Demonstração de um biossensor flexível à base de grafeno para detecção sensível e rápida de células cancerosas do ovário

Resumo

É significativo desenvolver um método eficiente de detecção precoce e predição para câncer de ovário por meio de uma abordagem fácil e de baixo custo. Para abordar tais questões, aqui, desenvolvemos um novo método de detecção de células tumorais circulantes (CTC) para detectar com sensibilidade o câncer de ovário usando um biossensor flexível à base de grafeno em substrato de tereftalato de polietileno (PET). Os resultados mostram que o biossensor flexível à base de grafeno demonstra detecção sensível e rápida para células de câncer de ovário:ele fornece respostas diferentes óbvias para meio de cultura de células e solução de câncer, diferentes células de câncer e solução de células de câncer com diferentes concentrações; demonstra alta sensibilidade para detectar várias dezenas de células cancerígenas de ovário por ml; além disso, o biossensor de grafeno flexível é muito adequado para a detecção rápida e sensível de células de câncer de ovário em 5 s. Este trabalho fornece uma estratégia de fabricação de biossensores de grafeno fácil e de baixo custo para detectar / identificar com sensibilidade e rapidez células CTC de câncer de ovário.

Resumo gráfico

Introdução

O câncer de ovário é o segundo câncer ginecológico mais comum e tem a maior mortalidade entre os cânceres ginecológicos [1, 2]. Até agora, as pacientes com câncer de ovário geralmente são diagnosticadas muito tarde devido aos sintomas inespecíficos do câncer de ovário e à falta de métodos eficazes de rastreamento precoce. A imagem combinada com o antígeno de carboidrato CA125 pode ser usada na detecção e no diagnóstico de recorrências após cirurgia ou quimioterapia. CA125 não é um único marcador preciso para câncer de ovário porque é afetado por vários fatores e tem alto valor preditivo falso positivo. A sensibilidade do CA125 elevado (> 35 U / mL) que usamos no diagnóstico da recorrência do câncer de ovário é inferior a 70% [3]. O exame de ultrassom e o exame radiológico também não apresentam sensibilidade adequada nem especificidade na detecção precoce e diagnóstico de recorrência. As taxas de sobrevida em 5 anos do câncer de ovário nos estágios I e II são de 90% e 70% separadamente [4]. Apesar do avanço no tratamento cirúrgico e na terapia adjuvante, a sobrevida em 5 anos do câncer de ovário em estágio avançado é inferior a 30% [4]. A detecção precoce do câncer de ovário está relacionada à óbvia taxa de sobrevida em 5 anos, e o diagnóstico precoce de recorrência também é importante. Diversas novas abordagens, como o autoanticorpo TP53, ensaios de metilação do DNA, algoritmos de microRNA e análises citológicas semelhantes ao Pap, foram relatadas para melhorar a sensibilidade da detecção precoce do câncer de ovário [5]. No entanto, é urgente, mas ainda desafiador, desenvolver um novo método de detecção com maior sensibilidade para todos os estágios do câncer de ovário.

Recentemente, pesquisadores descobriram que os tumores em estágio inicial podem se espalhar pelas células cancerosas na corrente sanguínea e causar metástases [6]. As células entram na corrente sanguínea periférica por meio de intravasamento de tumores primários, recorrências ou metástases chamadas células tumorais circulantes que podem ser usadas como biomarcadores diagnósticos ou prognósticos para tumores sólidos [7]. As CTCs são raras no sangue periférico e os métodos de detecção precisam de alta sensibilidade e especificidade. Nos últimos anos, a separação imunomagnética, a separação microfluídica, os métodos baseados em filtro e a PCR direcionada ao ligante foram relatados na detecção de CTC [8,9,10,11]. Até o momento, o sistema de busca de células da Janssen Diagnostics é o único método de detecção de CTC aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) dos EUA, que pode ser usado para monitorar pacientes com câncer de mama metastático, colorretal e de próstata [12,13,14]. A detecção da CTC no câncer de ovário fornece um método diagnóstico não invasivo e tem uma vantagem quando é difícil para a biópsia. No entanto, a taxa de detecção de CTC na fase inicial do câncer de ovário ainda é baixa. Os novos métodos para detectar CTC com maior sensibilidade ainda são necessários. Se pudermos detectar facilmente a CTC em pacientes com câncer de ovário, ela pode ser útil na detecção precoce do tumor, no monitoramento da recorrência e no efeito do tratamento.

