Nanopartículas de sílica para entrega de proteína intracelular:uma nova abordagem de síntese usando proteína fluorescente verde

Resumo

Neste estudo, uma nova abordagem para a preparação de nanopartículas de sílica dopada com proteína fluorescente verde (GFP) com uma distribuição de tamanho estreita é apresentada. A GFP foi escolhida como proteína modelo devido à sua autofluorescência. Nanopartículas dopadas com proteínas têm um alto potencial de aplicação no campo da entrega intracelular de proteínas. Além disso, as partículas marcadas com fluorescência podem ser usadas para bioimagem. O tamanho dessas nanopartículas dopadas com proteína foi ajustado de 15 a 35 nm usando um processo de síntese de várias etapas, compreendendo a síntese do núcleo da partícula seguida por etapas de regeneração da casca. A GFP foi incorporada seletivamente na matriz de sílica do núcleo ou da casca ou ambos por uma reação em um único recipiente. As nanopartículas obtidas foram caracterizadas por determinação do tamanho de partícula, diâmetro hidrodinâmico, potencial ζ, fluorescência e rendimento quântico. As medições mostraram que a fluorescência de GFP foi mantida durante a síntese de partículas. Experimentos de captação celular demonstraram que as nanopartículas dopadas com GFP podem ser usadas como sondas fluorescentes estáveis ​​e eficazes. O estudo revela o potencial da abordagem escolhida para a incorporação de macromoléculas biológicas funcionais em nanopartículas de sílica, o que abre novos campos de aplicação como entrega de proteína intracelular.

Histórico

Nos últimos anos, o encapsulamento de proteínas em micro e nanopartículas ganhou grande atenção devido ao amplo potencial de aplicação de materiais como biossensores [1] ou biorreatores [2], e ainda nos campos de entrega controlada de proteínas [3], entrega de proteína intracelular [4] e engenharia de tecidos [5]. Em muitas dessas aplicações, a atividade catalítica de enzimas encapsuladas é uma função básica de tais materiais. Em contraste, proteínas farmaceuticamente relevantes, hormônios peptídicos ou anticorpos como carga potencial de tais nanomateriais exercem sua função por ligação específica de alvos dentro de tecidos ou células. Portanto, um pré-requisito de todas essas aplicações é a manutenção de uma conformação e funcionalidade intactas das proteínas de carga. Os sistemas nanoestruturados se tornaram uma das áreas de desenvolvimento mais rápido na pesquisa biomédica, devido ao seu pequeno tamanho, grande área de superfície específica e outras propriedades únicas [6]. Portanto, o desenvolvimento de novos portadores de partículas para melhorar a funcionalidade e estabilidade dos sistemas projetados é um tópico importante na área [7]. A matriz de carreadores nanoparticulados pode ser baseada em componentes biomacromoleculares ou orgânicos como carboidratos, lipídios ou polímeros, formando sistemas como nanopartículas lipídicas sólidas, lipossomas ou dendrímeros. Além disso, sistemas nanoestruturados também podem ser baseados em materiais inorgânicos como metais ou óxidos [8]. Todos esses sistemas de materiais devem atender a vários requisitos comuns e também específicos. Em primeiro lugar, os materiais da matriz devem ser biocompatíveis para facilitar aplicações seguras [9]. Em segundo lugar, eles devem ser estáveis ​​o suficiente para cumprir sua função como materiais portadores ao longo do ciclo de vida dos sistemas. Além disso, eles devem fornecer a capacidade de carga e retenção significativa de proteína, bem como de liberação controlada de proteína [10].

