Toxicidade de Nanopartículas em Biomedicina: Impacto das Espécies Reativas de Oxigênio

Resumo

As características físico-químicas únicas de nanopartículas ganharam recentemente atenção crescente em um conjunto diversificado de aplicações, particularmente no campo biomédico. No entanto, preocupações sobre os potenciais efeitos toxicologicos de nanopartículas permanecem, pois elas têm maior tendência a gerar quantidades excessivas de espécies reativas de oxigênio (ROS). Devido ao forte potencial de oxidação, o excesso de ROS induzido por nanopartículas pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas de organelas e levar a carbonilação oxidativa de proteínas, peroxidação lipídica, quebra de DNA/RNA e destruição da estrutura da membrana, que further causam necrose, apoptose ou até mutagênese. Esta revisão visa dar um resumo dos mecanismos responsáveis pela geração de ROS por nanopartículas no nível celular e fornecer insights sobre a mecânica da biotoxicidade mediada por ROS. Resumimos a literatura sobre toxicidade de nanopartículas e sugerimos estratégias para otimizar nanopartículas para aplicações biomédicas.

Introdução

Nanopartículas (NPs) são uma classe de partículas sintéticas inovadoras com dimensões < 100 nm. Dependendo de sua forma e tamanho, as distintas características físicas e químicas dão às NPs diferentes funções. NPs são amplamente usadas em muitos produtos de consumo, incluindo têxteis, cosméticos, purificação de água e embalagens de alimentos. Elas também são usadas na engenharia de fotocatalisadores, energia e optoeletrônica.

Em particular, NPs tornaram-se material favorecido em materiais biomédicos e são amplamente usadas em biossensores, entrega de siRNAs, silenciamento gênico direcionado, entrega de fármacos e em materiais médicos de bio-preenchimento. Novos usos de NPs ainda estão sendo descobertos. Por exemplo, Duan et al. mostraram que nanossondas Fe₃O₄-polietileno glicol-poliamida-amina-metaloproteinase2@ clorina e6 (Fe₃O₄-PEG-G5-MMP2@Ce6) inibiram significativamente o crescimento de tumor gástrico. Em outro caso, nanopartículas pDNA-polietilenimina CeO (pDNA-PEI-CeO NPs) puderam induzir mais apoptose de células de fibrossarcoma. Além disso, nanopartículas de sílica oca-Fe-polietileno glicol-receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HS-Fe-PEG-HER2 NPs) puderam ligar seletivamente células tumorais e foram usadas como agentes de imagem para distinguir tecido normal de células cancerosas. Finalmente, nanopartículas de prata (Ag NPs) servem como nano-antibióticos, que combatem eficientemente infecções associadas a biofilmes bacterianos resistentes.

Apesar do potencial para aplicações positivas de NPs em vários campos, um número crescente de estudos indicou seus efeitos adversos em organismos e células após exposição a NPs. O potencial tóxico de NPs depende de seu tamanho e forma, que determinam sua propensão a induzir geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). A geração excessiva de ROS pode induzir uma série de desfechos fisiopatológicos, incluindo genotoxicidade, apoptose, necrose, inflamação, fibrose, metaplasia, hipertrofia e carcinogênese. A toxicidade de NPs também demonstrou aumentar a expressão de citocinas pró-inflamatórias e ativar células inflamatórias, como macrófagos, que further aumentam a geração de ROS. A geração aumentada de ROS após exposição a NPs também demonstrou induzir modulação de funções celulares, com resultados fatais em alguns casos. Nesta revisão, discutimos os principais mecanismos subjacentes aos surtos de ROS induzidos por NPs, analisamos as razões primárias para a citotoxicidade de NPs e resumimos os potenciais efeitos patogênicos de NPs. Nossa revisão atual fornece evidências esmagadoras de que a superprodução de ROS é a principal causa da biotoxicidade de NPs. Portanto, pesquisas novas devem visar reduzir a citotoxicidade de NPs projetando NPs que induzam baixa produção de ROS.

