Oxidação e nanodispersão das fibras naturais de seda

Resumo

Bombyx mori natural seda (BS) e Antheraea pernyi seda (AS) foram oxidadas em soluções de hipoclorito de sódio (NaClO). Posteriormente, nanofibras de seda individuais (SNs) foram obtidas após a sonicação das pastas de seda oxidadas, onde os diâmetros dos SNs resultantes eram ~ 100 nm e vários micrômetros de comprimento. As membranas finas foram formadas fundindo os SNs, que tinham opticamente transparentes (acima de 75% de transmissão), mecanicamente robustas (~ 4,5 GPa do módulo de Young) e propriedades de umedecimento aprimoradas. Um processo interessante de agregação-dispersão (redispersão) usando esses SNs foi fortemente regulado pelo ajuste dos valores de pH. Consequentemente, os SNs carregados negativamente poderiam ser concentrados até ~ 20% em peso (100 vezes o da dispersão inicial) e ofereceram benefícios extraordinários para armazenamento, transporte e aplicações de engenharia.

Introdução

Materiais com estruturas hierárquicas são onipresentes nos sistemas biológicos naturais [1, 2]. Eles fornecem uma diversidade de funções devido às propriedades primárias dos polímeros e à adaptação funcional das estruturas em cada hierarquia [3,4,5]. Para projetar materiais artificiais com funções aprimoradas que reproduzem tais propriedades especiais, processos de extração que retêm as nanoestruturas originais dos polímeros têm sido desejados [6,7,8,9,10]. Uma variedade de estudos foram dedicados ao isolamento de nanofibras de polissacarídeo (por exemplo, celulose e quitina) de suas estruturas compostas de fibra usando abordagens químicas, físicas e biológicas [11,12,13]. Em particular, nanofibras completamente individualizadas e altamente cristalinas foram obtidas empregando-se a oxidação mediada por radical 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPO) de celulose / quitina nativa, seguida por tratamento mecânico suave [14, 15 ] No entanto, as questões econômicas e ambientais ainda permanecem; essas técnicas existentes para isolamento de nanofibrilas requerem reagentes caros e / ou tóxicos, como TEMPO e hexafluoroisopropanol (HFIP). Mais importante ainda, a baixa concentração de dispersão de nanofibras resultante limitou seu armazenamento, transporte e aplicações.

Sedas de animais fiadas por uma ampla gama de insetos e aranhas também possuem estruturas fibrosas hierárquicas [16, 17]. Essas moléculas de proteína estão na forma de fibrilas montadas da nanoescala à macroescala, resultando em excelentes propriedades mecânicas e bioquímicas nos materiais de seda [18,19,20,21]. Para alcançar nanoestruturas de seda, no entanto, os processos de extração permanecem desafios devido (i) à estrutura hierárquica complexa, (ii) alta cristalinidade e (iii) a adesão entre micro- / nano-fibrilas de fibras de seda. O tratamento ultrassônico foi aplicado para dividir as fibras de seda [22]; no entanto, as nanofibras resultantes estavam entrelaçadas e não tinham capacidade de processamento. A dissolução parcial das fibras de seda usando o sistema sal-ácido fórmico apresentou feixes de nanofibras tipo árvore instáveis [23]. Uma abordagem integrada usando dissolução parcial e ultra-som resultou em fibras de seda que foram reduzidas ao diâmetro de uma única nanofibrila [24], enquanto a proporção de aspecto e rendimento de tais nanofibras ainda precisam ser melhorados.

Para resolver esses problemas, elaboramos uma estratégia fácil e escalonável para extrair mesosilks em tamanho real [25]. Semelhante ao isolamento de polissacarídeos [26], grupos carboxila foram introduzidos em Bombyx mori seda (BS) e Antheraea pernyi fibras de seda (AS) para dispersão de nanofibras por repulsão eletrostática; no entanto, os produtos químicos redundantes, como TEMPO e brometo de sódio (NaBr), foram excluídos porque a oxidação seletiva era desnecessária. Aqui, nós divulgamos a eficácia deste processo para produzir nanofibras individuais com altas razões de aspecto. Propriedades umectantes opticamente transparentes, mecanicamente robustas e aprimoradas foram obtidas nas membranas de nanofibra de seda (SN) resultantes. Em comparação com as nanofibras à base de polissacarídeos (isto é, nanofibras de celulose e quitina), propriedades de redispersão-agregação interessantes dos SNs foram reguladas por valores de pH.