Além da fixação de proteínas à superfície de nanoobjetos por meio de adsorção ou ligação covalente [11], as proteínas podem ser aprisionadas em nanoestruturas, aumentando assim sua estabilidade e atividade enzimática [2]. O nanoentrapment pode ser alcançado por hidrólise e condensação de um precursor de sílica via processamento sol-gel [12] ou via microemulsão de água em óleo, causando polimerização da enzima que circunda a casca na interface água-óleo [13]. Nestes métodos, o aprisionamento de proteínas pode ocorrer por duas abordagens químicas diferentes, usando processos de ligação covalente ou não covalente [14]. Em particular, o dióxido de silício amorfo é um material carreador promissor para proteínas, devido à sua alta biocompatibilidade, inércia e estabilidade mecânica [15]. Várias rotas, especialmente abordagens biomiméticas para encapsulação de enzima em dióxido de silício, têm sido seguidas [2, 16], em que o perfil de liberação das enzimas é controlado por reações químicas do ligante ou a degradação da matriz de sílica. Materiais mesoporosos também têm sido usados ​​como matriz para imobilizar enzimas dentro de poros de 2–50 nm [13, 17]. A liberação de carga de nanopartículas mesoporosas pode ser ajustada usando a estratégia de "porteiro" ou modificando a superfície interna dos poros para controlar a afinidade de ligação com drogas [10b]. No entanto, o tamanho do poro pode limitar o carregamento de enzimas nos andaimes de sílica mesoporosa realizados [18], razão pela qual novas estratégias estão recentemente sob investigação para entrega de proteínas.

Como as nanopartículas de sílica são amplamente utilizadas para bioimagem [19], a incorporação de proteínas fluorescentes constitui uma opção para a geração de sondas fluorescentes biocompatíveis. Por exemplo, a incorporação de proteína fluorescente verde (GFP) em nanopartículas de sílica por meio de técnicas de emulsão reversa foi descrita na literatura [20]. Esses estudos indicam que a incorporação de GFP na matriz de partículas de sílica não só aumenta a intensidade de fluorescência da proteína, mas também sua estabilidade térmica, estabilidade contra desnaturação química e tratamento com protease. No entanto, o método é menos adequado para a síntese de nanopartículas de sílica bem definidas na faixa nanoescala inferior com uma distribuição de tamanho estreita. Além disso, as condições de síntese incluem contato com surfactantes, álcoois ou bases alcalinas altas, bem como altas temperaturas que podem não ser compatíveis com a incorporação de proteínas suscetíveis [20, 21].

Portanto, relatamos uma nova abordagem para a preparação de nanopartículas de sílica dopada com proteína, usando GFP como uma proteína modelo. Para tanto, foi utilizada uma síntese em um único vaso em condições de síntese moderadas (temperatura ambiente, baixa salinidade) seguida de etapas de diálise para purificação. A abordagem é caracterizada por seu potencial para preparar nanopartículas de sílica aprisionadas em proteína exibindo uma distribuição de tamanho estreita no regime de tamanho abaixo de 50 nm.

Métodos

Materiais

Todos os produtos químicos foram usados ​​como adquiridos da Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) e sem purificação adicional. Para todas as etapas de síntese e purificação, foi usada água ultrapura (18,2 MΩ, sistema de purificação de água Milli-Q tipo ELIX 20, Millipore Corp., EUA).

Preparação de GFP

GFP foi obtido por expressão de proteína e purificação subsequente, conforme descrito em outro lugar [22]. Resumidamente, GFP incluindo uma etiqueta His6 N-terminal foi expressa usando um vetor de expressão bacteriana de alto nível com base no sistema de vetor pQE (Qiagen, Hilden, Alemanha) em E. coli XL1-Blue e purificado por cromatografia de afinidade com carga de Ni (Qiagen, Hilden, Alemanha). Posteriormente, a proteína foi transferida para um dispositivo concentrador (membrana de corte de peso molecular de 3 kDa (MWCO), Pall, Dreieich, Alemanha) para troca de tampão. O GFP foi lavado três vezes pela adição de 15 mL de solução de ʟ-arginina e bicarbonato de sódio, respectivamente, e subsequentemente recuperado em 3 mL da solução de ʟ-arginina / bicarbonato de sódio. Depois disso, a suspensão de GFP foi filtrada em tubos estéreis por meio de filtros de acetato de celulose de 0,22 μm estéreis (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha). Antes do uso, a concentração de proteína foi ajustada para 1 mg mL ⁻¹ em 7,2 mmol L ⁻¹ ʟ-arginina (pH =10,3) ou 10,0 mmol L ⁻¹ NaHCO ₃ (pH =9,2) solução.