A Aplicação de NPs no Campo Biomédico

NPs têm sido usadas em uma variedade de aplicações médicas, e várias NPs novas exibem propriedades promissoras para seu uso em novos materiais biomédicos. Conforme resumido na Tabela 1, Nano-C60 pode ser usado como agente anticancerígeno, que inibe proliferação de células cancerígenas, tanto in vivo quanto in vitro. NPs de ZnO têm sido usadas como preenchedores em implantes ortopédicos e dentários. TiO₂ pode ser usado como agentes antibacterianos, em purificação de ar e água, e para próteses dentárias. Davaeifar et al. relataram que nanobastão de ficocianina-ZnO pôde proteger a célula diminuindo geração endógena de ROS. Pacurari et al. apontaram que SWCNTs poderiam ser aplicados como agente diagnóstico clínico e como materiais de bioengenharia. Além disso, numerosas NPs podem ser usadas como agentes antimicrobianos, que matam bactérias induzindo surtos de ROS (Tabela 1).

Os Mecanismos de Aumento de ROS Induzidos por NPs em Células

ROS são partículas quimicamente reativas que contêm oxigênio, incluindo peróxido de hidrogênio (H₂O₂), ânions superóxido reativos (O₂⁻) e radicais hidroxila (•OH). ROS são predominantemente gerados em organelas como retículo endoplasmático (RE), em peroxissomos e, mais notavelmente, nas mitocôndrias. Durante fosforilação oxidativa, oxigênio é usado para síntese de água pela adição de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (CTE). Alguns destes elétrons são aceitos por oxigênio molecular para formar O₂⁻, que pode further transformar H₂O₂ e •OH.

Em contexto fisiológico, ROS são produzidos como resposta natural ao metabolismo normal de oxigênio e servem papel vital em várias vias de sinalização celular. Dröge e Holmstrom et al. relataram que ROS poderiam ativar numerosas cascatas de sinalização, incluindo receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF), cascatas da quinase ativada por mitógeno (MAPK), fator de transcrição proteína ativadora-1 (AP-1) e fator nuclear-κB (NF-κB), e further participaram no processo de crescimento, proliferação e diferenciação de mamíferos. Estudos further mostraram que ROS também regulam reparo de feridas, sobrevivência após hipóxia, homeostase de pH intracelular e imunidade inata.

No entanto, após exposição a NPs, a geração intracelular de ROS pode aumentar acentuadamente induzindo surtos de ROS em células (Tabela 1). As principais explicações mecanísticas para surtos de ROS são que íons metálicos liberados por NPs promovem superexpressão de ROS prejudicando a respiração mitocondrial.

Íons metálicos liberados por NPs demonstraram entrar em ciclagem redox e quimiocatálise via reação de Fenton [H₂O₂ + Fe²⁺ → Fe³⁺ + HO⁻ + •OH] ou reação tipo Fenton [Ag⁺ H₂O₂+H⁺ = Ag⁺ + •OH + H₂O]. O íon metálico dissociado (ex.: Ag⁺) também causa desativação enzimática celular, disrupção da estrutura da membrana, processo de transporte de elétrons perturbado, níveis de potencial redox depletados, potenciais de membrana mitocondrial (MMP) reduzidos e further aumenta o acúmulo intracelular de ROS. NPs também foram relatadas para promover acúmulo intracelular de ROS perturbando o processo de transferência de elétrons, aumentando a razão NADP⁺/NADPH e interferindo na função mitocondrial. NPs further interferem com a expressão de genes relacionados a estresse oxidativo, como soxS, soxR, oxyR e ahpC; genes antioxidantes, como sod1 e gpx 1; e gene relacionado à produção de NADPH met9. A instabilidade na expressão de genes oxidativos e antioxidantes causada por NPs acelera o acúmulo intracelular de ROS.

