Stent GI Elutante de Piperlongumina Responsivo a ROS: Nova Estratégia de Nanofibra para Suprimir Colangiocarcinoma

Resumo

Contexto

Projetamos um stent gastrointestinal (GI) elutante de fármaco que libera piperlongumina (PL) via tapetes de nanofibra sensíveis a espécies reativas de oxigênio (ROS). Os tapetes carregados de PL foram projetados para fornecer efeito anticâncer localizado, disparado por ROS, contra células de colangiocarcinoma (CCA).

Métodos

Sintetizamos um copolímero em bloco ligado a disseleneto (LEse) conjugando selenocistamina a poli(etileno glicol) metoxilado (MePEG) e depois a poli(lactida) (PLA). Por eletrofiação de misturas de poli(ε-caprolactona) (PCL) e LEse em várias razões, produzimos tapetes de nanofibra contendo PL. Esses tapetes foram revestidos em um stent biliar coberto por membrana de silicone. Liberação in vitro de fármaco, responsividade a ROS e atividade anticâncer foram avaliadas, seguido por estudo in vivo de xenoenxerto HuCC-T1.

Resultados

Nanofibras com maior teor de LEse exibiram aceleração da liberação de PL disparada por ROS, enquanto tapetes apenas de PCL mostraram responsividade mínima. PL liberado dos tapetes reteve potente citotoxicidade contra várias linhagens de células CCA, induziu geração de ROS e promoveu apoptose. Em camundongos portadores de tumor HuCC-T1, o stent elutante de PL inibiu significativamente o crescimento tumoral e aumentou expressão de caspase-3/9 comparado a controles.

Conclusão

Tapetes de nanofibra sensíveis a LEse convertem com sucesso um stent GI convencional em plataforma anticâncer localizada, responsiva a ROS. Esta estratégia oferece abordagem promissora e direcionada para tratar colangiocarcinoma irressecável.

Contexto

Colangiocarcinoma (CCA) origina-se do epitélio do ducto biliar e está entre as malignidades mais agressivas, com incidência crescente mundial. Como a maioria dos pacientes apresenta estágios avançados, ressecção cirúrgica raramente é viável, e terapias convencionais — radioterapia, quimioterapia sistêmica e stent metálico — oferecem benefício limitado. Colocação de stent é essencial para aliviar obstrução biliar, ainda stents metálicos carecem de propriedades curativas e são propensos a supercrescimento tumoral, motivando pesquisa em stents elutantes de fármaco (DES). Ensaios iniciais de DES usando paclitaxel, sorafenib e vorinostat demonstraram melhorias modestas em patência de stent e inibição tumoral, ainda efeito curativo permanece elusivo.

Nanomateriais responsivos a estímulos, particularmente sistemas sensíveis a ROS, emergiram como plataformas poderosas de entrega de fármacos para terapia do câncer. Ligações de disseleneto em polímeros degradam no microambiente tumoral oxidativo, disparando liberação rápida de fármaco. Piperlongumina (PL), um alcaloide natural de Piper longum, eleva seletivamente ROS em células cancerígenas, induzindo dano no DNA e apoptose enquanto poupa tecidos normais. Contudo, a rápida depuração sistêmica e toxicidade renal da PL necessitam entrega localizada.

Portanto, fabricamos um revestimento de nanofibra carregado de PL, responsivo a redox, para stent GI, aproveitando o meio ROS do tumor para alcançar liberação de fármaco sob demanda e potente atividade anticâncer.

Materiais e Métodos

Materiais

PL (LKT Labs, MN, EUA), PLA (PM ≈ 5 kDa, Wako), MePEG-NHS (PM ≈ 5 kDa, Sunbio), selenocistamina (Sigma-Aldrich), PCL (PM ≈ 80 kDa, Sigma-Aldrich) e outros reagentes eram de grau analítico. O stent biliar coberto por membrana de silicone (1 cm × 10 cm) foi obtido da M.I. Tech (Pyeongtaek, Coreia).

Síntese do Copolímero em Bloco LEse

MePEG-NHS foi reagido com excesso de selenocistamina em DMSO, seguido de diálise (PMCO 1 kDa) e liofilização. O MePEG-selenocistamina resultante foi então acoplado a PLA via química EDAC/NHS, resultando no copolímero em bloco LEse (rendimento > 94%). ¹H-RMN confirmou picos característicos a 1,7 ppm e 2,9 ppm (selenocistamina) e 3,5–3,7 ppm (MePEG). Análise GPC deu Mn ≈ 8,2 kDa e Mw ≈ 9,5 kDa.