Síntese e purificação de nanopartículas

Nanopartículas de sílica foram preparadas de acordo com um protocolo modificado descrito anteriormente [23]. Resumidamente, o tetraetoxissilano (TEOS), usado como precursor não polar, foi hidrolisado em um sistema bifásico de água / ciclohexano mediado por catálise de ʟ-arginina.

Preparação de partículas centrais

Em um balão de fundo redondo de três gargalos, 91 mg (0,52 mmol) de ʟ-arginina foi dissolvido em 69 mL de água, antes de 4,5 mL de ciclohexano serem adicionados como camada superior. A mistura reaccional foi aquecida a 40 ° C sob agitação. Após adição de 5,5 mL (24,63 mmol) de TEOS, a mistura foi mantida nestas condições por mais 20 h.

Camadas de Silica Shell

Para as etapas de crescimento de casca subsequentes, foram usadas as partículas de núcleo ou partículas resultantes da primeira etapa de crescimento de casca. Para o crescimento da casca, 14 mg (0,08 mmol) de ʟ-arginina foram dissolvidos em 36 mL de água e foram adicionados 10 mL de dispersões de partículas previamente preparadas. Após adição de 5 mL de ciclohexano, a mistura foi aquecida a 40 ° C. Após adição de 3,52 mL (15,8 mmol) de TEOS, a mistura foi agitada por mais 20 h.

Preparação de nanopartículas dopadas com GFP. Para a preparação de nanopartículas dopadas com GFP, 30 min após a adição de TEOS, 200 μg (6,9 nmol) de GFP foram adicionados.

Purificação de Partículas

As nanopartículas foram purificadas por diálise subsequente contra água (4 L, troca de água após 30, 90 e 180 min) por 4 h usando uma membrana de hidrato de celulose (tubo de diálise Nadir, MWCO 10 kDa, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha). Finalmente, as nanopartículas foram filtradas em frascos estéreis usando filtros de membrana de acetato de celulose de 0,22 µm estéreis (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha).

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

A morfologia e o diâmetro médio das partículas foram determinados usando um microscópio JEM-2100F (JEOL, Freising, Germany). A distribuição do tamanho de partícula foi determinada em uma amostra aleatória de 50 nanopartículas usando o software X-ImageJ (Versão:1.45 s, winPenPack X-ImageJ Launcher do National Institute of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij /).

Diâmetro hidrodinâmico

O diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas foi registrado usando um Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments, Herrenberg, Alemanha). Antes das medições, as dispersões de partículas foram diluídas 1:10 em água. As medições foram realizadas a 25 ° C. Cada amostra foi medida 3 × 15 vezes. O diâmetro foi determinado pelo cálculo da distribuição do volume. Isso foi convertido da distribuição de tamanho de intensidade usando a teoria de Mie.

ζ-potencial

O potencial ζ foi medido usando o mesmo instrumento com as condições descritas acima, exceto que as amostras foram diluídas em 0,01 M KCl (9:1).

Ultracentrifugação Analítica (AUC)

Para medir a velocidade de sedimentação, um Beckman-Coulter XL-80 K modificado com rotor aAnTi60. Para os experimentos, a temperatura foi fixada em 20 ° C, a velocidade foi fixada em 10.000 rpm e 21 varreduras foram feitas. Os comprimentos de onda foram definidos em 261 nm para sílica e 488 nm para detecção de GFP.

Espectroscopia de fluorescência

Os espectros de fluorescência de nanopartículas, GFP puro e filtrados de experimentos de lixiviação foram registrados usando o espectrofluorômetro Fluoromax-3 (Spex, Horiba Scientific, Oberursel, Germany). Para medições, GFP puro, dispersões de partículas e filtrado foram diluídos 1:10 em água. O comprimento de onda de excitação foi ajustado para 488 nm, e o espectro foi registrado em uma faixa espectral de 498 a 800 nm.