Curiosamente, aumento da produção de ROS foi fortemente associado a tamanhos e formas particulares de NPs. Por exemplo, NPs de TiO₂ contribuíram para geração intracelular de ROS, que levou a danos em ácidos nucleicos e proteínas. Liao et al. descobriram que NPs de TiO₂ de 10 nm tiveram maior genotoxicidade que outros tamanhos testados e portanto poderiam induzir mais geração de ROS. Em outro caso, NPs de Se promoveram produção de ROS em células, e o rendimento de ROS intracelular foi altamente associado com o diâmetro de NPs de Se. Neste caso, diâmetro de 81 nm induziu mais produção de ROS que outros tamanhos testados. Cho et al. further mostraram que a forma de NPs afetou fortemente sua capacidade de induzir produção de ROS. Nanopartículas metálicas mimetizando flor diurna (D-NP) levaram a produção significativamente maior de ROS que nanopartículas metálicas mimetizando flor noturna (N-NP), resultando em efeito de matar células aumentado (Fig. 1).

NPs podem induzir surtos intracelulares de ROS em concentração muito baixa (mostrado na Tabela 1), por exemplo, Nano-C60 a 1 μg/mL pode aumentar significativamente apoptose celular induzindo estresse oxidativo. Notavelmente, a maioria das NPs tem efeito dependente de dose, como relatado para NPs de VO₂ e NPs de CuO.

Consequências Catastróficas de NPs em Células pelo Aumento da Produção de ROS

NPs que entram na célula frequentemente têm efeitos adversos sobre ela. A explicação mais apoiada para a citotoxicidade de NPs é que estresse oxidativo é induzido por surto de ROS. Surtos de ROS causados por NPs resultaram em modificação oxidativa de biomacromoléculas, danos a estruturas celulares, desenvolvimento de resistência a fármacos, mutação gênica e carcinogênese. Além disso, surtos de ROS alteraram as funções fisiológicas normais de células, como no caso de desencadear inflamação, que ultimately bloqueia funções celulares e danifica o organismo. Geralmente, NPs são primeiro adsorvidas na superfície celular, e então passam através da membrana para a célula, onde induzem geração de ROS. Devido ao seu forte potencial oxidativo, ROS é altamente estressante para a célula e ataca quase todos os tipos de biomoléculas na célula, incluindo carboidratos, ácidos nucleicos, ácidos graxos insaturados, proteínas e aminoácidos, e vitaminas (Fig. 2).

ROS Resulta em Peroxidação Lipídica e Dano à Estrutura da Membrana

Lipídios, especialmente ácidos graxos insaturados, são macromoléculas intracelulares importantes, que desempenham papéis chave na estrutura e funcionamento da membrana celular. NPs são fortemente atraídas à membrana celular, onde podem gerar ROS e levar a peroxidação lipídica da membrana externa. O conteúdo alterado de ácidos graxos da membrana celular pode resultar em permeabilidade celular aumentada, que resulta no transporte descontrolado de NPs do ambiente extracelular para o citoplasma, onde o dano celular pode progredir further.

NPs intracelulares induzem a próxima rodada de surtos de ROS. ROS sobrecarregados levam ao rompimento das membranas de organelas, vazamento do conteúdo das organelas, inativação de receptores celulares, liberação de lactato desidrogenase (LDH) e further dano celular irreversível.

ROS Ataca Proteínas e Resulta em Inativação Funcional

ROS ataca resíduos hidrofóbicos de aminoácidos, contribuindo para quebra de ligações peptídicas e interferindo com a função destas proteínas. Carbonilação é outra característica de proteínas submetidas a dano oxidativo. Proteínas carboniladas formam agregados que são quimicamente irreversíveis e não podem ser degradados via proteassomos, levando à perda permanente de função nestas proteínas. Gurunathan et al. mostraram que NPs de Pt poderiam aumentar geração de ROS e aumentar níveis de proteínas carboniladas, que inibiram proliferação de osteossarcoma e contribuíram para apoptose. Em um caso, nanopartículas derivadas de combustão e atrito (CFDNPs) acumularam no cérebro de jovens adultos com doença de Alzheimer, que provavelmente promoveram geração de ROS, resultando em dobramento incorreto, agregação e fibrilação de proteínas. Além disso, Pelgrift et al. mostraram que NPs de Mg podem inibir transcrição gênica ou danificar proteínas diretamente.