Materiais e métodos

Oxidação das fibras de seda desmontadas

As fibras de seda desmontadas foram preparadas com Bombyx mori cru (ou Antheraea pernyi ) fibras de bicho da seda (Xiehe Silk Co., China). Resumidamente, 5 g das fibras de seda foram fervidos por 30 min em uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,02 M com uma proporção de peso de 1:400, seguido por lavagem completa em água destilada e, em seguida, secagem ao ar. Em seguida, as fibras de seda degomadas foram imersas em solução de ácido fórmico (88% em peso) com uma proporção de peso de 1:20. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h e depois homogeneizada a 10.000 r / min durante 3 min para obter uma suspensão. As fibras de seda desmontadas foram obtidas no estado sólido após centrifugação da suspensão a 8000 r / min.

Para a oxidação, as fibras de seda desmontadas foram lavadas a pH 7 e cortadas em pedaços curtos de vários centímetros de comprimento, e uma quantidade desejada de solução de hipoclorito de sódio (NaClO) foi adicionada a 100 ml de água com 1 g das fibras de seda desmontadas. Hidróxido de sódio (NaOH) foi adicionado continuamente à mistura para manter o pH em 10. Quando o consumo de NaOH não foi mais observado, a reação foi extinta pela adição de gotas de ácido clorídrico 0,5 M (HCl) para ajustar o pH a 7. Em seguida, a fração insolúvel em água foi centrifugada a 10000 r / min e lavada várias vezes. Finalmente, nanofibras de seda foram obtidas após o tratamento da fração insolúvel em água com um homogeneizador ultrassônico a 19,5 kHz com potência de saída de 300 W por 20 min. Empregou-se um banho de água gelada para evitar o superaquecimento durante o longo tempo de ultrassom.

Análise de difração de raios-X das fibras de seda oxidadas

Os experimentos de difração de raios-X (XRD) foram realizados usando um sistema de difração de raios-X multifuncional Ultima IV (Ultima IV, Rigaku, Japão) com uma fonte de Cu-Kα ( λ =0,1542 nm). A tensão e a corrente da fonte de raios X eram 40 kV e 30 mA, respectivamente. Os resultados da deconvolução das fibras de seda oxidadas foram analisados usando o software PeakFit (4.0). Os números e posições dos picos foram definidos a partir dos resultados das segundas derivadas dos espectros e fixados durante o processo de deconvolução. A largura de banda foi ajustada automaticamente pelo software.

Observações morfológicas das nanofibras

Para observar a formação das várias nanofibras, a dispersão foi diluída para 0,01% em peso. Para a microscopia eletrônica de varredura, uma alíquota de 10 μL da dispersão diluída foi colocada em um wafer de silício e, em seguida, seca ao ar. As amostras foram revestidas com ouro e paládio e fotografadas usando um JEOL-JSM 7600F (JEOL, Japão) SEM a uma tensão de 5 kV. Para a microscopia eletrônica de transmissão (TEM), uma alíquota de 10 μL da dispersão diluída foi colocada em uma grade de microscopia eletrônica de Cu revestida com carbono. O excesso de líquido foi absorvido por papel de filtro e depois seco ao ar. A grade de amostra foi observada a 80 kV usando um microscópio eletrônico de transmissão Titan 80-300 (FEI, EUA). Os tamanhos das nanofibrilas foram analisados com o software ImageJ (1,48) desenvolvido no National Institutes of Health nos EUA.

Teste mecânico

As membranas BS, AS, CN (nanofibra de celulose) e ChN (nanofibra de quitina) com uma espessura de aproximadamente 50 μm foram moldadas usando um método de evaporação de solvente. Cada membrana de nanofibra foi adaptada em várias tiras com comprimentos de 60–80 mm e diâmetros de 5 mm, e foram esticadas por uma máquina de teste universal eletrônico (AG-Xplus, SHIMADZU, Japão) para determinar suas propriedades mecânicas. Nesse teste, o intervalo inicial das fixações foi de 20 mm e a velocidade de alongamento foi de 1 mm / min.

Propriedades ópticas e umectantes

As transmitâncias de luz das várias membranas com uma espessura de 25 μm foram determinadas de 350 a 800 nm usando um espectrômetro Ultrospec 2100 pro da Amersham Biosciences.

Um medidor de queda (Kyowa Interface Science Co., Ltd.) foi empregado para as medições do ângulo de contato. As análises de imagem foram realizadas automaticamente a partir das formas de gotículas de água destilada de 4 μL que caíram nas membranas em ~ 0,5 s.