Rendimentos quânticos de fluorescência

Rendimentos quânticos das nanopartículas obtidas e GFP puro foram determinados usando o método relativo de Williamson et al. [24]. Como referência para GFP, rodamina 6G e Atto488 foram usados. As medições comparativas foram feitas usando nanopartículas não dopadas que foram misturadas com o corante de referência. Os espectros de fluorescência foram registrados usando um comprimento de onda de excitação de 450 nm. Medições adicionais de UV / vis foram feitas usando um Varian Cary 300 Scan UV (Agilent Technologies, Darmstadt, Alemanha).

Para o cálculo do rendimento quântico, a Eq. 2 foi usado.
$$ {\ varPhi} _P ={\ varPhi} _S \ bullet \ frac {{\ mathrm {declive}} _ S} {{\ mathrm {declive}} _ P} \ bullet {\ left (\ frac {n_P} {n_S } \ right)} ^ 2 $$ (2)
Aqui, φ _P é o rendimento quântico do produto, φ _S o rendimento quântico da referência. Os termos inclinação _S e declive _P representam os declives derivados dos gráficos de intensidade de fluorescência integrada vs. absorbância de referência e produto, respectivamente. n _P e n _S correspondem ao índice de refração do solvente usado [25].

Vazamento de Proteína

Para experiências de lixiviação, dispersões de partículas não diluídas foram ultrafiltradas através de membranas de poliéter sulfona modificadas (MWCO =100 kDa ou 300 kDa, Pall, Dreieich, Alemanha) por centrifugação (16.000 g, 5 min).

Estabilidade térmica

Para análise de estabilidade térmica, nanopartículas e GFP puro foram mantidos por 0 e 24 h a 20 ou 60 ° C. Nanopartículas e GFP puro foram diluídos conforme descrito acima.

Fotodegradação

Para investigar a estabilidade de nanopartículas dopadas com GFP e GFP puro contra fotobranqueamento, as soluções foram expostas à luz emitida por sete LEDs verdes durante um período de tempo de até 20 min. A intensidade de fluorescência de amostras tomadas em t =0, 2 e 20 min.

Estabilidade contra a degradação de proteínas

Para determinar a estabilidade de GFP contra proteinase K, o GFP puro, nanopartículas de sílica não marcadas (C _U S _1U S _2U ) com GFP adicional e nanopartículas de sílica rotuladas três vezes (C _F S _1F S _2F ) foram usados ​​nas mesmas concentrações de GFP e na mesma quantidade de partículas. Todas as amostras foram diluídas 1:100. Para a quantidade de 10 moléculas de GFP, uma molécula de proteinase K foi escolhida. Antes da adição da enzima, uma amostra foi medida com as condições acima. Após a adição, as medições foram feitas após t =0, 15, 30, 45, 60 e 90 min.

Experimentos de captação celular

Para determinar a internalização de nanopartículas e GFP por células, experimentos de absorção celular foram realizados usando a linha de células de carcinoma de pulmão A549 (ACC-107).

Cultivo de células

Células A549 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram cultivadas em frascos T75 (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha) usando Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, MA, EUA) contendo 10% de feto soro de bezerro (FCS). 2 × 10 ⁴ cm ⁻² As células A549 foram semeadas em lamelas em placas de 12 poços e foram cultivadas por 24 h. As células foram então tratadas com nanopartículas dopadas com GFP e solução de GFP em 1 mL de meio por 24 h. O SiO ₂ a concentração das nanopartículas foi de 37 μg mL ⁻¹ enquanto a concentração de GFP era de 5 μg mL ⁻¹ para nanopartículas e GFP puro. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Preparação de amostra e imagem confocal

As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente. Para a coloração da membrana celular, WGA conjugado com tetrametilrodamina (aglutinina de gérmen de trigo (2 μg mL ⁻¹ (em PBS), W849, Thermo-Fisher-Scientific (Invitrogen), Waltham, MA, EUA) foi adicionado e incubado por 10 min em temperatura ambiente. Após três etapas de lavagem com PBS, as células foram lavadas triplamente com PBS e montadas em lâminas de vidro com Mowiol / DABCO (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha).