Mutação Gênica Induzida por ROS

Ácidos nucleicos, incluindo DNA e RNA, são essenciais para função, crescimento e desenvolvimento celular, e seus nucleotídeos componentes são alvos vulneráveis de ROS. Devido ao seu baixo potencial redox, ROS pode reagir diretamente com bases nitrogenadas e modificá-las. Por exemplo, ROS poderia oxidar guanina a 8-oxo-7,8 diidroguanina (8-oxoG) e adenina a 1,2-diidro-2-oxoadenina (2-oxoA). Estas modificações de base levam a dano no DNA. Devido ao seu potencial genotóxico e capacidade de induzir formação de ROS, NPs induzem significativamente quebras de fita simples e dupla de DNA, dano cromossômico e eventos genicos aneuploides.

A produção aumentada de ROS é a principal causa de erro de codificação gênica, aneuploidia, poliploidia e ativação de mutagênese em células expostas a NPs. Entre os pools de nucleotídeos, guanina é a mais vulnerável e é facilmente oxidada a 8-oxoG por ROS. O nível aumentado de 8-oxo-dG no DNA resulta em incompatibilidade de bases de DNA. Similarmente, a incorporação de A:8-oxoG causa taxa aumentada de mutações de transposição prejudiciais G:C > T:A. A razão de transposição G:C > T:A para mutação de transição G:C > A:T também tem sido usada como índice para quantificar dano oxidativo no DNA.

A geração de ROS induzida por NPs resultou no acúmulo de dano no DNA, que impulsiona o desenvolvimento de mutagenicidade, oncogênese, multirresistência a fármacos, envelhecimento e escape imune. Jin et al. mostraram que a superprodução de ROS aumentou dramaticamente mutagenese de genes reguladores transcricionais de ligação a DNA, que resultou em effluxo de antibiótico expedito, que por sua vez promove multirresistência a antibióticos de bactérias. Giannoni et al. relataram que mutações de DNA mitocondrial ocorreram com aumento de ROS intracelular e further danificaram atividade do complexo I de CTE e resultaram em disfunção mitocondrial.

Dano no DNA induzido por NPs demonstrou inibir síntese de aminoácidos, replicação e causar acúmulo aberrante de p53 e proteínas Rab51. Dano no DNA também pode atrasar ou prender completamente a célula. Células com DNA danificado perdem capacidade de crescimento e proliferação e podem eventualmente resultar em morte celular (Fig. 3).

Aumento da Produção de ROS Induz Dano Celular e Ocorrência de Doenças

Citotoxicidade de NP está associada a estresse oxidativo, produção endógena de ROS e depleção de pools antioxidantes intracelulares. O aumento do estresse oxidativo leva a dano oxidativo a biomacromoléculas, que further afeta o funcionamento normal da célula e contribui para ocorrência e desenvolvimento de várias doenças.

NPs induzem dano à membrana e aumentam o transporte de NPs para o citoplasma. NPs concentram-se em lisossomos, mitocôndrias e núcleo, que resultam em consequências catastróficas para a célula. Foi relatado que NPs podem reduzir geração de trifosfato de adenosina (ATP), depletar glutationa, induzir mistradução de proteínas, romper lisossomos e inibir subunidade ribossomal de ligar RNA de transferência (tRNA). Estes eventos celulares indicam colapso do processo biológico fundamental na célula e levam a diminuição significativa na viabilidade celular. Singh e Scherz-Shouval et al. relataram que NPs poderiam perturbar funções citoesqueléticas induzindo geração de ROS e ativar processo de autofagia e apoptose em células.

