEse com maior teor de copolímero em bloco LEse devem ser mais dilatados do que o homopolímero PCL. Então, esteiras de nanofibras com maior conteúdo de copolímero em bloco LEse resultaram em liberação mais rápida do medicamento. Além disso, a taxa de liberação de PL pode ser acelerada na presença de ROS, uma vez que a ligação de disseleneto no copolímero de bloco LEse pode ser desintegrada por ROS, como H ₂ O ₂ , e então esses fatores induzem a desintegração redox-responsiva de esteiras de nanofibras (Fig. 3c ~ e). Os tapetes de nanofibra de homopolímero PCL não foram significativamente responsivos à adição de H ₂ O ₂ , ou seja, PCL não é amplamente afetado por H ₂ O ₂ Adição; por outro lado, quando o copolímero de bloco LEse foi misturado, a liberação de PL das esteiras de nanofibra foi significativamente acelerada como H ₂ O ₂ foi adicionado . Especialmente, a razão de copolímero de bloco LEse mais elevada nas mantas de nanofibra induziu uma cinética de liberação de fármaco mais rápida, como mostrado na Fig. 3c, d e e. Esses resultados indicaram que esteiras de nanofibras incorporadas a PL têm potencial de liberação de droga responsivo a redox no ambiente biológico. Esteiras de nanofibra incorporadas a PL preparadas com copolímero em bloco PCL / LEse (60/40) foram utilizadas após cultura de células in vitro e estudo em animais in vivo.

a Liberação de PL de nanofibras com várias composições. A proporção de peso PCL / Lese era 100/0, 90/10, 75/25 e 60/40, respectivamente. b O efeito do peróxido de hidrogênio na liberação de PL a partir de esteiras de nanofibras (razão de peso PCL / Lese foi de 100/0). c O efeito do peróxido de hidrogênio na liberação de PL das mantas de nanofibras (relação de peso PCL / Lese foi de 90/10). d O efeito do peróxido de hidrogênio na liberação de PL das mantas de nanofibras (relação de peso PCL / Lese foi de 75/25). e O efeito do peróxido de hidrogênio na liberação de PL a partir de esteiras de nanofibras (relação de peso PCL / Lese foi 60/40)

Atividade anticâncer in vitro

As propriedades anticâncer do stent revestido com tapete de nanofibra incorporado com PL foram avaliadas com várias células CCA. Para comparação, o PL liberado das esteiras de nanofibra foi extraído no dia 5 e no dia 15 durante o experimento de liberação e foi comparado ao PL intacto. Como mostrado na Fig. 4, a atividade anticâncer na PL liberada a partir do dia 5 e dia 15 não mudou significativamente em comparação com a própria PL em todas as células HuCC-T1 (Fig. 4a), células SNU1196 (Fig. 4b), células SNU478 ( Fig. 4c) e células SNU245 (Fig. 4d). Eles têm potencial de inibição quase semelhante na viabilidade celular, embora o próprio PL tenha resultado em maior atividade anticâncer em concentração superior a 10 μg / mL. A Tabela 3 mostra o IC ₅₀ valor do próprio PL e o PL lançado a partir de esteiras de nanofibras. Assim como a própria PL, a PL liberada a partir do dia 5 e do dia 15 manteve a atividade anticâncer até 15 dias do experimento de liberação da droga e apresentou IC razoável ₅₀ valor em todas as linhas de células CCA, embora esses valores tenham aumentado gradualmente no PL a partir do dia 5 e do dia 15 em comparação com o próprio PL. PL liberado a partir do dia 4 e dia 15 na presença de H ₂ O ₂ também manteve a atividade anticâncer, bem como a própria PL. Esses resultados indicaram que a atividade anticâncer da PL se manteve durante o processo de fabricação das nanofibras e período de liberação do fármaco no ambiente biológico. Além disso, o PL liberado a partir de esteiras de nanofibras produziu capacidade de geração de ROS até 15 dias do período de liberação do fármaco, semelhante ao próprio PL (Fig. 5). Conforme mostrado nas Fig. 5a eb, o próprio PL produziu ROS significativamente mais a uma taxa mais alta do que 5 μg / mL. A PL liberada a partir do dia 5 e do dia 15 também produziu ROS, embora a produção de ROS tenha diminuído ligeiramente pela PL liberada a partir do dia 15, indicando que as mantas de nanofibra incorporadas à PL mantiveram a propriedade anticâncer intrínseca da PL durante o período de liberação do fármaco.

O efeito da PL e da PL liberada de tapetes de nanofibra na viabilidade de várias células CCA. a HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 e d Células de colangiocarcinoma SNU245. 2 × 10 ⁴ células em placas de 96 poços foram expostas a PL ou PL liberadas de nanofibras por 2 dias. Para o tratamento de PL liberado, discos de nanofibras incorporados a PL foram imersos em PBS e, em seguida, o experimento de liberação foi realizado por 5 e 15 dias com ou sem H 10 mM ₂ O ₂ . O meio foi trocado até 3 dias como similar ao estudo de liberação do fármaco. Em seguida, o meio foi colhido entre 5 e 15 dias do experimento de liberação. Esta solução foi usada para investigar a comparação da atividade anticâncer do próprio PL e do PL liberado

O efeito de PL e PL liberado de esteiras de nanofibras na geração de ROS de células HuCC-T1 ( a ) e células SNU245 ( b ) O próprio PL e o PL liberado foram tratados conforme descrito na Fig. 3

A Figura 6 mostrou a expressão da proteína de apoptose em células HuCC-T1 CCA. A PL liberada (5 dias) tem atividade semelhante na indução de apoptose de células HuCC-T1 em comparação com a própria PL, ou seja, a expressão de BAX, caspase-3, 7 e 9, e clivagem de PARP clivada foi gradualmente aumentada pelo tratamento de lançou o PL (5 dias) e também o próprio PL. Esses resultados também indicaram que a PL liberada tem razoável atividade anticâncer contra as células CCA, bem como a própria PL.

Análise de Western blot de apoptose de células HuCC-T1. As células foram tratadas com a própria PL ou a PL liberada de nanofibras por 1 dia e, em seguida, realizada análise de Western blot

Atividade anticâncer in vivo contra modelo de xenoenxerto de tumor HuCC-T1

Camundongos nus com HuCC-T1 foram preparados para avaliar a atividade anticâncer in vivo do stent revestido com nanofibra incorporado com PL como mostrado nas Figs. 7 e 8. Como mostrado na Fig. 7, o volume do tumor HuCC-T1 foi aumentado gradualmente ao longo de 1 mês. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ) HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p  < 0.001; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O ₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O ₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.

Laser de fibra dopada com Er-bloqueado em modo usando absorvedor saturável MoS2 / SiO2 Avaliação da biodegradação de poli (ácido láctico) preenchido com nanopartículas de titânia funcionalizadas (PLA / TiO2) sob condições de composto