Imagens confocais foram obtidas em um sistema TCS SP5 (Leica, Wetzlar, Alemanha). Para imagens, uma objetiva de imersão em óleo 63 × ( n =1,518) foi usado. Varreduras sequenciais foram feitas usando a linha de laser de íon de argônio em λ =488 nm (25%) para excitação de GFP, e um laser de estado sólido bombeado por diodo em λ =561 nm (25%) para excitação de tetrametilrodamina.

Resultados e discussão

Este estudo visa funcionalizar nanopartículas de sílica com GFP em condições adequadas que mantenham as características bioquímicas e a funcionalidade da proteína. Em trabalho anterior, sintetizamos nanopartículas de sílica fluorescentes monodispersas dopadas com corante de infravermelho no intervalo de tamanho entre 15 e 80 nm, usando uma hidrólise controlada de ʟ-arginina de tetraetoxisilano (TEOS) em um sistema bifásico de ciclohexano / água [26]. Aqui, adotamos este procedimento de síntese para incorporar GFP, como uma proteína modelo, na matriz de sílica. No Esquema 1, o procedimento para a síntese de partículas é representado esquematicamente. Estruturas dopadas e não dopadas com GFP (núcleo / cascas) são destacadas em verde e cinza, respectivamente. Em uma primeira etapa, partículas de núcleo de sílica dopadas com GFP (C _F ) foram obtidos. Etapas de regeneração subsequentes (C _F S ₁ e C _F S ₁ S ₂ ) permitiu a síntese de tamanhos de partículas maiores. Durante a primeira etapa de regeneração, a casca foi modificada com (C _F S _1F ) ou sem (C _F S _1U ) incorporação de proteínas. Da mesma forma, na segunda etapa de regeneração, um rotulado (C _F S _1F S _2F , C _F S _1U S _2F ) ou um não rotulado (C _F S _1F S _2U , C _F S _1U S _2U ) shell foi adicionado. Essas variações permitem um excelente controle sobre a quantidade de proteína incorporada e seu arranjo sob medida em cascas designadas ou no núcleo da partícula. Além disso, nanopartículas de sílica pura sem qualquer GFP incorporado (C _U , C _U S _1U , e C _U S _1U S _2U ) foram sintetizados para investigar uma influência potencial da incorporação da proteína nas propriedades das partículas. Além disso, para todas essas etapas, o GFP foi dissolvido em dois sistemas tampão diferentes (ʟ-arginina e NaHCO ₃ ) de vários valores de pH, para determinar a influência do solvente de proteína na síntese de partículas, a morfologia, a intensidade de fluorescência, o comprimento de onda de emissão e o potencial ζ.

Visão geral das partículas sintetizadas e sua estrutura de partícula. A cor verde indica a incorporação de GFP no núcleo ou nas cascas, respectivamente. A cor cinza está representando as conchas sem qualquer GFP (C _F =Núcleo fluorescente, C _U =Núcleo sem etiqueta, S _F =Casco fluorescente, S _U =Shell sem etiqueta, S ₁ =Primeira camada de casca, S ₂ =Segunda camada de casca)