NPs entram no corpo via diferentes rotas, por exemplo através da pele, pulmões ou trato intestinal (Fig. 4a) e podem ter uma ampla variedade de efeitos toxicologicos e induzir respostas biológicas como inflamação e respostas imunes. Em um caso, exposição de células a NPs de sílica causou macrófagos a secretar grandes quantidades de interleucina-1β (IL-1β), que ultimately resultou em morte celular. Gao e colegas relataram que inflamação pulmonar foi consideravelmente maior em camundongos após exposição a nanotubos de carbono, que poderiam ativar macrófagos alveolares e induzir forte resposta inflamatória. Em outro estudo, cobaias expostas a NPs de ZnO sofreram dano pulmonar, que leva a diminuição da capacidade pulmonar total e capacidade vital.

NPs de ZnO também induziram lesões graves na barreira epitelial alveolar e causaram inflamação nos pulmões humanos. Em outro caso, NPs absorvidos nos intestinos causaram inflamação e degradação da mucosa intestinal. Shubayev et al. notaram que NPs de Mg aumentaram migração de macrófagos para o sistema nervoso degradando barreiras hematoencefálica e hemato-nervosa de maneira dependente de MMP. Além disso, camundongos que inalaram nanotubos de carbono exibiram imunossupressão e resposta de anticorpos reprimida em células esplênicas ingênuas. Finalmente, NPs de Cd causaram diminuição severa na viabilidade de monócitos sanguíneos, ultimately resultando em imunodeficiência.

Além das patologias acima, o nível altamente variável de ROS foi identificado como causa principal do desenvolvimento de numerosas doenças humanas. Tretyakova e Liou et al. mostraram que DNA oxidado tende a formar conjugados DNA-proteína, que se acumulam no coração e cérebro e contribuem para ocorrência de câncer, doenças relacionadas ao envelhecimento e inflamação crônica. Andersen concluiu que diabetes, bem como doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, estavam altamente relacionadas ao desequilíbrio de ROS. Além disso, Pérez-Rosés et al. mostraram que ROS aumentado promoveu desenvolvimento de doenças de Alzheimer e Parkinson.

Foi further relatado que NPs promovem apoptose de células de câncer de mama e destroem tecidos malignos e patógenos promovendo geração de ROS. No entanto, ROS também foi encontrado para induzir proliferação de células normais e cancerígenas, estimulando mutações e iniciando carcinogênese em células normais e multirresistência em células cancerígenas. Handy et al. descobriram que peixes expostos a nanotubos de carbono exibiram granulomas em pulmões e tumores em fígados com tempos de exposição estendidos. Alguns NPs causaram falência de múltiplos órgãos, afetando principalmente coração, pulmão, rins e fígado. NPs de TiO₂ demonstraram promover peso corporal reduzido, lesões no baço, coagulação sanguínea no sistema respiratório, necrose e fibrose em células hepáticas, e incrassação septal alveolar. Em um estudo, NPs também preveniram diferenciação de células-tronco, que agravou dano orgânico. Pesquisas further também relataram que NPs diminuíram qualidade do esperma e que exposição de esperma a NPs de carbono influenciou sua capacidade de fertilizar ovos e prejudicou desenvolvimento de embriões em ouriços-do-mar roxos. Evidências crescentes mostram efeitos toxicologicos de NPs em microrganismos, algas, nematoides, plantas, animais e humanos especificamente (Fig. 4b).

O Novo Tipo de NPs com Menor ou Nenhuma Citotoxicidade

NPs possuem uma gama de propriedades biomédicas que as tornam valiosas (ex.: como agentes antibacterianos e anticancerígenos). Seu principal modo de ação é sua capacidade de aumentar produção de ROS em células; no entanto, esta propriedade também torna estas partículas tóxicas, causando mutação gênica, apoptose e até carcinogênese. Consequentemente, há necessidade urgente de desenvolver novas NPs que retenham suas propriedades necessárias sem levar a produção excessiva de ROS. Estudos recentes relataram novos tipos de NPs que poderiam remover ROS intracelular. Estes tipos se enquadram em duas classes: (1) NPs que podem sequestrar ROS e (2) NPs que são revestidas com materiais adicionais para diminuir sua citotoxicidade.