Grafeno, um semicondutor bidimensional foi isolado por Andre Geim e Kostia Novoselov em 2004 [15]. Recentemente, materiais 2D semelhantes ao grafeno têm sido amplamente aplicados em sensoriamento e bio-sensoriamento, conversão e armazenamento de energia, catálise, compósitos e revestimentos, eletrônica e campo biomédico [15]. O sensor de grafeno é um candidato promissor para detectar biomarcadores de câncer devido à sua estrutura única e excelente desempenho elétrico, que foi desenvolvido para detectar antígeno carcinoembrionário, antígeno específico da próstata, antígeno de carboidrato 19–9 e 15–3 [16,17,18,19 ] Comparado aos biossensores convencionais à base de grafeno fabricados em SiO rígido ₂ / Si substratos por fotolitografia convencional, evaporação de eletrodo, decolagem e processo de pacote de sensor usando instalações preciosas, é significativo desenvolver uma abordagem fácil e de baixo custo para fabricar biossensores flexíveis à base de grafeno com alta sensibilidade e velocidade de detecção rápida.

Para abordar tais questões, aqui, desenvolvemos uma abordagem nova e fácil para fabricar biossensores flexíveis à base de grafeno em substrato PET. Dois eletrodos foram fabricados diretamente em grafeno / PET usando pasta de prata, e o pool de células foi construído diretamente usando gel de silicone; este biossensor flexível pode ser feito manualmente em qualquer laboratório sem a necessidade de processo de fotolitografia e instalações preciosas. Surpreendentemente, nossos biossensores flexíveis à base de grafeno demonstram alta sensibilidade e podem detectar rapidamente as células de câncer de ovário. Até onde sabemos, não há relatos sobre biossensores flexíveis à base de grafeno para detecção de células cancerígenas de ovário.

Materiais e métodos

Crescimento e transferência de filme de grafeno

Neste trabalho, o filme de grafeno foi crescido na superfície de uma folha de Cu (Alfa Aesar, nº 13382) por deposição química de vapor (CVD) [20]. Em primeiro lugar, o óxido de superfície da folha de Cu foi removido por solução de ácido clorídrico a 20% durante 5 min; em seguida, a folha de Cu foi limpa por várias vezes com água desionizada e, em seguida, seca com fluxo de nitrogênio. A folha de Cu limpa foi colocada em um barco de quartzo e colocada no tubo de quartzo do forno CVD. A câmara do forno foi bombeada para 1 × 10 ^–2 Pa. A temperatura do forno foi aumentada até 1000 ° C por 20 min com 50 sccm de 99,999% H ₂ , e então, 50 sccm de metano 99,999% foi introduzido no tubo para crescimento de filme de grafeno de grande área por 20 min. Finalmente, o forno CVD foi resfriado à temperatura ambiente com CH ₄ / H ₂ fluxo de gás.

A folha de grafeno / Cu de grande área foi cortada em muitos pedaços desejados. Em seguida, o PMMA foi revestido por rotação na superfície de grafeno / folha de Cu, formando a estrutura semelhante a um sanduíche de PMMA / grafeno / Cu. Posteriormente, a folha de Cu subjacente foi gravada com 1 M FeCl ₃ solução. O PMMA / grafeno foi limpo em água DI por 30 min e depois transferido para o substrato PET. Finalmente, o PMMA foi removido com acetona, e a amostra de grafeno / PET foi obtida.