Caracterização de nanopartículas

Determinação de atributos físicos de partículas

Para descrever o tamanho e a morfologia das partículas após a incorporação de GFP e para determinar a influência dos dois sistemas tampão diferentes sobre essas propriedades, imagens TEM foram registradas (Fig. 1). Outras imagens TEM de GFP (NaHCO ₃ ) nanopartículas modificadas, GFP (ʟ-arginina) modificadas e não marcadas são apresentadas no SI (Arquivo adicional 1:Figura S1, Arquivo adicional 2:Figura S2, Arquivo adicional 3:Figura S3, Arquivo adicional 4:Figura S4). Seguindo o procedimento de síntese com duas etapas de regeneração, três tamanhos de partícula diferentes foram obtidos. As partículas do núcleo tinham um tamanho de cerca de 15 nm, as partículas após a primeira etapa de regeneração cerca de 22 nm e as partículas após a segunda etapa cerca de 32 nm. Em resumo, todas as nanopartículas eram aproximadamente esféricas e exibiam uma distribuição de tamanho estreita ( p <10%). As três gerações de nanopartículas de GFP (ʟ-arginina) totalmente tingidas (C _F , C _F S _1F , e C _F S _1F S _2F ) e o GFP (NaHCO ₃ ) (C _F ) nanopartículas de núcleo foram escolhidas como modelo.

Imagens TEM de três gerações de nanopartículas modificadas com GFP-ʟ-arginina e partículas centrais de GFP (NaHCO ₃ ) nanopartículas modificadas. Em a , c e d , as três gerações de GFP (ʟ-arginina) são mostradas:C _F partículas do núcleo ( a , d _TEM =15,5 ± 1,1 nm); C _F S _1F nanopartículas após a primeira etapa de regeneração (núcleo + casca 1) ( c , d _TEM =23,5 ± 2,0 nm) e C _F S _1F S _2F após a segunda etapa de regeneração (núcleo + casca 1 + casca 2) ( d , d _TEM =35,3 ± 2,0 nm). Em b , o GFP (NaHCO ₃ ) nanopartículas de núcleo marcadas (d _TEM =15,2 ± 1,2 nm) são mostrados

Comparando os tamanhos das diferentes nanopartículas dopadas e não marcadas com GFP (Tabela 1), é digno de nota que o mesmo número de etapas de regeneração resultou no mesmo tamanho médio de partícula, independentemente da presença de proteína ou da solução tampão usada. As partículas não marcadas também tinham tamanhos semelhantes (C _U :d _TEM =13,4 ± 0,4 nm, d _DLS =10 ± 3 nm; C _U S _1U :d _TEM =20,9 ± 1,3 nm, d _DLS =20 ± 6 nm; C _U S _1U S _2U :d _TEM =33,2 ± 1,0 nm, d _DLS =38 ± 10 nm).

Em conclusão, foi demonstrado que a incorporação da proteína na matriz de sílica e na solução tampão, na qual a proteína foi fornecida, não teve influência significativa no tamanho e morfologia das partículas resultantes.

Até onde sabemos, não há outras nanopartículas de sílica incorporadas em GFP descritas na literatura, exibindo tamanhos pequenos semelhantes, bem como distribuições de tamanho igualmente estreitas (<10%) [20, 27]. Essas pequenas nanopartículas apresentam um potencial de aplicação promissor no campo da entrega de proteínas intracelulares, bem como no diagnóstico e terapia de câncer [28].

ζ-Potencial

O potencial ζ de todas as nanopartículas foi determinado através de cálculos usando sua mobilidade eletroforética. Todos os tipos de nanopartículas dopadas exibiram um potencial ζ negativo com valores absolutos variando de -28 a -36 mV (Fig. 2). Em comparação, o potencial ζ de partículas não marcadas indica valores muito semelhantes com - 35,5 ± 2,0 mV para as partículas do núcleo, - 34,0 ± 3,7 mV após a primeira etapa de rebrota e - 34,5 ± 1,2 mV após a segunda etapa de rebrota. Esses valores de potencial ζ altamente negativos (<- 28 mV) indicam uma alta estabilidade das nanopartículas contra a aglomeração devido à repulsão eletrostática. Em comparação com o potencial ζ de nanopartículas não marcadas, os dados indicam que nem o tamanho de partícula resultante, nem a incorporação de GFP na matriz de partícula de qualquer núcleo de partícula ou casca teve uma influência significativa na carga da partícula.

potencial ζ [mV] de nanopartículas marcadas. As nanopartículas foram preparadas a partir de GFP dissolvido em ʟ-arginina 7,2 mM ou NaHCO 10 mM ₃ . Barras de erro indicam o desvio padrão derivado de três medições