Panikkanvalappil e colegas mostraram que NPs de Pt inibem quebra de fita dupla de DNA degradando ROS. Em outro caso, NPs de Mn₃O₄ modularam redox celular resultando em proteção de biomacromoléculas contra estresse oxidativo. Além disso, NP de CeO₂ é um novo agente que protege células e tecidos contra dano oxidativo com sua capacidade de sequestrar radicais livres.

H₂O₂ é o principal subproduto de interações NP-célula. H₂O₂ destrói biomoléculas importantes incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. No entanto, quando células foram tratadas com NPs magnéticos especializados revestidos com ácido mercaptopropiônico (MPA-NPs) ou sílica aminada (SiO₂-MNPs), tal dano não foi observado. Similarmente, GO revestido com polivinilpirrolidona (PVP) tem menos efeitos tóxicos em células dendríticas (DCs), linfócitos T e macrófagos que sem este revestimento. PVP-GO demonstrou reduzir apoptose de linfócitos T e até aumentar atividade de macrófagos. AuNRs revestidos com Pt (PtAuNRs) retêm a eficácia de nanobastões de ouro tradicionais (AuNR) e podem desencadear morte celular de células desejadas enquanto sequestram ROS, protegendo assim células saudáveis, não tratadas, da morte indireta induzida por produção de ROS.

Conclusões e Perspectivas

NPs que possuem propriedades físico-químicas únicas (ex.: tamanho ultrapequeno, grande razão área superficial/massa e alta reatividade) as tornam altamente desejáveis em diferentes aplicações. NPs engenheiras para fins comerciais têm aumentado rapidamente. Por essa razão, a biossegurança de NPs ganhou mais atenção do público. Nesta revisão, resumimos os mecanismos responsáveis pela formação de ROS por NPs no nível celular, bem como avanços recentes de toxicidade de NP relacionada a ROS no campo biomédico e destacamos o campo emergente de NPs amigáveis às células. A geração de ROS induzida por NPs associada ao seu tamanho, morfologia, área superficial e componente. Além disso, ROS tem multifuncionalidade biológica em biologia celular e biomedicina, bem como mediador chave de sinalização celular, incluindo apoptose celular, viabilidade e diferenciação.

No entanto, para melhorar a biossegurança de NPs e acelerar seu uso no campo biomédico, alguns gargalos precisam ser superados e muito trabalho ainda é necessário. Primeiro, espera-se que métodos de alto rendimento (HTMs) sejam projetados para detectar eficientemente a biotoxicidade de NPs in vitro e in vivo. HTMs poderiam economizar tempo e recursos, combinar múltiplos parâmetros em um único sistema e minimizar erros metodológicos ou sistemáticos. Também ofereceria compreensão profunda da relação entre propriedades de NPs e respostas celulares, que poderia nos ajudar a identificar a condição ideal.

Segundo, os mecanismos moleculares e celulares relacionados à biotoxicidade de ROS induzida por NP ainda não estão claros. Há demanda para further explorar mecanismos associados à formação de ROS por NPs, que forneceria mais informações para modificar características físico-químicas de NPs para controlar geração de ROS. Isso poderia ajudar pesquisadores a desenvolver novas estratégias para reduzir perigos de NPs engenheiras para acelerar sua tradução clínica e comercial no campo biomédico.

Finalmente, devido às suas características estruturais, NPs podem entrar no corpo livremente via múltiplas rotas, e o acúmulo de NPs no corpo pode induzir inflamação e respostas imunes, que resultam em lesão ou morte celular, disfunção orgânica e ultimately estimulam ocorrência de numerosas doenças, como Alzheimer, Parkinson, inflamação hepática e disembrioplasia. Estas questões tornaram-se mais prementes com o uso generalizado de NPs.