Fabricação de biossensores baseados em grafeno

O procedimento de fabricação de biossensores à base de grafeno é descrito a seguir. Em primeiro lugar, um filme de grafeno de cerca de 1 cm x 2 cm em folha de Cu foi transferido para substrato PET de 1 cm x 2 cm pelo método de transferência úmida assistida por PMMA. Em seguida, dois eletrodos foram fabricados próximo ao centro do filme de grafeno / PET usando pasta de prata. Finalmente, a fim de testar a resposta elétrica da solução de células cancerosas, um pool de células com vários milímetros de comprimento e largura e cerca de 1 mm de altura foi construído por gel de silicone na borda do eletrodo. Depois que o gel de silicone do pool de células está completamente solidificado, pode-se usar o analisador de semicondutor Agilent 4155B para verificar se o biossensor de grafeno pode funcionar normalmente.

Cultura de células SKOV3 de câncer de ovário

As séries de células de câncer de ovário SKOV3 (fornecidas pelo laboratório público do Segundo Hospital Afiliado da China Ocidental) foram cultivadas em meio completo RPMI-1640 (Transgene, França) contendo 10% de soro de bezerro (MRC, EUA) sob a condição de 5% de CO ₂ e 37 ° C.

Preparação da solução celular e medição elétrica

As células cancerosas foram diluídas para uma concentração específica com meio de cultura de células. Pegue a solução de células de 50 μL com a pipeta na ranhura para medição. O sinal elétrico foi registrado pelo analisador de semicondutor Agilent 4155B.

Resultados e discussão

A fotografia de 10 × 10 cm ² O filme de grafeno cultivado com CVD de grande área em folha de Cu é mostrado na Fig. 1 a. Na Fig. 1a, pode-se observar que em comparação com a folha de Cu puro com cor metálica brilhante, a cor do grafeno / Cu é um pouco mais escura. O espectro Raman correspondente de grafeno / Cu é mostrado na Fig. 1b. Conforme mostrado na Fig. 1b, o Raman atinge o pico em 1580 cm ⁻¹ e 2680 cm ⁻¹ correspondem aos picos G e 2D do filme de grafeno. A fim de verificar melhor a qualidade do filme de grafeno, medimos o espectro Raman do filme de grafeno monocamada transferido para SiO ₂ / Si substrato, como mostrado na Fig. 1c. Pode-se observar que a relação entre I _G e eu _2D é inferior a 0,5, o que confirma que a espessura do grafeno é monocamada; pode-se observar também que o D pico está muito baixo e quase não pode ser observado, o que sugere que a qualidade do filme de grafeno é muito alta e os defeitos são poucos.

a Fotografia de folha de Cu (painel esquerdo) e grafeno cultivado em folha de Cu (painel direito), b Espectro Raman de grafeno / Cu e c Espectro Raman do grafeno / SiO ₂ /Si

As fotografias de biossensores de grafeno flexíveis em substratos de PET são mostradas na Fig. 2. A solução de células cancerosas pode ser adicionada ao pool de células e o sinal elétrico do biossensor de grafeno pode ser obtido a partir de dois eletrodos de pasta de prata. A resposta elétrica para o meio de cultura de células e solução de CTC foram medidos.

Fotografia do biossensor de grafeno / PET

A dependência do tempo da resposta de corrente para tais líquidos é registrada em uma voltagem fixa de 0,01 V antes e depois de colocá-los no pool de células. Conforme mostrado na Fig. 3, pode-se observar que antes de mergulhar o líquido, a corrente se mantém constante; quando esses líquidos são colocados no reservatório de células, a corrente diminui rapidamente e, então, lentamente mantém um novo equilíbrio. A resposta é definida como η =( eu ₀ - eu ) / eu ₀ * 100%, onde eu ₀ é a corrente antes de mergulhar o líquido, e eu é o valor máximo (ou mínimo) após mergulhar o líquido em algum momento. Pode-se ver que depois de colocar esses líquidos, a resistência do grafema aumenta. A resposta elétrica para o meio de cultura de células nuas e a solução de CTC antes e após a imersão da solução 200 s são 2,96% e 37,04%, respectivamente. Obviamente, em comparação com o meio de cultura de células nuas, a resposta elétrica para a solução de CTC mesmo com 30 células / ml é muito significativa, o que sugere que o biossensor flexível à base de grafeno é muito sensível para a detecção de células cancerígenas.