Resultados e discussão

Oxidação e isolamento de nanofibras de seda

A Figura 1a apresenta a estratégia para isolar nanofibras de materiais de fibra de seda. Primeiro, empregamos um processo de pré-tratamento para desmontar essas fibras de seda por tratamento com ácido fórmico (nenhuma reação química ocorreu entre os grupos aminoácido ou hidroxila com ácido fórmico, como mostrado em espectros Raman no arquivo adicional 1:Fig. S1 e a discussão relevante de adicional Arquivo). Este pré-tratamento desmontou as fibras de seda em estruturas de microfibra com larguras de 5–20 μm (Fig. 1a). Em seguida, hipoclorito de sódio (NaClO) foi empregado para oxidar / dissolver parcialmente (degradar) as fibras de seda desmontadas. Hidróxido de sódio (NaOH) foi adicionado continuamente à mistura para manter o pH a 10, de acordo com as condições para a oxidação de polissacarídeos mediada por TEMPO (2, 2, 6, 6-tetrametilpiperidina-1-oxi-radical) usando TEMPO / NaClO / NaBr, enquanto, neste caso, o TEMPO e o NaBr não eram mais necessários para a oxidação das fibras de seda devido aos aminoácidos reativos limitados nas sequências de fibroína de seda. As fibras de seda iniciais tinham uma concentração de carboxila de ~ 0,3 mM / g de proteína, que foi atribuída aos ácidos aspártico e glutâmico na sequência molecular [27]. Posteriormente, o conteúdo de carboxil da seda oxidada aumentou aproximadamente linearmente após a adição de NaClO, devido à oxidação de grupos hidroximetil nos resíduos de serina. Quando a adição de NaClO atingiu 20 mM / g de proteína, a concentração final de carboxil da seda oxidada foi de 0,889 e 1,013 mM / g de proteína para BS e AS, respectivamente (Fig. 1b, c). No entanto, quantidades excessivas de NaClO podem ter degradado as fibras de seda [28]. Por exemplo, a fração insolúvel em água de BS e AS foi 58,52 e 69,30% em peso, respectivamente, na adição de NaClO de 20 mM / g de proteína. A perda de peso da fração insolúvel em água após a oxidação sugeriu que a adição de NaClO de ≤ 10 mM / g de proteína foi aceitável (mais de 75% da proteína permaneceu), no que diz respeito à degradação limitada durante a oxidação. Portanto, empregamos 10 mM de NaClO por grama de proteína para oxidar fibras BS e AS, onde o conteúdo de carboxilato é de 0,724 e 0,837 mg / g de proteína para BS e AS, respectivamente.

Diagrama do processo de SNs e conteúdo de carboxil de BS e AS. a Esquema de oxidação e dispersão de fibra de seda em nanofibras de seda (SNs). b O conteúdo de grupos carboxila e peso remanescente da fração insolúvel em água após a oxidação de Bombyx mori (BS) correspondente à adição de hipoclorito de sódio (NaClO). O teor de carboxil aumentou de 0,293 para 0,889 mM / g BS (adição de NaClO foi de 20 mM / g de proteína) com 58,52% em peso de proteína remanescente. c Para Antheraea pernyi seda (AS). O teor de carboxil aumentou de 0,347 para 1,013 mM / g AS (adição de NaClO foi de 20 mM / g de proteína) com 69,30% em peso de proteína restante

Finalmente, as nanofibras foram obtidas após o tratamento da fração insolúvel em água com um homogeneizador ultrassônico (Fig. 2). As observações de microscopia eletrônica de varredura revelaram que a oxidação afrouxou a seda no micronível, formando fibras com diâmetros de vários mícrons, e o tratamento de sonicação os dispersou ainda mais em nanofibras com diâmetro de 105 ± 27 nm (Fig. 2c). Em comparação com outros processos [24], que esfoliam principalmente a camada superficial das fibras de seda, um rendimento final de ~ 50% com base nas sedas oxidadas foi obtido para as nanofibras devido às forças repulsivas eletrostáticas nas sedas oxidadas. Uma estratégia semelhante também foi aplicada às fibras AS. O diâmetro das nanofibras AS resultantes foi 112 ± 33 nm, e o comprimento do contorno foi superior a 1 μm (Fig. 2f).