Preparação de Tapetes de Nanofibra Carregados de PL e Revestimento do Stent

PL foi dissolvido em acetona (10 mg mL⁻¹). LEse (100–400 mg) e PCL (600–900 mg) foram adicionados, agitados por 2 h, e eletrofiados no stent (15 kV, 100 µL min⁻¹, 500 rpm). O stent revestido foi seco a vácuo por 24 h e armazenado a 4 °C.

Estudos de Carga e Liberação de Fármaco

Conteúdo de fármaco foi quantificado por UV-Vis a 325 nm após dissolver 5 mg de tapetes em DMSO. Liberação foi monitorada em PBS (0,01 M, pH 7,4) a 37 °C com e sem 10 mM H₂O₂. Amostras foram coletadas em intervalos predeterminados e analisadas por UV-Vis.

Cultura Celular e Ensaios Anticâncer

Linhagens humanas de CCA (SNU-478, SNU-245, SNU-1196, HuCC-T1) foram cultivadas em RPMI-1640 com 10% FBS. Células foram tratadas com PL, PL liberado (dia 5 ou 15), ou veículo por 48 h, e viabilidade avaliada via MTT. Valores IC₅₀ foram calculados.

Medição de ROS

Fluorescência DCFH-DA (485 nm/535 nm) quantificou ROS intracelular após 6–12 h de exposição a PL ou PL liberado.

Western Blotting

Células foram lisadas 24 h pós-tratamento, e extratos proteicos (50 µg) foram resolvidos por SDS-PAGE, transferidos para PVDF, e sondados para BAX, caspase-3/7/9 e PARP clivado. Bandas foram visualizadas por quimioluminescência e quantificadas com ImageJ.

Modelo de Xenoenxerto Tumor In Vivo

Camundongos nude BALB/c receberam células HuCC-T1 subcutâneas (1 × 10⁶ células). Quando tumores atingiram 4–5 mm, discos de nanofibra carregados de PL ou vazios (10 mg PL kg⁻¹) foram implantados sob o tumor. Volumes tumorais foram medidos a cada 5 dias, calculados como V = (a × b²)/2. Todos procedimentos foram aprovados pelo PNUIACUC (Aprovação No. PNU-2017-1608).

Imuno-histoquímica

Secções tumorais foram coradas para caspase-3 e caspase-9 usando protocolos padrão. Intensidade de coloração foi qualitativamente pontuada.

Análise Estatística

Dados foram analisados por teste t de Student; p < 0,05 considerado significativo.

Resultados

Caracterização do Polímero

O copolímero em bloco LEse foi sintetizado com sucesso, evidenciado por ¹H-RMN e GPC. Razões de mistura PCL para LEse foram variadas para otimizar morfologia de fibra e liberação de fármaco.

Morfologia de Nanofibra e Carga de Fármaco

Imagens de MEV-CE revelaram que PCL puro produziu fibras finas e uniformes, enquanto adição de LEse induziu granulações e irregularidades em cargas maiores (≥ 50% LEse). Tapetes ótimos (60% LEse) mantiveram morfologia de fibra aceitável e incorporaram PL em cargas teóricas (~10% p/p).

Liberação de Fármaco Responsiva a ROS

Liberação de PL foi sustentada por 25 dias, com fase de explosão até 4 dias. Composições de tapete com maior LEse aceleraram liberação, especialmente na presença de H₂O₂, confirmando sensibilidade a ROS. Tapetes apenas de PCL exibiram responsividade negligenciável.

Atividade Anticâncer In Vitro

PL liberado do dia 5 e dia 15 reteve citotoxicidade comparável a PL recém-dissolvido em todas linhagens CCA, com valores IC₅₀ apenas ligeiramente maiores. Ensaios de ROS mostraram que tanto PL quanto PL liberado induziram ROS intracelular significativo. Western blotting demonstrou regulação positiva de BAX, caspase-3/7/9 e PARP clivado, indicando indução de apoptose.

Eficácia In Vivo

No modelo de xenoenxerto HuCC-T1, stents carregados de PL reduziram volume tumoral a um terço dos controles e aumentaram expressão de caspase-3/9, enquanto stents vazios ou veículo não tiveram efeito.

Discussão

Os níveis elevados de ROS do microambiente tumoral tanto disparam apoptose induzida por PL quanto aceleram liberação das nanofibras ligadas a disseleneto, criando efeito terapêutico sinérgico e localizado. Esta ação dupla mitiga exposição sistêmica e aborda desafios de DES convencionais, que carecem de liberação direcionada a tumor.

Conclusão

Demonstramos que revestimento de nanofibra carregado de PL, responsivo a ROS, em stent GI entrega efetivamente terapia anticâncer a tumores de colangiocarcinoma in vitro e in vivo. Esta plataforma oferece estratégia promissora para tratamento local, controlado, de CCA irressecável.