a Resposta elétrica para meio de cultura de células nuas, e b solução de câncer com 30 células

A dependência do sinal elétrico para o meio de cultura de células nuas e a solução de CTC com 30 células cancerígenas / ml é analisada posteriormente a partir da Fig. 3. Como mostrado na Fig. 4, pode-se observar que, em comparação com o meio de cultura de células nuas, o elétrico a resposta para a solução CTC (mesmo como 30 células / ml) é muito sensível e rápida. Depois de mergulhar a solução celular, ela precisa de apenas 2,1, 2,0, 4,5, 7,5, 10,5, 28,5 s para atingir a resposta de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, enquanto a resposta da cultura celular correspondente médio aumenta apenas de 0,15 para 1,3%. Isso significa que o biossensor de grafeno flexível é muito adequado para detecção rápida e sensível em 5 s.

Dependência do tempo da resposta elétrica para meio de cultura de células e solução CTC

Investigamos ainda mais a resposta elétrica para dois tipos de células cancerígenas CTC (células SUDHL8 e células OCILYS) com as mesmas concentrações de 10.000 (10 K) / ml. Conforme mostrado na Fig. 5, a dependência do tempo da corrente para duas células cancerosas diferentes com uma tendência um pouco diferente e uma grande diferença na resposta elétrica. Ou seja, o biossensor de grafeno promete ser usado para identificar diferentes células cancerígenas.

Dependência do tempo da resposta elétrica para diferentes células cancerígenas: a SUDHL8 e b OCILYS

A dependência do tempo da corrente elétrica e da resposta para a solução de células cancerígenas SUDHL 8 com várias concentrações de células de 10.000 (10 K) / ml e 100 K / ml também foi investigada. Conforme mostrado na Fig. 6, pode-se observar que a solução com menor concentração de células cancerígenas apresenta maior corrente, o que sugere que a célula cancerosa tende a ser isolante e muitas outras células não são benéficas para a condutora. A dependência do tempo de resposta para duas soluções de concentração mostra tendências de mudança semelhantes e a resposta para solução de concentração mais baixa é um pouco maior do que a solução de concentração mais alta. Esses resultados mostram que o biossensor pode ser usado para identificar a solução do câncer com diferentes concentrações.

Dependência da corrente elétrica com o tempo ( a ) e resposta ( b ) para células cancerígenas SUDHL8 com diferentes concentrações de 10 K e 100 K células / ml

Como mencionado acima, os resultados mostram que o biossensor à base de grafeno barato e flexível demonstra resposta diferente para meio de cultura de células e solução de câncer, diferentes células de câncer e solução de células de câncer com diferentes concentrações, o que sugere que tal biossensor à base de grafeno flexível é promissor para ser usado para detectar e identificar células CTC de câncer de ovário.

Conclusion

In order to develop an efficient early detection method particularly for ovarian cancer, we develop a very simple graphene-based flexible biosensor on PET substrate. This flexible biosensor consists of a cell pool and two electrodes and compares the electric signal before and after adding cell solution, which shows high sensitivity and fast detection speed. It shows obvious different responses for cell culture medium and cancer solution, different cancer cells and cancer cell solution with different concentrations. Our work indicates that flexible graphene-based biosensor is promising to be used to sensitively and rapidly detect/identify CTC ovarian cancer cells.

Availability of Data and Materials

Authors can confirm that all relevant data are included in the article and its supplementary information files.

Abbreviations

CA:: Carbohydrate antigen
CTC:: Circulating tumor cell
PET:: Polyethylene terephthalate
FDA:: Food and Drug Administration
CVD:: Chemical vapor deposition

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