Estudos de Espectroscopia

Espectroscopia de fluorescência

Todas as nanopartículas de sílica dopada com GFP exibiram um máximo de emissão semelhante ( λ _em =508 nm), que também foi comparável ao máximo de emissão de GFP livre (SI, arquivo adicional 5:Figura S5). Para comparar a intensidade de fluorescência das várias nanopartículas marcadas, a concentração de nanopartículas foi normalizada (cálculos em SI 5). Como esperado, a adição gradual de conchas marcadas causou um aumento na fluorescência das nanopartículas (Fig. 3).

Intensidade de fluorescência normalizada do máximo de emissão a 508 nm, para cada um dos vários sistemas de partículas. Além disso, a intensidade teórica de fluorescência ( pontos cinza ) das partículas em relação ao aumento do volume das partículas é mostrado

Nanopartículas com um núcleo marcado apenas, mas com conchas não dopadas, exibiram a fluorescência mais baixa. Nanopartículas com uma casca marcada adicional exibiram uma fluorescência intermediária, e nanopartículas com duas cascas marcadas mostraram a fluorescência mais forte (Fig. 3). Notavelmente, a adição de um invólucro externo não dopado pareceu reduzir ligeiramente a fluorescência das nanopartículas em comparação com as nanopartículas que possuem uma camada externa dopada. Este efeito pode ser provocado pelos efeitos de proteção da concha de sílica não marcada. Em resumo, a adição de conchas dopadas com GFP às partículas do núcleo causou um aumento na intensidade de fluorescência das nanopartículas resultantes que pareciam estar correlacionadas com a mudança de volume que acompanha o crescimento das nanopartículas.

A incorporação de GFP inicialmente dissolvida em ʟ-arginina após a purificação resultou em uma intensidade de fluorescência 1,3 vezes maior das nanopartículas resultantes em comparação com as nanopartículas obtidas por meio do processo de incorporação analógica a partir de GFP dissolvido em NaHCO ₃ . Da mesma forma, GFP diluído em ʟ-arginina exibiu uma maior intensidade de fluorescência em comparação com GFP diluído em NaHCO ₃ (Arquivo adicional 5:Figura S5). O efeito pode ser explicado pelos diferentes valores de pH dos tampões (pH _ʟ-arginina =10,3, pH \ (_ {{\ mathrm {NaHCO}} _ 3} \) =9,2).

Por esta razão, a fluorescência do GFP puro foi medido sistematicamente como uma função do valor de pH (SI, arquivo adicional 6:Figura S6). Os dados mostraram um aumento de forma hiperbólica da fluorescência com o aumento do pH na faixa de pH 5,5 - 10,5. Os resultados são consistentes com outros relatórios sobre fluorescência de GFP dependente do pH. Para GFP de tipo selvagem, foi relatado que a fluorescência é inalterada na faixa de pH 6 - 10, mas diminui em pH mais baixo e aumenta em valores de pH> 10 [29]. Além disso, a sensibilidade ao pH da GFP pode ser modificada pela introdução de mutações pontuais [30]. O GFP usado neste estudo possui mutações de três pontos em comparação com o Aequorea proteína de tipo selvagem, nomeadamente S2A, F64L, S65T. Destes, a substituição da serina na posição 65 por treonina mostrou aumentar a intensidade de fluorescência da proteína, quando excitada a 480 nm, uma vez que esse aminoácido está envolvido na formação do cromóforo. Além disso, a variante S65T / F64L exibe uma fluorescência dependente do pH [30]. As nanopartículas dopadas com GFP (C _F ) exibiram uma fluorescência dependente do pH comparável (Fig. 3), indicando que o mecanismo de dependência do pH não foi afetado pelo processo de incorporação.