Observação representativa de SEM das fibras de seda resultantes em cada processo. a Fibras BS desmontadas após pré-tratamento com ácido fórmico, b fibras BS oxidadas e c as nanofibras BS com um diâmetro de 105 ± 27 nm. d Fibras AS desmontadas após o pré-tratamento com ácido fórmico, e fibras AS oxidadas e f as nanofibras de AS com um diâmetro de 112 ± 33 nm. O comprimento do contorno das nanofibras BS e AS é superior a 1 μm

A Cristalinidade das Fibras de Seda

As moléculas de proteína de seda atuaram como polímeros hidrofílicos-hidrofóbicos-hidrofílicos, que se dobraram em micelas de tamanho irregular durante a formação de grânulos hidrofílicos (regiões amorfas) estendendo-se a partir de núcleos hidrofóbicos (regiões cristalinas) [17]. Os SNs foram montados devido à adesão das regiões externas entre as micelas. Porém, sugere-se que a oxidação de NaClO das fibras de seda propôs uma fraca adesão entre suas nanoestruturas [25]. Conforme mostrado nas Fig. 3a eb, após a oxidação, os padrões de difração de raios X (XRD) das fibras BS oxidadas eram semelhantes ao seu padrão original, assim como os padrões de XRD das fibras AS oxidadas. Assim, as fibras de seda oxidadas permaneceram seu nano-bloco de construção natural, isto é, estruturas de folha β em fibras de seda. Por outro lado, a deconvolução desses padrões de XRD (Fig. 3c, d) sugeriu uma mudança significativa de cristalinidade nas fibras BS e AS após a oxidação, onde os detalhes foram listados na Tabela 1. Embora a oxidação tenha ocorrido principalmente nos resíduos de serina da proteína da seda, havia vários grupos amino nas regiões amorfas que poderiam ser atacados por NaClO [29]. Portanto, é compreensível que a cristalinidade das fibras BS oxidadas na Tabela 1 tenha aumentado de 24,8% (BS desmontada) para 41,3% (com adição de 10 mM / g de proteína NaClO), seguida de aumento no teor de carboxila. Uma tendência semelhante também foi apresentada no caso das fibras AS oxidadas, onde a cristalinidade dessas fibras AS aumentou de 22,9 para 39,2%. Os resultados sugerem que, além das forças de repulsão eletrostática, a destruição de regiões amorfas nas proteínas da seda também foi um fator importante na dispersão dos SNs. A cristalinidade das fibras de seda oxidadas (BS e AS) foi seguida pelo aumento do conteúdo de carboxila quando a adição de NaClO foi <10 mM / g de proteína. A degradação das regiões amorfas é anterior aos núcleos cristalizados da proteína da seda. No entanto, quantidades excessivas de NaClO (20 mM / g de proteína) podem degradar a seda. Este fenômeno está de acordo com os resultados que revelamos nas Fig. 1b e c.

Análise de XRD das fibras de seda oxidadas. Padrão de difração de raios-X (XRD) de a BS e b AS que oxidou com várias adições de NaClO. Deconvolução representativa e resultados de c BS e d Materiais AS

O desempenho das nanofibras de seda

As morfologias das nanofibras BS e AS oxidadas que foram obtidas por ultrassonicação de fibras de seda oxidadas com NaClO 10 mM são mostradas na Fig. 4a e b. As nanofibras BS e AS têm uma relação de aspecto semelhante (calculada pelo software ImageJ), onde 16,92 para nanofibras BS em média e 19,12 para nanofibras AS, respectivamente. Em comparação, as nanofibras de celulose (CNs) e as nanofibras de quitina (ChNs) preparadas usando oxidação mediada por TEMPO são mostradas nas Figs. 4c e d. Para caracterizar ainda mais esses SNs, membranas de aproximadamente 50 μm de espessura foram moldadas usando um método de evaporação de solvente. As membranas de seda opticamente transparentes (acima de 75% de transmissão) foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis (de 350 a 800 nm) (Fig. 4e).

Teste de morfologia e propriedades de SNs, CNs e ChNs. Observação por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da resultante a BS e b Nanofibras de AS que oxidam pela adição de NaClO 10 mM / g de proteína, c nanofibras de celulose (CNs) e d nanofibras de quitina (ChNs) obtidas por oxidação mediada por TEMPO. A barra de escala é de 500 nm. e Transmitância de UV-Vis de membranas de aproximadamente 50 μm de espessura que são moldadas por nanofibras de BS, AS, celulose (CN) e quitina (ChN). f Curvas de tensão-deformação representativas de membranas de aproximadamente 50 μm de espessura fundidas por nanofibras BS, AS, CN e ChN. g Módulo de Young de membranas que são fundidas a partir de nanofibras BS, AS, CN e ChN. Os dados representam o SD médio ( n =5). h - k O ângulo de contato com a água da membrana fundida por f As nanofibras BS foram 58,8 ± 1,5 °, significativamente reduzidas em relação à membrana BS regenerada (71,0 ± 0,3 °, a imagem inserida). 55,7 ± 0,5, 40,3 ± 1,1 e 52,5 ± 0,6 ° do ângulo de contato da água foi apresentado na membrana AS, CN e ChN, respectivamente