Rendimento quântico de fluorescência

A fim de caracterizar ainda mais as propriedades das nanopartículas fluorescentes, seus rendimentos quânticos foram determinados. Isso foi conseguido traçando a intensidade de fluorescência integrada versus a absorvância a 488 nm (Fig. 4). Posteriormente, os rendimentos quânticos foram calculados usando a Eq. 2. Usando rodamina 6G como referência, os rendimentos quânticos das nanopartículas dopadas com GFP C _F S _1F e o GFP puro foi determinado ser φ \ (_ {{\ mathrm {C}} _ ​​{\ mathrm {F}} {\ mathrm {S}} _ {1 \ mathrm {F}}} \) =0,62 e φ _pureGFP =0,38, respectivamente. Os resultados foram confirmados usando Atto488 como uma segunda referência (SI, arquivo adicional 7:Figura S7). O maior rendimento quântico de nanopartículas dopadas com GFP em comparação com o GFP puro parecia ser causado pelo encapsulamento de GFP na matriz de sílica e poderia estar ligado à imobilização espacial da proteína ou ao ambiente químico alterado fornecido pela matriz de sílica .

Gráficos de intensidade de fluorescência integrada de partículas dopadas com GFP e GFP puro versus absorbância a 488 nm. Rodamina 6G foi usada como referência. A correlação linear foi ajustada pelas linhas retas . As equações lineares correspondentes são as seguintes: y _pureGFP =1,00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² =0,97712; y \ (_ {C_F {S} _ {1F}} \) =6,12332 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99331; y _rhodamin6G =4,1772 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99678

Estabilidade de partícula

Vazamento de proteína

Os experimentos de lixiviação foram realizados para provar a estabilidade de ligação das nanopartículas dopadas com GFP. Após a ultrafiltração através de membranas com um MWCO que permite a passagem de GFP (MW ~ 27 kDa), mas retém nanopartículas, nenhuma fluorescência pode ser detectada no filtrado, indicando um acoplamento permanente de GFP à matriz de sílica.

Ultracentrifugação analítica

Para apoiar os resultados obtidos e determinar o tipo de ligação GFP à matriz de partículas, foi realizada ultracentrifugação analítica. Para este propósito, denominado C _F S _1F S _2F partículas e C não rotulado _U S _1U S _2U as partículas misturadas com GFP foram medidas nas mesmas concentrações de partículas e GFP. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ) For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ) The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F particles. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ) Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.

Conclusions

In this study, a novel approach is presented for synthesis of monodisperse GFP-doped silica nanoparticles with a mean particle-core size of 15 nm. By subsequent growth steps, the particle size and the amount of embedded GFP can be varied. At the end of this procedure, the fluorescence properties of GFP are kept. Incorporation of GFP into additional outer shells results in an increase in the nanoparticle fluorescence. Coverage of the nanoparticles by non-doped shells seems to slightly decrease their fluorescence. These properties indicate the potential to incorporate cargo molecules into specific particle shells. The GFP-doped nanoparticles exhibit a higher quantum yield as compared to the pure GFP. The incorporation into the silica matrix appeared to be durable, as no leaching of protein was detected by ultrafiltration. The silica matrix also seems to improve the thermal properties and photostability of the protein. Furthermore, it is possible to encapsulate different proteins in the different shells, in order to prepare multifunctional nano-carriers. Finally, the nanoparticles are applicable for intracellular delivery of their cargo. The incorporation of proteins into the particle matrix seems to increase delivery and reduce lysosomal degradation of the cargo. Therefore, the protein-doped silica nanoparticles constitute a promising novel tool for biomedical applications of nanoparticles, especially in the field of intracellular delivery of macromolecules.

Abreviações

AUC:

Analytical ultracentrifuge

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

FCS:

Foetal calf serum

GFP:

Green fluorescent protein

MW:

Molecular weight

MWCO:

Molecular weight cut off membrane

PBS:

Phosphate buffered saline

r.t.:

Room temperature

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

TEOS:

Tetraethoxysilane

Eletrodo de porta de prata impresso a jato de tinta curado por UV com baixa resistividade elétrica Fabricação de fossos em nanoescala com alto rendimento em filme fino de polímero usando litografia de aragem dinâmica baseada em ponta de AFM