As nanofibras obtidas a partir deste método de redução do tamanho mantiveram uma estrutura altamente cristalina e alta proporção de aspecto. Como resultado, essas membranas apresentaram propriedades mecânicas robustas (Fig. 4g) com módulos de Young de 4,51 ± 0,71 e 4,43 ± 0,23 GPa para BS e AS, respectivamente, que eram comparáveis às das membranas CN e ChN (a cepa representativa e curvas de tensão são fornecidas na Fig. 4f). Além disso, as propriedades de umedecimento da membrana BS foram significativamente melhoradas na membrana regenerada devido à introdução de grupos carboxila. Conforme mostrado na Fig. 4h, o ângulo de contato com a água da membrana de fundição de nanofibras BS é 58,8 ± 1,5 °, enquanto a membrana BS regenerada (a imagem inserida na Fig. 4h) é 71,0 ± 0,3 °. Além disso, 55,7 ± 0,5, 40,3 ± 1,1 e 52,5 ± 0,6 ° de ângulo de contato com a água foram apresentados nas membranas AS (Fig. 4i), CN (Fig. 4j) e ChN (Fig. 4k), respectivamente.

Tanto o CN quanto o ChN e os dispositivos de seda têm sido amplamente aplicados na ciência dos materiais por décadas [13, 30, 31], devido à sua robustez mecanicamente semelhante, plasticidade de processamento e propriedades bioquímicas, etc. Claro, diferenças intrínsecas existem nestes polissacarídeos e materiais à base de proteínas. Portanto, nos perguntamos como suas diferenças regulam a formação de nanofibras. As dispersões de BS e AS adequadamente dispersas tinham um potencial zeta de - 39,5 ± 0,66 e - 37,4 ± 2,4 mV, respectivamente, em condições neutras. As repulsões eletrostáticas entre grupos carboxila são contra a adesão entre interfaces de micro / nano-fibrila de seda; assim, essas nanofibras se dispersaram em fase aquosa de maneira homogênea. Curiosamente, quando o pH diminuiu, o H ⁺ protegeu as superfícies carregadas negativamente que levam à agregação das nanofibras, como mostrado na Fig. 5a e b. Os agregados dos SNs podem ser redispersos em água, ajustando o pH> 7, ou podem ser facilmente coletados após a centrifugação e, em seguida, redispersos com leve agitação. Os gráficos inferiores da Fig. 5 mostram o peso restante dos agregados SN coletados em diferentes condições de pH. Para a BS, 80,1 ± 1,7 e 90,9 ± 2,2% em peso (85,7 ± 2,2 e 93,6 ± 1,5% em peso para AS) dos agregados foram recuperados em pH 5 e 3, respectivamente. Enquanto isso, este processo concentrou os SNs em aproximadamente 100 vezes (~ 20% em peso) em comparação com a dispersão inicial, com uma concentração de ~ 0,2% em peso. Esta propriedade fascinante dos SNs foi atribuída (i) à resposta intrínseca do pH dos materiais à base de proteínas e (ii) à flexibilidade dos SNs da matéria mole durante os processos de agregação e redispersão. O fenômeno de agregação-redispersão sugeriu uma aplicação promissora desses SNs como carreadores de carga e liberação de fármacos. Além disso, não houve disputa de que os SNs resultantes são bem apropriados para armazenamento e transporte.

Processo de redispersão de SNs. Fotografia do fenômeno de resposta do pH para a BS e b Nanofibras de AS. Mais de 80% em peso das proteínas (BS e AS) permaneceram após a centrifugação, com o teor de proteína de ~ 20% em peso

Conclusões

Em resumo, nanofibras BS e AS dispersas individuais foram obtidas após a oxidação de NaClO. A abordagem foi semelhante à oxidação de polissacarídeos mediada por TEMPO para preparar nanofibras; no entanto, os catalisadores TEMPO / NaBr não foram necessários. Os SNs preparados foram ~ 110 nm de diâmetro e vários mícrons de comprimento, com superfícies carregadas negativamente. Propriedades umectantes opticamente transparentes, mecanicamente robustas e aprimoradas foram obtidas nas membranas SN. Em particular, os SNs poderiam ser concentrados em ~ 20% em peso, diminuindo o pH, e esses SNs semelhantes a polpa eram redispersíveis em soluções aquosas neutras. Com base nesses resultados, os SNs são excelentes candidatos para aplicações em ciência de materiais e biomédicas.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

AS:: Antheraea pernyi seda
BS:: Bombyx mori seda
ChN:: Nanofibra de quitina
CN:: Nanofibra de celulose
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
SN:: Nanofibra de seda
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
XRD:: Difração de raios X

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